Name: tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00
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1.ティック膜チャンバーの準備
<ol><li>アームスタンドのガラス面やセラミックコーティングされた金属ベースなどの平らな非多孔質の表面を70%エタノールで拭き取って準備し、次にラップの単層で覆い、ラップが平らで気泡やしわがないことを確認します( 図1Aを参照)。</li>
	<li>準備した面に100%レーヨンレンズのクリーニングペーパーをテープで留めます?...

<ol>
	<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs:+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories,+2004-2016.">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li><li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+(Rhipicephalus+microplus)+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer.">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 188 (2014).</li><li>S&#252;ss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+ticks+tick?+Climate+change,+ticks,+and+tick-borne+diseases.">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li><li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Pe&#241;a, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe.">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. , (1991).</li><li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding.">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li><li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice.">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li><li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system.">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).</li><li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory.">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li><li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers.">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li><li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system.">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li><li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen.">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li><li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+(Canestrini,+1887)+(Ixodidae:+Acarina)+on+the+embyonated+hen+egg.">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li><li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature,+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+(Canestrini)+larvae+to+skin+slices.">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks.">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li><li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro.">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+(Ixodida:+Ixodidae).">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+by+membrane+feeding.">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae).">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li><li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time.">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li><li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis.">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li><li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States,+2013-2019.">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li><li>Gonz&#225;lez, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks.">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li><li>Kr&#243;l, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding.">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).</li><li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+ticks.">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li></ol>

ダニの人工膜給餌は、様々な実験手順に有用なツールを提供するが、すべての用途において動物給餌に取って代わる可能性は低い。動物の餌を与えずにすべてのライフステージでダニの大きなコロニーを維持することは、一般的に受け入れられません。代わりに、人工給餌システムは、モデル宿主によってサポートされていない病原体でダニを感染させる、単純化された給餌環境で化合物ま?...

ダニ媒介性疾患は、世界中の人間と動物の健康に強く影響し、2004年から2016年までの米国におけるすべてのベクター関連疾患の3分の2以上を占めています1。さらに、近年、症例数が増加しており、より多くの人々と家畜がダニとそれに関連する病気の影響を受けています2,3。症例数の増加傾向には多くの原因がある可能性がありますが、気候の変化は重要な要素です3,4。ダニ媒介性疾患の症例数の予測される継続的な増加は、ダニとそれらが伝染する病原体との関係を調査するための新しいツールを開発する必要性を強調しています。
マダニは摂食中に生理学と遺伝子発現の変化を受け、これらの変化が病原体の伝染に役割を果たすことが知られています5,6。特にげっ歯類モデルが特定の病原体による感染を受けにくい状況では、動物モデルを使用して病原体の伝播と獲得に対する完全および部分的な摂食の影響を調べる研究を実施することは難しい場合があります。たとえば、アナプラズマ食細胞菌バリアント-1株は、肩甲骨とシカの間で自然に伝染しますが、マウスに感染することができず、実験室でのダニ感染を複雑にします7。人工栄養システムは、感染または感染を阻害する遺伝子欠失を有するトランスジェニック変異体の使用を介して、ボレリア・ブルグドルフェリなどの病原体の研究を支援するために適用することもできます8。人工栄養システムを使用すると、研究者は感染または伝播がダニの側でのみ発生するようにすることで遺伝子の役割を分離し、それによってそのような研究を混乱させる可能性のある宿主の反応を分離するのに役立ちます。
同様に、病気や動物の伝染に関与するダニのいくつかのライフステージは、一般的な実験室モデル種を食べるように誘導されない可能性があります。たとえば、 Ixodes scapularis の雌は、より大きな動物、通常はウサギ9に餌を与えなければなりません。実験室での実験に利用できることがよくありますが、ウサギを使用するための管理上および飼育上の要件は、小さなげっ歯類の要件を超えており、一部の実験室では禁止されている場合があります。他のダニ種、特に獣医学が懸念される種は、ほとんどの実験室で使用するのが実用的ではない牛または他の大型動物に餌を与えなければなりません。人工膜給餌などの in vitro 給餌および感染方法は、大型またはエキゾチックな宿主動物を使用する代わりになります。
さらに、人工給餌システムを使用することで、従来の動物給餌方法では不可能な特定の分析が可能になります。そのような例の1つは、血液源を摂食機構から分離することにより、異なる宿主の血液がB.ブルグドルフェリの伝達に果たす可能性のある役割の調査が可能になることです10。宿主の血液と宿主の免疫応答がない場合に血液自体が果たす役割のこの検査は、病原体の伝播サイクルを理解するための重要な要素であり、人工栄養システムが答えるのに役立つものです11。また、宿主における伝播の成功および確立を単に調べるのではなく、飼料中の病原体の正確な伝播数を定量化することも可能になる8,12。
硬いダニのために作られた最初の人工給餌膜のいくつかは、1950年代と1960年代に動物の皮または動物由来の膜から作られました13,14。これらの膜の生物学的性質のために、新しい膜の製造と貯蔵寿命の両方に問題がありました。1990年代には、シリコーン含浸を施した網、紙、または布の裏地を利用した完全人工膜が開発されました15,16。シリコーンは、その物理的特性が皮膚の伸縮性とわずかな粘着性を模倣し、その生体固有の性質を備えているため、理想的でした。これに基づいて、この技術が基づいていたKroberとGuerinは、I. ricinus17の人工給餌のためのシリコーン含浸レーヨン膜供給技術について説明しました。
近縁種であるI. scapularisの方法の改良により、膜含浸に使用されるシリコーンの硬度、膜製造のレシピ、チャンバーの寸法、および付着刺激剤に顕著な違いがもたらされました。この研究で報告された改良は、I. scapularisで使用するためにKroberとGuerinに基づくシリコーンベースの膜を開発したAndradeらによって報告されたものと同様の膜特性をもたらしましたが、シリコーン含浸ステップに違いがあり、I. scapularisの未熟なライフステージにこのプロトコルを利用する柔軟性を可能にします15、18.この調査では、この方法の繰り返し使用に基づく追加と技術的な変更、フィードを成功させるためのベスト プラクティス、および発生する可能性のある問題のトラブルシューティングについても説明します。この方法は、すべての活動的なライフステージに栄養を与え、ダニに病原菌を感染させ、ダニを抗生物質の複数投与量にさらすために使用されてきました19,20。示されている人工膜供給法は肩甲骨多角形菌用ですが、この方法は膜の厚さをわずかに変更するだけで他の種のダニにも容易に適応できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>00-10 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-10</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>00-50 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-50</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Mold Star 30</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1852-1VL</td>
			<td>Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DBB500</td>
			<td>Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clingwrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-790-2C</td>
			<td>Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2871</td>
			<td>Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>139386-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td>100% rayon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin &#160;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-750-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S37440&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 &#181;g/mL of streptomycin, and 25 &#181;g/mL of Amphotericin B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagostimulant</td>
			<td>Made in House</td>
			<td></td>
			<td>Collected from prior tick feeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8585K204&#160;</td>
			<td>Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber O-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K38&#160;</td>
			<td>5 mm thick, 1.25 inch inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft touch forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470315-238&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unryu paper&#160;</td>
			<td>Art supply stores</td>
			<td></td>
			<td>mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis

ダニとそれに関連する病気は、公衆衛生と獣医の負担のために重要な研究トピックです。ただし、研究と飼育の両方におけるダニの摂食要件は、実験的な質問や、ダニとそれに関連する病原体を研究するラボの能力を制限する可能性があります。人工膜給餌システムは、これらの問題を軽減し、従来の動物給餌システムでは不可能だったかもしれない新しい研究の道を開くことができます。この研究では、すべての Ixodes scapularis ライフステージの給餌と充血の成功のために改良された人工膜給餌システムについて説明します。さらに、この研究で説明した人工膜供給システムは、所望の膜厚さの単純な改良を通じて、他のダニ種で使用するように変更することができる。人工膜供給システムの利点は、システムの労働集約性、給餌の成功に影響を与える可能性のある追加の環境要因、およびダニの新種とライフステージごとに技術を洗練する必要性によって相殺されます。

給餌の成功は、部分的または完全な充血が望まれるかどうかによって異なります。正常に給餌されたI.肩甲骨は、成虫の場合はガンメタルグレーの色合いに変わり、膜から自然に剥離します。しかしながら、それらが少なくともエンドウ豆サイズであるならば、それらは給餌を終えるときに膜から剥離され得る。I. scapularisの未熟な段階では、完全に充血したダニのサイズはさま?...

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Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

ここに提示されるのは、様々なダニの生活段階の部分的または完全な充血を可能にするために、人工膜システム を介してインビトロで ダニを血液供給する方法である。

肩甲骨イクソデスのためのダニ人工膜給餌

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

人工膜給餌は以前にも行われていましたが、私たちのプロトコルはセットアップが簡単で、いくつかの変更を加えることで他のダニ種に適応できます。人工膜給餌の主な利点は、動物の給餌では実行できない可能性のある病原体や治療への曝露を可能にすることです。この人工膜供給システムは、理想的な食刺激剤のテストと理想的な膜の厚さの変更により、他の節足動物種に適用できます。正しい膜の厚さを作り出すには、ある程度の練習が必要です。必ずマイクロメーターを使用して、メンブレン上のいくつかの場所で厚さを測定してください。私たちの研究室のポスドクであるベンジャミン・カルは、私が手順を実証するのを手伝ってくれます。まず、アームスタンドのガラス板やセラミックコーティングされた金属ベースなどの平らで非多孔質の表面を70%エタノールで拭き取り、次に単層のラップで覆います。ラップが平らで、泡やしわがないことを確認してください。準備した面に100%レーヨンレンズクリーニングペーパーをテープで留めます。用紙の4面すべてにテープで平らで少しぴんと張っていることを確認します。0010硬度のシリコーン混合物を、シリコーンキットの各部分の5ミリリットルを使い捨て容器に測定して調製します。2つの液体を軽く混合し、1.5ミリリットルのヘキサンを加えます。混合物が均質になり、完全に混合されるまで混合を続けます。小さなスキージを使用してシリコンミックスをレンズペーパーに分散させ、1分間放置して、シリコンがレンズペーパーに染み込んでいることを確認します。着実に、少量の下向きの圧力を使用して、スキージで余分なシリコーンを側面にこすり落とします。下向きの圧力をかけずにスキージで2回目のパスを実行し、シリコーンの線を取り除き、滑らかな層を生成します。幼虫の場合のみ、給餌チャンバーの上部をフルオンフルオロポリマー樹脂に数回浸し、アプリケーション間で乾燥させて一貫した層を生成します。メンブレンを、密閉された化学薬品やバイオセーフティキャビネットなどのほこりのない環境で少なくとも24時間硬化させます。次に、シリコーンミックスAとBを等量混合して、チャンバーを膜に取り付けるための30硬度のシリコーン混合物を調製します。ポリカーボネートチャンバーをシリコーン混合物に約4分の1インチ浸してから、テープが重ならないように注意しながら、メンブレンシートの上に置きます。付着したシリコーンを少なくとも24時間硬化させます。メスを使用して、取り付けられた各チャンバーの周りの膜を慎重に切断し、側面をあまりこすらずに6つのウェルプレートのウェルにスムーズに収まるようにエッジをトリミングします。膜の添加を最大化するのに十分な材料をチャンバーの外に許可します。メンブレンシートの各コーナーと中央から残ったメンブレンの小片を切り取ります。各ピースからラップを取り外し、マイクロメーターでピースを測定して、平均膜の厚さを決定します。チャンバーごとに1つのOリングと一緒に給餌チャンバーをガラスビーカーに入れ、摂氏121度で少なくとも20分間オートクレーブ滅菌します。チャンバーを使用する前に、チャンバーを冷ましてください。事前に準備されたオートクレーブ処理されたメンブレンチャンバーを取り出し、それらの周りにOリングを配置した後、各チャンバーにメンブレンを覆うのに十分な70%エタノールを充填します。6ウェルプレートに5分間置いてから、チャンバーとメンブレンの間、およびメンブレン自体に漏れがないか探します。チャンバーからエタノールを空にし、バイオセーフティキャビネットまたは層流フード内で風乾させます。血液中の補体を加熱して活性化するには、摂氏56度で40分間加熱し、機械的に除細動した牛の血液にグルコース1リットルあたり2グラムを補給します。膜が乾いたら、チャンバーの内側に約20マイクロリットルの食刺激剤を塗布し、チャンバーを傾けて表面全体に広げます。食刺激剤が乾いたら、ブラシまたは鉗子でダニをチャンバーにすばやく追加します。水浴からの熱がそれを裂く可能性があるので、パラフィルムで上部を密封してください。次に、ウェルまたはチャンバーごとに5ミリリットルの熱と活性化血液を円錐形のチューブに入れ、摂氏36度に設定した水浴に入れます。5ミリリットルの血液あたり5マイクロリットルの3ミリモルATPと50マイクロリットルの100Xストックのペニシリンストレプトマイシン菌類をチューブに加え、4.5ミリリットルの血液を6ウェルプレートのウェルに移します。チャンバーをウェルにそっと置き、チャンバーのOリングの高さを調整して、膜が血液中に入るようにしますが、側面の周りの血液濃度はウェルの上にありません。次に、血液と膜の間に気泡が形成されないように、ウェルを斜めに血液に入れます。6つのウェルプレートの蓋を給餌チャンバーの上に置きます。チャンバー付きの6つのウェルプレートを用意した摂氏34度の水浴と蓋に入れます。ウェルあたり5マイクロリットルの3ミリモルATPと50マイクロリットルの100Xストックのペニシリンストレプトマイシンファンギゾンを血液チューブに加え、前に示したように4.5ミリリットルの血液を新鮮な6ウェルプレートのウェルに移します。ティックチャンバー付きの6つのウェルプレートを水浴から取り出し、チャンバーをウェルから取り外します。チャンバーと膜の外側を10ミリリットルの滅菌済み1X PBSですすぎ、血液を除去します。オートクレーブ処理したろ紙を使用して、メンブレンとチャンバーを軽くたたいて乾かし、余分なPBSを取り除きます。チャンバー内に結露が多い場合は、オートクレーブ滅菌したろ紙で濡れた部分を軽くたたいてから、新しいパラフィルムで密封してください。次に、チャンバーの上部にあるパラフィルムを交換します。ティックチャンバーを新鮮な血液を入れた新しい6ウェルプレートに入れ、必要に応じてOリングの高さを調整します。プレート上のチャンバーごとにこれらの手順を繰り返します。最後に、6ウェルプレートの蓋をチャンバーの上部に置き、新しい6ウェルプレートを摂氏34度の水浴に戻します。部分的に充血したixodes scapularisニンフを含む進行中の飼料がここに示されています。付着部位の周りの黒または茶色の点は、食刺激剤を作るために飼料中および飼料後に収集できる霜です。部分的に充血した肩甲骨ニンフが膜に付着しているのが見られる。充血した幼虫カビの殻もここで見ることができます。ダニの充血数と卵の質量の重みをこの表に示します。幼虫および幼虫の充血実験条件では、この技術で使用されるサプリメントに加えて、シカ器官ホモジネートが血液に添加されました。ここでは、成功した充血は、次の生きた段階に脱皮した充血したダニ、または産卵に成功した充血した雌のいずれかとして定義されました。レンズ紙にシリコーンを塗布するときは、許容可能な厚さを得るには練習が必要なため、使用前に膜の厚さを測定することが常に重要です。膜摂食はダニを病原体や抗生物質にさらす可能性があります。脱皮の成功、産卵、生存などのダニ生物学の側面に対するこれらの影響は、飼料後に評価することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

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