Name: tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00
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1. Preparação da câmara de membrana do carrapato
<ol><li>Prepare uma superfície plana e não porosa, como um plano de vidro ou base metálica revestida de cerâmica de um suporte de braço, limpando-a com etanol a 70% e, em seguida, cubra-a com uma única camada de filme plástico, certificando-se de que o filme plástico é plano e sem bolhas ou rugas (ver Figura 1A).</li>
	<li>Tape 100% de papel de limpeza da lente rayon para a superfície preparada. Certifique-se de...

<ol>
	<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs:+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories,+2004-2016.">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li><li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+(Rhipicephalus+microplus)+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer.">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 188 (2014).</li><li>S&#252;ss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+ticks+tick?+Climate+change,+ticks,+and+tick-borne+diseases.">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li><li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Pe&#241;a, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe.">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. , (1991).</li><li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding.">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li><li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice.">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li><li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system.">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).</li><li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory.">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li><li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers.">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li><li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system.">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li><li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen.">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li><li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+(Canestrini,+1887)+(Ixodidae:+Acarina)+on+the+embyonated+hen+egg.">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li><li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature,+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+(Canestrini)+larvae+to+skin+slices.">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks.">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li><li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro.">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+(Ixodida:+Ixodidae).">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+by+membrane+feeding.">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae).">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li><li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time.">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li><li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis.">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li><li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States,+2013-2019.">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li><li>Gonz&#225;lez, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks.">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li><li>Kr&#243;l, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding.">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).</li><li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+ticks.">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li></ol>

A alimentação artificial por membrana de carrapatos fornece uma ferramenta útil para uma variedade de procedimentos experimentais, mas não é provável que substitua a alimentação animal para todas as aplicações. Manter grandes colônias de carrapatos em todos os estágios da vida sem alimentação animal é geralmente insustentável. Em vez disso, o sistema de alimentação artificial é valioso para outros fins, como infectar carrapatos com patógenos não suportados por hospedeiros modelo, avaliar os impactos ...

As doenças transmitidas por carrapatos afetam fortemente a saúde de humanos e animais em todo o mundo, sendo responsáveis por mais de dois terços de todas as doenças associadas a vetores nos EUA de 2004 a 20161. Além disso, o número de casos vem crescendo nos últimos anos, com mais pessoas e gado sendo afetados por carrapatos e suas doenças associadas 2,3. Embora existam provavelmente inúmeras causas para a tendência ascendente no número de casos, a mudança climática é um fator importante 3,4. O aumento contínuo previsto no número de casos de doenças transmitidas por carrapatos sublinha a necessidade de desenvolver novas ferramentas para investigar as relações entre os carrapatos e os patógenos que eles transmitem.
Sabe-se que os carrapatos sofrem alterações na fisiologia e expressão gênica durante a alimentação e que essas alterações desempenham um papel na transmissão de patógenos 5,6. Pode ser difícil realizar estudos que examinem os efeitos da alimentação total e parcial na transmissão e aquisição de patógenos usando modelos animais, particularmente em situações em que os modelos de roedores não são suscetíveis à infecção por um patógeno específico. Por exemplo, a cepa Anaplasma phagocytophilum Variant-1 é transmitida naturalmente entre Ixodes scapularis e veados, mas é incapaz de infectar camundongos, complicando a infecção por carrapatos no laboratório7. Sistemas de alimentação artificial também podem ser aplicados para ajudar a estudar patógenos como Borrelia burgdorferi através do uso de mutantes transgênicos que apresentam deleções gênicas que inibem a transmissão ou infecção8. O uso de um sistema de alimentação artificial ajuda os pesquisadores a isolar o papel dos genes, permitindo que a infecção ou a transmissão ocorram apenas no lado do carrapato, isolando assim qualquer resposta do hospedeiro que possa confundir tais estudos.
Da mesma forma, alguns estágios da vida de carrapatos envolvidos em doenças e transmissão animal podem não ser induzidos a se alimentar de espécies comuns de modelo de laboratório. As fêmeas de Ixodes scapularis , por exemplo, devem ser alimentadas com animais maiores, tipicamente coelhos9. Embora muitas vezes acessíveis para experimentação em laboratório, os requisitos administrativos e de criação do uso de coelhos excedem os de pequenos roedores e podem ser proibitivos para alguns laboratórios. Outras espécies de carrapatos, particularmente as que suscitam preocupação veterinária, devem ser alimentadas com bovinos ou outros animais de grande porte que não sejam práticos de utilizar na maioria dos laboratórios. A alimentação in vitro e os métodos de infecção, como a alimentação artificial por membrana, fornecem alternativas ao uso de animais hospedeiros grandes ou exóticos.
Além disso, o uso de um sistema de alimentação artificial permite certas análises que podem não ser possíveis com os métodos tradicionais de alimentação animal. Um exemplo é que, ao separar a fonte de sangue do mecanismo de alimentação, torna-se possível o exame do papel que o sangue de diferentes hospedeiros pode ter na transmissão de B. burgdorferi 10. Esse exame do sangue do hospedeiro e do papel que o próprio sangue desempenha na ausência da resposta imune do hospedeiro é um fator importante para a compreensão dos ciclos de transmissão de patógenos e que os sistemas de alimentação artificial são capazes de ajudar a responder11. Também se torna possível quantificar os números exatos de transmissão de um patógeno durante uma alimentação, em vez de apenas examinar o sucesso da transmissão e o estabelecimento em um hospedeiro 8,12.
Algumas das primeiras membranas de alimentação artificial feitas para carrapatos duros foram feitas de peles de animais ou membranas derivadas de animais nas décadas de 1950 e 196013,14. Devido à natureza biológica dessas membranas, houve problemas com a produção de novas membranas e com a vida útil. Na década de 1990, foram desenvolvidas membranas totalmente artificiais que utilizavam um suporte de rede, papel ou tecido com impregnação de silicone15,16. O silicone era ideal, pois suas propriedades físicas imitam a elasticidade da pele e a ligeira aderência, juntamente com sua natureza bio-inerente. Com base nisso, Krober e Guerin, em cujo trabalho essa técnica se baseou, descreveram uma técnica de alimentação por membrana de rayon impregnada de silicone para a alimentação artificial de I. ricinus17.
O refinamento dos métodos para I. scapularis, uma espécie intimamente relacionada, levou a diferenças notáveis na dureza do silicone usado na impregnação da membrana, na receita para a produção de membrana, nas dimensões da câmara e no estimulante de fixação. Embora os refinamentos relatados neste estudo tenham resultado em características de membrana semelhantes às relatadas por Andrade et al., que também desenvolveram uma membrana à base de silicone à base de Krober e Guerin para uso em I. scapularis, há uma diferença nas etapas de impregnação do silicone, o que permite a flexibilidade de utilizar esse protocolo para estágios de vida imaturos de I. scapularis 15, 18. Este estudo também descreve adições e alterações técnicas com base no uso repetido desse método, melhores práticas que resultam em uma alimentação bem-sucedida e solução de problemas que possam surgir. Esse método tem sido utilizado para alimentar todos os estágios ativos da vida, infectar carrapatos com bactérias patogênicas e expor carrapatos a múltiplas dosagens de antibióticos19,20. Enquanto o método de alimentação por membrana artificial mostrado é para I. scapularis, este método é facilmente adaptável a outras espécies de carrapatos com pequenas modificações na espessura da membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>00-10 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-10</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>00-50 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-50</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Mold Star 30</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1852-1VL</td>
			<td>Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DBB500</td>
			<td>Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clingwrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-790-2C</td>
			<td>Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2871</td>
			<td>Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>139386-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td>100% rayon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin &#160;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-750-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S37440&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 &#181;g/mL of streptomycin, and 25 &#181;g/mL of Amphotericin B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagostimulant</td>
			<td>Made in House</td>
			<td></td>
			<td>Collected from prior tick feeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8585K204&#160;</td>
			<td>Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber O-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K38&#160;</td>
			<td>5 mm thick, 1.25 inch inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft touch forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470315-238&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unryu paper&#160;</td>
			<td>Art supply stores</td>
			<td></td>
			<td>mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis

Os carrapatos e suas doenças associadas são um importante tópico de estudo devido à sua saúde pública e carga veterinária. No entanto, as necessidades de alimentação dos carrapatos durante o estudo e a criação podem limitar as questões experimentais ou a capacidade dos laboratórios de pesquisar carrapatos e seus patógenos associados. Um sistema de alimentação por membrana artificial pode reduzir esses problemas e abrir novos caminhos de pesquisa que podem não ter sido possíveis com os sistemas tradicionais de alimentação animal. Este estudo descreve um sistema de alimentação por membrana artificial que foi refinado para o sucesso da alimentação e ingurgitamento para todos os estágios de vida de Ixodes escapulares . Além disso, o sistema de alimentação por membrana artificial descrito neste estudo pode ser modificado para uso com outras espécies de carrapatos através do simples refinamento da espessura de membrana desejada. Os benefícios de um sistema de alimentação por membrana artificial são contrabalançados pela intensidade do trabalho do sistema, os fatores ambientais adicionais que podem afetar o sucesso da alimentação e a necessidade de refinar a técnica para cada nova espécie e estágio de vida dos carrapatos.

Uma alimentação bem-sucedida depende se um ingurgitamento parcial ou total é desejado. Alimentado com sucesso I. scapularis virar um tom de cinza gunmetal para adultos e se desprender por conta própria da membrana. No entanto, se eles são pelo menos do tamanho de ervilha, eles podem ser separados da membrana ao terminar a alimentação. Para estágios imaturos de I. scapularis , o tamanho para carrapatos totalmente ingurgitados varia, e porque, ao contrário dos adultos, eles não exibem uma mudan?...

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Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Apresentado aqui é um método para alimentar carrapatos no sangue in vitro através de um sistema de membrana artificial para permitir o ingurgitamento parcial ou total de uma variedade de estágios de vida do carrapato.

Carrapato Alimentação por Membrana Artificial para Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

Embora a alimentação artificial por membrana já tenha sido feita antes, nosso protocolo é mais simples de configurar e adaptável a outras espécies de carrapatos com algumas modificações. A principal vantagem da alimentação artificial por membrana é que ela permite a exposição a patógenos e tratamentos que podem não ser viáveis através da alimentação animal. Este sistema de alimentação por membrana artificial pode ser aplicado a outras espécies de artrópodes com alguns testes para fagostimulantes ideais e modificações na espessura ideal da membrana.Produzir a espessura correta da membrana requer alguma prática. Certifique-se de usar um micrômetro para medir a espessura em vários locais da membrana. Benjamin Cull, um pós-doutorando em nosso laboratório me ajudará a demonstrar o procedimento.Para começar, limpe uma superfície plana e não porosa, como um painel de vidro ou base de metal revestida de cerâmica de um suporte de braço com etanol a 70% e, em seguida, cubra-a com uma única camada de filme plástico. Certifique-se de que o filme plástico é plano e sem bolhas ou rugas. Tape 100% rayon papel de limpeza da lente para a superfície preparada.Certifique-se de que está plano e ligeiramente tenso com fita adesiva em todos os quatro lados do papel. Prepare a mistura de silicone de dureza 0010 medindo cinco mililitros de cada parte do kit de silicone em um recipiente descartável. Misture levemente os dois líquidos e adicione 1,5 mililitros de hexano.Continue misturando até que a mistura esteja homogênea e completamente misturada. Use um rodo pequeno para distribuir a mistura de silicone sobre o papel da lente e deixe-a repousar por um minuto para garantir que o silicone tenha embebido no papel da lente. De forma constante, raspe o excesso de silicone para o lado com o rodo usando uma pequena quantidade de pressão para baixo.Execute uma segunda passagem com o rodo sem exercer a pressão descendente para remover quaisquer linhas de silicone e produzir uma camada lisa. Apenas para larvas, mergulhe o topo da câmara de alimentação na resina de fluoropolímero Fluon várias vezes, permitindo que ela seque entre as aplicações para produzir uma camada consistente. Deixe a membrana para curar por pelo menos 24 horas em um ambiente livre de poeira, como um armário químico ou de biossegurança fechado.Em seguida, misture partes iguais da mistura de silicone A e B para preparar a mistura de silicone de dureza 30 para anexar as câmaras à membrana. Mergulhe as câmaras de policarbonato cerca de um quarto de polegada na mistura de silicone e, em seguida, coloque-as na folha de membrana, tomando cuidado para não sobrepor nenhuma das fitas. Deixe o silicone de fixação curar por pelo menos 24 horas.Usando um bisturi, corte cuidadosamente a membrana em torno de cada uma das câmaras anexadas, aparando as bordas para que ela possa se encaixar suavemente em um poço da placa de seis poços sem muita raspagem nas laterais. Deixe material suficiente fora da câmara para maximizar a adição da membrana. Corte um pequeno pedaço da membrana que sobra de cada canto e o centro da folha de membrana.Remova o filme plástico de cada peça e meça as peças com um micrômetro para determinar a espessura média da membrana. Coloque as câmaras de alimentação juntamente com um O-ring por câmara em um copo de vidro para ser autoclavado a 121 graus Celsius por pelo menos 20 minutos para esterilizar. Deixe as câmaras esfriarem antes de usá-las.Depois de retirar as câmaras de membrana autoclavadas pré-preparadas e colocar o anel O em torno delas, encha cada câmara com etanol suficiente a 70% para cobrir a membrana. Deixe descansar em uma placa de seis poços por cinco minutos e, em seguida, procure por quaisquer vazamentos entre a câmara e a membrana e na própria membrana. Esvazie o etanol das câmaras e, em seguida, deixe-o secar ao ar dentro de um gabinete de biossegurança ou exaustor de fluxo laminar.Para aquecer e ativar o complemento no sangue, aqueça-o a 56 graus Celsius por 40 minutos e complemente o sangue bovino desfibrilado mecanicamente com dois gramas por litro de glicose. Uma vez que a membrana esteja seca, aplique cerca de 20 microlitros de fagostimulante no interior da câmara e incline a câmara para espalhá-la pela superfície. Quando o fagostimulante estiver seco, adicione rapidamente os carrapatos à câmara com uma escova ou pinça.Sele o topo com parafilme, pois o calor do banho-maria pode fazer com que ele rasgue. Em seguida, adicione cinco mililitros de calor e sangue ativado por poço ou câmara em um tubo cônico e coloque-o no banho-maria a 36 graus Celsius. Adicione cinco microlitros de três milimolares de ATP e 50 microlitros de 100X de estoque de penicilina estreptomicina fungizona por cinco mililitros de sangue para o tubo e transfira 4,5 mililitros de sangue para um poço de uma placa de seis poços.Coloque suavemente a câmara no poço, ajustando a altura do anel O na câmara para que a membrana fique no sangue, mas o nível sanguíneo ao redor do lado não sobrecarregue o poço. Em seguida, coloque o poço no sangue em um ângulo para evitar a formação de bolhas de ar entre o sangue e a membrana. Coloque a tampa da placa de seis poços em cima das câmaras de alimentação.Coloque a placa de seis poços com câmaras no banho de água preparado a 34 graus Celsius e na tampa. Adicione cinco microlitros de três milimolares de ATP e 50 microlitros de 100X de estoque de penicilina estreptomicina fungizona por poço para o tubo de sangue e transfira 4,5 mililitros de sangue para um poço de uma placa fresca de seis poços, como mostrado anteriormente. Retire a placa de seis poços com a câmara de carrapatos do banho-maria e remova a câmara do poço.Lave o exterior da câmara e da membrana com 10 mililitros de PBS 1X esterilizado para remover o sangue. Usando papel de filtro autoclavado, seque suavemente a membrana e a câmara para remover o excesso de PBS. Se houver muita condensação dentro da câmara, seque as manchas molhadas com papel de filtro autoclavado antes de selá-lo com parafilme fresco.Em seguida, substitua o parafilme no topo da câmara. Coloque a câmara de carrapatos na nova placa de seis poços com sangue fresco, ajustando a altura do O-ring, se necessário. Repita estes passos para cada câmara na placa.Finalmente, coloque a tampa da placa de seis poços sobre o topo das câmaras e mova a nova placa de seis poços de volta para o banho de água de 34 graus Celsius. Uma alimentação contínua com ninfas ixodes scapularis parcialmente ingurgitadas é mostrada aqui. Os pontos pretos ou marrons ao redor dos locais de fixação são a geada que pode ser coletada durante e após a alimentação para fazer o fagostimulante.Ninfas ixodes scapularis parcialmente ingurgitadas são vistas ligadas à membrana. Uma casca do mofo de larvas ingurgitadas também pode ser vista aqui. Os números de ingurgitamento de carrapatos e os pesos de massa de ovos são apresentados nesta tabela.As condições experimentais de ingurgitamento larval e ninfal tiveram homogeneizado de órgão de veado adicionado ao sangue, além dos suplementos utilizados nesta técnica. Aqui, o ingurgitamento bem-sucedido foi definido como carrapatos ingurgitados que se mudaram com sucesso para o próximo estágio vivo ou fêmeas ingurgitadas que colocaram ovos com sucesso. É preciso prática para obter espessura aceitável ao aplicar silicone ao papel da lente, por isso é sempre importante medir a espessura da membrana antes do uso.A alimentação por membrana pode expor carrapatos a patógenos ou antibióticos. Os efeitos destes em aspectos da biologia do carrapato, como o sucesso da muda, a postura de ovos e a sobrevivência, podem ser avaliados após a alimentação.

Research

JoVE Journal

Biology

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Teste de tolerância à nicotina em Aphids Usando uma experiência Dieta Artificial

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Biologia

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Preparação de Bicamadas Artificial para Experimentos Eletrofisiologia

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristalizando Proteínas de Membrana para determinação da estrutura usando mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

A utilização de um robô para alta capacidade de cristalização de proteínas de membrana em mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Alto teor de gordura Alimentação Paradigma para larval Zebrafish: Alimentação, Imagens ao vivo, e quantificação da ingestão de alimentos

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...