Name: tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

1. Klargjøre flåttmembrankammeret
<ol><li>Forbered en flat, ikke-porøs overflate, for eksempel et plan av glass eller keramisk belagt metallbase av et armstativ ved å tørke det ned med 70% etanol og dekk det deretter med et enkelt lag plastfolie, og sørg for at plastfolien er flat og uten bobler eller rynker (se figur 1A).</li>
	<li>Teip ned rengjøringspapir for 100 % rayonlinser til den forberedte overflaten. Sørg for at den er flat og litt stram med tape over all...

<ol>
	<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs:+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories,+2004-2016.">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li><li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+(Rhipicephalus+microplus)+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer.">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 188 (2014).</li><li>S&#252;ss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+ticks+tick?+Climate+change,+ticks,+and+tick-borne+diseases.">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li><li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Pe&#241;a, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe.">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. , (1991).</li><li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding.">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li><li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice.">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li><li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system.">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).</li><li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory.">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li><li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers.">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li><li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system.">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li><li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen.">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li><li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+(Canestrini,+1887)+(Ixodidae:+Acarina)+on+the+embyonated+hen+egg.">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li><li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature,+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+(Canestrini)+larvae+to+skin+slices.">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks.">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li><li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro.">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+(Ixodida:+Ixodidae).">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+by+membrane+feeding.">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae).">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li><li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time.">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li><li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis.">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li><li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States,+2013-2019.">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li><li>Gonz&#225;lez, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks.">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li><li>Kr&#243;l, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding.">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).</li><li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+ticks.">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li></ol>

Kunstig membranfôring av flått gir et nyttig verktøy for en rekke eksperimentelle prosedyrer, men vil sannsynligvis ikke erstatte dyrefôring for alle applikasjoner. Å opprettholde store kolonier av flått i alle livsstadier uten dyrefôring er generelt uholdbart. I stedet er det kunstige fôringssystemet verdifullt for andre formål som å infisere flått med patogener som ikke støttes av modellverter, evaluere virkningen av kontrollerte doser av forbindelser eller mikroorganismer på flåtten i et forenklet fôrin...

Flåttbårne sykdommer har stor innvirkning på helsen til mennesker og dyr over hele verden, og er ansvarlig for mer enn to tredjedeler av all vektorassosiert sykdom i USA fra 2004 til 20161. I tillegg har antall tilfeller vokst de siste årene, med flere mennesker og husdyr som blir rammet av flått og tilhørende sykdommer 2,3. Selv om det sannsynligvis er mange årsaker til den oppadgående trenden i antall tilfeller, er det endrede klimaet en viktig faktor 3,4. Den forventede pågående økningen i antall flåttbårne sykdomstilfeller understreker behovet for å utvikle nye verktøy for å undersøke forholdet mellom flått og patogenene de overfører.
Det er kjent at flått gjennomgår endringer i fysiologi og genuttrykk under fôring, og at disse endringene spiller en rolle i patogenoverføring 5,6. Det kan være vanskelig å utføre studier som undersøker effekten av full og delvis fôring på patogenoverføring og oppkjøp ved hjelp av dyremodeller, spesielt i situasjoner der gnagermodeller ikke er utsatt for infeksjon av et bestemt patogen. For eksempel overføres Anaplasma phagocytophilum Variant-1-stammen naturlig mellom Ixodes scapularis og hjort, men kan ikke infisere mus, noe som kompliserer kryssinfeksjon i laboratoriet7. Kunstige fôringssystemer kan også brukes til å studere patogener som Borrelia burgdorferi ved bruk av transgene mutanter som har gendelesjoner som hemmer overføring eller infeksjon8. Ved hjelp av et kunstig fôringssystem hjelper forskere å isolere genenes rolle ved å la infeksjon eller overføring bare forekomme på tippens side, og dermed isolere eventuelle vertsresponser som kan forvirre slike studier.
På samme måte kan noen livsstadier av flått involvert i sykdom og dyreoverføring ikke induseres til å mate på vanlige laboratoriemodellarter. Ixodes scapularis-hunner må for eksempel fôres på større dyr, typisk kaniner9. Selv om de ofte er tilgjengelige for laboratorieeksperimenter, overstiger de administrative kravene og kravene til bruk av kaniner smågnagere og kan være uoverkommelige for noen laboratorier. Andre flåttarter, spesielt de av veterinær bekymring, må fôres på storfe eller andre store dyr som ikke er praktiske å bruke i de fleste laboratorier. In vitro fôrings- og infeksjonsmetoder, som kunstig membranfôring, gir alternativer til bruk av store eller eksotiske vertsdyr.
I tillegg tillater bruk av et kunstig fôringssystem visse analyser som kanskje ikke er mulige med tradisjonelle dyrefôringsmetoder. Et slikt eksempel er at ved å skille blodkilden fra fôringsmekanismen, blir undersøkelse av rollen som forskjellige verters blod kan ha i B. burgdorferi-overføring mulig10. Denne undersøkelsen av vertsblod og rollen blod selv spiller i fravær av vertsimmunresponsen er en viktig faktor for å kunne forstå patogenoverføringssykluser og en som kunstige fôringssystemer kan bidra til å svarepå 11. Det blir også mulig å kvantifisere de eksakte overføringsnumrene til et patogen under en fôring i stedet for bare å undersøke overføringssuksess og etablering i en vert 8,12.
Noen av de første kunstige fôringsmembranene laget for harde flått ble laget av dyreskinn eller animalske avledede membraner på 1950- og 1960-tallet13,14. På grunn av den biologiske naturen til disse membranene var det problemer med både produksjon av nye membraner og holdbarhet. På 1990-tallet ble det utviklet helt kunstige membraner som benyttet en bakside av netting, papir eller stoff med silikonimpregnering15,16. Silikon var ideell da dens fysiske egenskaper etterligner hudens elastisitet og svak klebrighet, sammen med dens bio-iboende natur. Basert på dette beskrev Krober og Guerin, hvis arbeid denne teknikken var basert på, en silikonimpregnert rayonmembranfôringsteknikk for kunstig fôring av I. ricinus17.
Forbedring av metodene for I. scapularis, en nært beslektet art, har ført til bemerkelsesverdige forskjeller i hardheten til silikon som brukes i membranimpregnering, oppskriften på membranproduksjon, kammerets dimensjoner og festestimulanten. Mens forbedringene rapportert i denne studien har resultert i lignende membranegenskaper som de som er rapportert av Andrade et al., som også utviklet en silikonbasert membran basert på Krober og Guerin for bruk i I. scapularis, er det en forskjell i silikonimpregneringstrinnene, noe som gir fleksibilitet til å bruke denne protokollen for umodne livsstadier av I. scapularis 15, 18. Denne studien beskriver også tillegg og tekniske endringer basert på gjentatt bruk av denne metoden, anbefalte fremgangsmåter som resulterer i en vellykket feed, og feilsøking av problemer som kan oppstå. Denne metoden har blitt brukt til å mate alle aktive livsstadier, infisere flått med patogene bakterier og utsette flått for flere doser antibiotika19,20. Mens den kunstige membranfôringsmetoden vist er for I. scapularis, er denne metoden lett å tilpasse til andre arter av flått med mindre modifikasjoner i membrantykkelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>00-10 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-10</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>00-50 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-50</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Mold Star 30</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1852-1VL</td>
			<td>Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DBB500</td>
			<td>Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clingwrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-790-2C</td>
			<td>Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2871</td>
			<td>Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>139386-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td>100% rayon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin &#160;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-750-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S37440&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 &#181;g/mL of streptomycin, and 25 &#181;g/mL of Amphotericin B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagostimulant</td>
			<td>Made in House</td>
			<td></td>
			<td>Collected from prior tick feeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8585K204&#160;</td>
			<td>Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber O-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K38&#160;</td>
			<td>5 mm thick, 1.25 inch inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft touch forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470315-238&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unryu paper&#160;</td>
			<td>Art supply stores</td>
			<td></td>
			<td>mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis

Flått og tilhørende sykdommer er et viktig tema for studier på grunn av deres folkehelse og veterinær byrde. Imidlertid kan fôringskravene til flått under både studier og oppdrett begrense eksperimentelle spørsmål eller laboratoriets evne til å undersøke flått og tilhørende patogener. Et kunstig membranfôringssystem kan redusere disse problemene og åpne opp nye forskningsveier som kanskje ikke har vært mulig med tradisjonelle dyrefôringssystemer. Denne studien beskriver et kunstig membranfôringssystem som har blitt raffinert for fôring og engorgementsuksess for alle Ixodes scapularis livsstadier. Videre kan det kunstige membranfôringssystemet beskrevet i denne studien modifiseres for bruk med andre flåttarter gjennom enkel foredling av ønsket membrantykkelse. Fordelene ved et kunstig membranfôringssystem oppveies av arbeidsintensiviteten i systemet, de ekstra miljøfaktorene som kan påvirke fôringssuksess, og behovet for å forfine teknikken for hver ny art og livsstadium av flått.

En vellykket fôring avhenger av om en delvis eller full engorgement er ønsket. Vellykket matet I. scapularis gjør en nyanse av gunmetal grå for voksne og løsner på egen hånd fra membranen. Men hvis de er minst ertestore, kan de løsnes fra membranen når du er ferdig med fôringen. For umodne stadier av I. scapularis varierer størrelsen for fullt engorged flått, og fordi de, i motsetning til voksne, ikke viser en fargeendring, er løsrivelse den beste måten å avgjøre om et kryss er fullt eng...

Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Presentert her er en metode for å blodmate flått in vitro via et kunstig membransystem for å muliggjøre delvis eller full engorgement av en rekke flåttlivsstadier.

Tick kunstig membranfôring for Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

Mens kunstig membranfôring har blitt gjort før, er protokollen vår enklere å sette opp og kan tilpasses andre flåttarter med noen modifikasjoner. Den største fordelen med kunstig membranfôring er at den tillater eksponering for patogener og behandlinger som kanskje ikke er gjennomførbare via dyrefôring. Dette kunstige membranfôringssystemet kan brukes på andre leddyrarter med noen tester for ideelle fagostimulerende midler og modifikasjoner på ideell membrantykkelse.Å produsere riktig membrantykkelse krever litt øvelse. Sørg for å bruke et mikrometer for å måle tykkelsen på flere steder på membranen. Benjamin Cull, en postdoktor i laboratoriet vårt, vil hjelpe meg med å demonstrere prosedyren.For å begynne, tørk av en flat, ikke-porøs overflate som en glassrute eller keramisk belagt metallbase av et armstativ med 70% etanol og dekk det deretter med et enkelt lag plastfolie. Pass på at plastfolien er flat og uten bobler eller rynker. Teip ned rengjøringspapir for 100 %rayon-linser til den forberedte overflaten.Sørg for at den er flat og litt stram med tape over alle fire sidene av papiret. Forbered 0010 hardhet silikonblanding ved å måle ut fem milliliter av hver del av silikonsettet i en engangsbeholder. Bland de to væskene lett og tilsett 1,5 ml heksan.Fortsett å blande til blandingen er homogen og grundig blandet. Bruk en liten squeegee til å fordele silikonblandingen over linsepapiret og la den stå i ett minutt for å sikre at silikonet har trukket inn i linsepapiret. Skrap jevnt overflødig silikon til siden med klemmen med et lite trykk nedover.Utfør et andre pass med squeegee uten å utøve det nedadgående trykket for å fjerne noen silikonlinjer og produsere et jevnt lag. Bare for larver, dypp toppen av fôringskammeret i Fluon fluoropolymerharpiks flere ganger, slik at den tørker mellom applikasjoner for å produsere et konsistent lag. La membranen herde i minst 24 timer i et støvfritt miljø, for eksempel et lukket kjemikalie- eller biosikkerhetsskap.Bland deretter like deler silikonblanding A og B for å forberede silikonblandingen med 30 hardhet for å feste kamrene til membranen. Dypp polykarbonatkamrene omtrent en kvart tomme i silikonblandingen, og legg dem deretter på membranarket, pass på at du ikke overlapper noen av båndene. La den festede silikonen herde i minst 24 timer.Bruk en skalpell, kutt forsiktig membranen rundt hvert av de vedlagte kamrene, trimm ned kantene slik at den kan passe jevnt inn i en brønn på de seks brønnplatene uten mye skraping på sidene. Tillat tilstrekkelig materiale utenfor kammeret for å maksimere tilsetningen av membranen. Klipp et lite stykke av den resterende membranen fra hvert hjørne og midten av membranarket.Fjern plastfolien fra hvert stykke og mål bitene med en mikrometer for å bestemme gjennomsnittlig membrantykkelse. Plasser fôringskamrene sammen med en O-ring per kammer i et glassbeger som skal autoklaveres ved 121 grader Celsius i minst 20 minutter for å sterilisere. La kamrene avkjøles før du bruker dem.Etter å ha tatt ut de forberedte, autoklaverte membrankamrene og plassert O-ringen rundt dem, fyll hvert kammer med nok 70% etanol til å dekke membranen. La den sitte i en seks brønnplate i fem minutter, og se deretter etter eventuelle lekkasjer mellom kammeret og membranen og i selve membranen. Tøm ut etanolen fra kamrene og la den lufttørke inne i et biosikkerhetsskap eller laminær avtrekkshette.For å varme og aktivere komplementet i blodet, varme det ved 56 grader Celsius i 40 minutter og suppler mekanisk defibrillert storfeblod med to gram per liter glukose. Når membranen er tørr, bruk rundt 20 mikroliter fagostimulerende middel på innsiden av kammeret og vipp kammeret for å spre det rundt overflaten. Når fagostimulanten er tørr, legg raskt flåttene til kammeret med enten en børste eller tang.Forsegl toppen med parafilm, da varmen fra vannbadet kan få den til å rive. Deretter tilsettes fem milliliter av varmen og aktivert blod per brønn eller kammer i et konisk rør og legger det i vannbadet satt til 36 grader Celsius. Legg til fem mikroliter av tre millimolar ATP og 50 mikroliter 100X lager av penicillin streptomycin fungizone per fem milliliter blod til røret og overfør 4,5 milliliter blod til en brønn på en seks brønnplate.Plasser kammeret forsiktig i brønnen, juster O-ringhøyden på kammeret slik at membranen sitter i blodet, men blodnivået rundt siden overgår ikke brønnen. Legg deretter brønnen i blodet i en vinkel for å unngå luftbobledannelse mellom blodet og membranen. Plasser lokket på de seks brønnplatene på toppen av fôringskamrene.Sett seksbrønnplaten med kamre i det forberedte 34 grader Celsius vannbadet og lokket. Tilsett fem mikroliter av tre millimolar ATP og 50 mikroliter 100X lager av penicillin streptomycin fungizone per brønn til blodrøret og overfør 4,5 ml blod til en brønn på en fersk seks brønnplate som vist tidligere. Ta ut de seks brønnplatene med krysskammeret fra vannbadet og fjern kammeret fra brønnen.Skyll utsiden av kammeret og membranen med 10 ml sterilisert 1X PBS for å fjerne blodet. Bruk autoklavert filterpapir til å tørke membranen og kammeret forsiktig for å fjerne overflødig PBS. Hvis det er mye kondens inne i kammeret, tørk de våte flekkene med autoklavert filterpapir før du forsegler det med fersk parafilm.Bytt deretter parafilmen på toppen av kammeret. Plasser flåttkammeret i den nye seksbrønnsplaten med friskt blod, og juster O-ringhøyden om nødvendig. Gjenta disse trinnene for hvert kammer på platen.Til slutt legger du lokket på de seks brønnplatene over toppen av kamrene og flytter den nye seks brønnplaten tilbake i vannbadet på 34 grader Celsius. En pågående fôr med delvis engorged ixodes scapularis nymfer er vist her. De svarte eller brune prikkene rundt festestedene er frosten som kan samles under og etter fôret for å lage fagostimulanten.Delvis engorged ixodes scapularis nymfer ses festet til membranen. Et skall av engorged larver mold kan også sees her. Flåttsprengtallene og eggmassevektene er presentert i denne tabellen.Larve og nymphal engorgement eksperimentelle forhold hadde hjort organ homogenat lagt til blodet i tillegg til kosttilskudd som brukes i denne teknikken. Her ble vellykket engorgement definert som enten engorged flått som vellykket smeltet til neste levende stadium eller engorged kvinner som vellykket la egg. Det krever øvelse å få akseptabel tykkelse når du påfører silikon på linsepapiret, så det er alltid viktig å måle tykkelsen på membranen før bruk.Membranfôring kan utsette flått for patogener eller antibiotika. Effektene av disse på aspekter av flåttbiologi som smeltesuksess, egglegging og overlevelse kan vurderes etter fôr.

Research

JoVE Journal

Biology

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Bruk av en robot for High-throughput Krystallisering av membran proteiner i Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Høsting og Cryo-kjøling Krystaller av membran proteiner Grown i Lipidic Mesophases for strukturbestemmelse av Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusion Technique å etterforske Regulering av microvessel Permeabilitet i Rat mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Høy fett Fôring Paradigm for Larve Sebrafisk: Fôring, Live Imaging, og Kvantifisering av matinntak

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Bakken staten uttømming super-oppløsning Imaging i pattedyrceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...