Name: tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00
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1. Preparación de la cámara de membrana de garrapatas
<ol><li>Prepare una superficie plana y no porosa, como un plano de base metálica recubierta de vidrio o cerámica de un soporte para brazos, limpiándola con etanol al 70% y luego cúbrala con una sola capa de envoltura de plástico, asegurándose de que la envoltura de plástico sea plana y sin burbujas ni arrugas (ver Figura 1A).</li>
	<li>Pegue papel de limpieza de lentes de rayón 100% a la superficie preparada. ...

<ol>
	<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs:+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories,+2004-2016.">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li><li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+(Rhipicephalus+microplus)+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer.">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 188 (2014).</li><li>S&#252;ss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+ticks+tick?+Climate+change,+ticks,+and+tick-borne+diseases.">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li><li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Pe&#241;a, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe.">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. , (1991).</li><li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding.">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li><li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice.">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li><li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system.">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).</li><li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory.">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li><li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers.">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li><li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system.">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li><li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen.">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li><li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+(Canestrini,+1887)+(Ixodidae:+Acarina)+on+the+embyonated+hen+egg.">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li><li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature,+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+(Canestrini)+larvae+to+skin+slices.">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks.">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li><li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro.">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+(Ixodida:+Ixodidae).">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+by+membrane+feeding.">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae).">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li><li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time.">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li><li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis.">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li><li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States,+2013-2019.">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li><li>Gonz&#225;lez, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks.">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li><li>Kr&#243;l, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding.">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).</li><li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+ticks.">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li></ol>

La alimentación artificial por membrana de garrapatas proporciona una herramienta útil para una variedad de procedimientos experimentales, pero no es probable que reemplace la alimentación animal para todas las aplicaciones. Mantener grandes colonias de garrapatas en todas las etapas de la vida sin alimentación animal es generalmente insostenible. En cambio, el sistema de alimentación artificial es valioso para otros fines, como infectar garrapatas con patógenos no apoyados por huéspedes modelo, evaluar los impact...

Las enfermedades transmitidas por garrapatas tienen un fuerte impacto en la salud de los seres humanos y los animales en todo el mundo, siendo responsables de más de dos tercios de todas las enfermedades asociadas a vectores en los Estados Unidos desde 2004 hasta 20161. Además, el número de casos ha ido creciendo en los últimos años, con más personas y ganado afectados por garrapatas y sus enfermedades asociadas 2,3. Si bien es probable que haya numerosas causas para la tendencia al alza en el número de casos, el clima cambiante es un factor importante 3,4. El aumento continuo previsto en el número de casos de enfermedades transmitidas por garrapatas subraya la necesidad de desarrollar nuevas herramientas para investigar las relaciones entre las garrapatas y los patógenos que transmiten.
Se sabe que las garrapatas sufren cambios en la fisiología y la expresión génica durante la alimentación y que estos cambios juegan un papel en la transmisión del patógeno 5,6. Puede ser difícil realizar estudios que examinen los efectos de la alimentación total y parcial en la transmisión y adquisición de patógenos utilizando modelos animales, particularmente en situaciones donde los modelos de roedores no son susceptibles a la infección por un patógeno en particular. Por ejemplo, la cepa Anaplasma phagocytophilum Variant-1 se transmite naturalmente entre Ixodes scapularis y ciervos, pero no puede infectar ratones, lo que complica la infección por garrapatas en el laboratorio7. Los sistemas de alimentación artificial también se pueden aplicar para ayudar a estudiar patógenos como Borrelia burgdorferi mediante el uso de mutantes transgénicos que tienen deleciones genéticas que inhiben la transmisión o infección8. El uso de un sistema de alimentación artificial ayuda a los investigadores a aislar el papel de los genes al permitir que la infección o la transmisión solo ocurran en el lado de la garrapata, aislando así cualquier respuesta del huésped que pueda confundir tales estudios.
Del mismo modo, algunas etapas de la vida de las garrapatas involucradas en la enfermedad y la transmisión animal pueden no ser inducidas a alimentarse de especies modelo de laboratorio comunes. Las hembras de Ixodes scapularis , por ejemplo, deben alimentarse de animales más grandes, típicamente conejos9. Aunque a menudo son accesibles para la experimentación de laboratorio, los requisitos administrativos y de cría del uso de conejos exceden los de los roedores pequeños y pueden ser prohibitivos para algunos laboratorios. Otras especies de garrapatas, en particular las de interés veterinario, deben alimentarse con ganado u otros animales grandes que no son prácticos de usar en la mayoría de los laboratorios. La alimentación in vitro y los métodos de infección, como la alimentación por membrana artificial, proporcionan alternativas al uso de animales huéspedes grandes o exóticos.
Además, el uso de un sistema de alimentación artificial permite ciertos análisis que pueden no ser posibles con los métodos tradicionales de alimentación animal. Un ejemplo de ello es que, al separar la fuente de sangre del mecanismo de alimentación, se hace posible el examen del papel que la sangre de diferentes huéspedes puede tener en la transmisión de B. burgdorferi 10. Este examen de la sangre del huésped y el papel que desempeña la sangre misma en ausencia de la respuesta inmune del huésped es un factor importante para poder comprender los ciclos de transmisión de patógenos y uno que los sistemas de alimentación artificial pueden ayudar a responder11. También es posible cuantificar el número exacto de transmisión de un patógeno durante una alimentación en lugar de simplemente examinar el éxito de la transmisión y el establecimiento en un huésped 8,12.
Algunas de las primeras membranas artificiales de alimentación hechas para garrapatas duras estaban hechas de pieles de animales o membranas derivadas de animales en las décadas de 1950 y 196013,14. Debido a la naturaleza biológica de estas membranas, hubo problemas tanto con la producción de nuevas membranas como con la vida útil. En la década de 1990, se desarrollaron membranas totalmente artificiales que utilizaban un respaldo de red, papel o tela con impregnación de silicona15,16. La silicona era ideal ya que sus propiedades físicas imitan la elasticidad de la piel y su ligera pegajosidad, junto con su naturaleza bioinherente. Basándose en esto, Krober y Guerin, en cuyo trabajo se basó esta técnica, describieron una técnica de alimentación por membrana de rayón impregnada de silicona para la alimentación artificial de I. ricinus17.
El refinamiento de los métodos para I. scapularis, una especie estrechamente relacionada, ha llevado a diferencias notables en la dureza de la silicona utilizada en la impregnación de membranas, la receta para la producción de membranas, las dimensiones de la cámara y el estimulante de fijación. Si bien los refinamientos reportados en este estudio han resultado en características de membrana similares a las reportadas por Andrade et al., quienes también desarrollaron una membrana a base de silicona basada en Krober y Guerin para su uso en I. scapularis, existe una diferencia en los pasos de impregnación de silicona, lo que permite la flexibilidad de utilizar este protocolo para etapas de vida inmaduras de I. scapularis 15, 18. Este estudio también describe adiciones y alteraciones técnicas basadas en el uso repetido de este método, las mejores prácticas que resultan en una alimentación exitosa y la solución de problemas que puedan surgir. Este método ha sido utilizado para alimentar todas las etapas activas de la vida, infectar garrapatas con bacterias patógenas y exponer garrapatas a múltiples dosis de antibióticos19,20. Si bien el método de alimentación por membrana artificial que se muestra es para I. scapularis, este método es fácilmente adaptable a otras especies de garrapatas con modificaciones menores en el grosor de la membrana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>00-10 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-10</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>00-50 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-50</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Mold Star 30</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1852-1VL</td>
			<td>Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DBB500</td>
			<td>Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clingwrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-790-2C</td>
			<td>Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2871</td>
			<td>Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>139386-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td>100% rayon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin &#160;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-750-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S37440&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 &#181;g/mL of streptomycin, and 25 &#181;g/mL of Amphotericin B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagostimulant</td>
			<td>Made in House</td>
			<td></td>
			<td>Collected from prior tick feeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8585K204&#160;</td>
			<td>Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber O-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K38&#160;</td>
			<td>5 mm thick, 1.25 inch inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft touch forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470315-238&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unryu paper&#160;</td>
			<td>Art supply stores</td>
			<td></td>
			<td>mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis

Las garrapatas y sus enfermedades asociadas son un tema importante de estudio debido a su salud pública y carga veterinaria. Sin embargo, los requisitos de alimentación de las garrapatas durante el estudio y la crianza pueden limitar las preguntas experimentales o la capacidad de los laboratorios para investigar las garrapatas y sus patógenos asociados. Un sistema de alimentación por membrana artificial puede reducir estos problemas y abrir nuevas vías de investigación que pueden no haber sido posibles con los sistemas tradicionales de alimentación animal. Este estudio describe un sistema de alimentación por membrana artificial que ha sido refinado para el éxito de la alimentación y la congestión para todas las etapas de la vida de Ixodes scapularis . Además, el sistema de alimentación por membrana artificial descrito en este estudio se puede modificar para su uso con otras especies de garrapatas a través del simple refinamiento del grosor de la membrana deseado. Los beneficios de un sistema de alimentación por membrana artificial se ven contrarrestados por la intensidad de mano de obra del sistema, los factores ambientales adicionales que pueden afectar el éxito de la alimentación y la necesidad de refinar la técnica para cada nueva especie y etapa de vida de las garrapatas.

Una alimentación exitosa depende de si se desea una congestión parcial o total. Alimentado con éxito I. scapularis se vuelve un tono de gris metálico para adultos y se separa por sí solo de la membrana. Sin embargo, si son al menos del tamaño de un guisante, pueden desprenderse de la membrana al terminar la alimentación. Para las etapas inmaduras de I. scapularis , el tamaño de las garrapatas completamente hinchadas varía, y debido a que, a diferencia de los adultos, no exhiben un cambio de col...

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Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Aquí se presenta un método para alimentar garrapatas con sangre in vitro a través de un sistema de membrana artificial para permitir la congestión parcial o total de una variedad de etapas de la vida de las garrapatas.

Alimentación por membrana artificial contra garrapatas para Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

Si bien la alimentación por membrana artificial se ha realizado antes, nuestro protocolo es más simple de configurar y adaptable a otras especies de garrapatas con algunas modificaciones. La principal ventaja de la alimentación artificial por membrana es que permite la exposición a patógenos y tratamientos que pueden no ser factibles a través de la alimentación animal. Este sistema de alimentación por membrana artificial se puede aplicar a otras especies de artrópodos con algunas pruebas de fagostimulantes ideales y modificaciones en el grosor ideal de la membrana.Producir el grosor de membrana correcto requiere algo de práctica. Asegúrese de usar un micrómetro para medir el grosor en varios lugares de la membrana. Benjamin Cull, un postdoctorado en nuestro laboratorio me ayudará a demostrar el procedimiento.Para comenzar, limpie una superficie plana y no porosa, como un panel de vidrio o una base de metal recubierta de cerámica de un soporte de brazo con 70% de etanol y luego cúbrala con una sola capa de envoltura de plástico. Asegúrese de que la envoltura de plástico sea plana y sin burbujas ni arrugas. Pegue papel de limpieza de lentes de rayón al 100% a la superficie preparada.Asegúrese de que sea plano y ligeramente tenso con cinta adhesiva en los cuatro lados del papel. Prepare la mezcla de silicona de dureza 0010 midiendo cinco mililitros de cada parte del kit de silicona en un recipiente desechable. Mezcle ligeramente los dos líquidos y agregue 1.5 mililitros de hexano.Continúe mezclando hasta que la mezcla sea homogénea y esté bien mezclada. Use una pequeña escobilla para distribuir la mezcla de silicona sobre el papel de la lente y déjela reposar durante un minuto para asegurarse de que la silicona se haya empapado en el papel de la lente. De manera constante, raspe el exceso de silicona hacia un lado con la escobilla usando una pequeña cantidad de presión hacia abajo.Realice una segunda pasada con la escobilla sin ejercer la presión hacia abajo para eliminar cualquier línea de silicona y producir una capa lisa. Solo para larvas, sumerja la parte superior de la cámara de alimentación en resina de fluoropolímero Fluon varias veces, lo que permite que se seque entre aplicaciones para producir una capa consistente. Deje que la membrana se cure durante al menos 24 horas en un ambiente libre de polvo, como un gabinete cerrado de productos químicos o de bioseguridad.A continuación, mezcle partes iguales de la mezcla de silicona A y B para preparar la mezcla de silicona de 30 durezas para unir las cámaras a la membrana. Sumerja las cámaras de policarbonato aproximadamente un cuarto de pulgada en la mezcla de silicona y luego colóquelas en la lámina de membrana, teniendo cuidado de no superponerse a ninguna de las cintas. Deje que la silicona adherida se cure durante al menos 24 horas.Usando un bisturí, corte cuidadosamente la membrana alrededor de cada una de las cámaras adjuntas, recortando los bordes para que pueda encajar suavemente en un pozo de la placa de seis pozos sin mucho raspado en los lados. Permita suficiente material fuera de la cámara para maximizar la adición de la membrana. Corte un pequeño trozo de la membrana sobrante de cada esquina y el centro de la lámina de membrana.Retire la envoltura de plástico de cada pieza y mida las piezas con un micrómetro para determinar el grosor promedio de la membrana. Coloque las cámaras de alimentación junto con una junta tórica por cámara en un vaso de precipitados de vidrio para esterilizarlas en autoclave a 121 grados centígrados durante al menos 20 minutos para esterilizarlas. Deje que las cámaras se enfríen antes de usarlas.Después de sacar las cámaras de membrana preparadas en autoclave y colocar la junta tórica alrededor de ellas, llene cada cámara con suficiente etanol al 70% para cubrir la membrana. Déjelo reposar en una placa de seis pocillos durante cinco minutos y luego busque cualquier fuga entre la cámara y la membrana y en la membrana misma. Vacíe el etanol de las cámaras y luego déjelo secar al aire dentro de un gabinete de bioseguridad o campana de flujo laminar.Para calentar y activar el complemento en la sangre, caliéntelo a 56 grados centígrados durante 40 minutos y complemente la sangre bovina desfibrilada mecánicamente con dos gramos por litro de glucosa. Una vez que la membrana esté seca, aplique alrededor de 20 microlitros de fagostimulante en el interior de la cámara e incline la cámara para extenderla alrededor de la superficie. Cuando el fagostimulant esté seco, agregue rápidamente las garrapatas a la cámara con un cepillo o fórceps.Selle la parte superior con parafilm ya que el calor del baño de agua puede hacer que se rasgue. Luego agregue cinco mililitros del calor y la sangre activada por pocillo o cámara en un tubo cónico y colóquelo en el baño de agua a 36 grados centígrados. Agregue cinco microlitros de ATP milimolar y 50 microlitros de 100X stock de fungizona de estreptomicina penicilina por cinco mililitros de sangre al tubo y transfiera 4.5 mililitros de sangre a un pocillo de una placa de seis pocillos.Coloque suavemente la cámara en el pozo, ajustando la altura de la junta tórica en la cámara para que la membrana se asiente en la sangre, pero el nivel de sangre alrededor del lado no sobrepase el pozo. Luego coloque el pozo en la sangre en ángulo para evitar la formación de burbujas de aire entre la sangre y la membrana. Coloque la tapa de la placa de seis pocillos en la parte superior de las cámaras de alimentación.Coloque la placa de seis pozos con cámaras en el baño de agua preparado a 34 grados centígrados y la tapa. Agregue cinco microlitros de tres milimolares ATP y 50 microlitros de 100X stock de penicilina estreptomicina fungizona por pocillo al tubo de sangre y transfiera 4.5 mililitros de sangre a un pocillo de una placa fresca de seis pocillos como se mostró anteriormente. Saque la placa de seis pozos con la cámara de garrapatas del baño de agua y retire la cámara del pozo.Enjuague el exterior de la cámara y la membrana con 10 mililitros de PBS 1X esterilizado para eliminar la sangre. Con papel de filtro esterilizado en autoclave, seque suavemente la membrana y la cámara para eliminar el exceso de PBS. Si hay mucha condensación dentro de la cámara, seque los puntos húmedos con papel de filtro esterilizado en autoclave antes de sellarlo con parafilm nuevo.Luego reemplace el parafilm en la parte superior de la cámara. Coloque la cámara de garrapatas en la nueva placa de seis pocillos con sangre fresca, ajustando la altura de la junta tórica si es necesario. Repita estos pasos para cada cámara de la placa.Finalmente, coloque la tapa de la placa de seis pozos sobre la parte superior de las cámaras y mueva la nueva placa de seis pozos nuevamente al baño de agua de 34 grados centígrados. Aquí se muestra un alimento continuo con ninfas ixodes scapularis parcialmente hinchadas. Los puntos negros o marrones alrededor de los sitios de unión son la escarcha que se puede recolectar durante y después de la alimentación para hacer el fagostimulante.Las ninfas ixodes scapularis parcialmente hinchadas se ven unidas a la membrana. Una cáscara del moho de larvas hinchadas también se puede ver aquí. Los números de congestión de garrapatas y los pesos de masa de huevos se presentan en esta tabla.Las condiciones experimentales de congestión larvaria y ninfal tenían homogeneizado de órganos de ciervo agregado a la sangre, además de los suplementos utilizados en esta técnica. Aquí, la congestión exitosa se definió como garrapatas hinchadas que mudaban con éxito a la siguiente etapa en vivo o hembras hinchadas que ponían huevos con éxito. Se necesita práctica para obtener un grosor aceptable al aplicar silicona al papel de la lente, por lo que siempre es importante medir el grosor de la membrana antes de usarla.La alimentación por membrana puede exponer a las garrapatas a patógenos o antibióticos. Los efectos de estos en aspectos de la biología de las garrapatas, como el éxito de la muda, la puesta de huevos y la supervivencia, se pueden evaluar después de la alimentación.

Research

JoVE Journal

Biology

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Prueba de tolerancia a la nicotina en los áfidos El uso de un experimento de una dieta artificial

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Investigación

Biología

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Preparación de la bicapa artificial para experimentos de electrofisiología

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Recolección y enfriamiento Cryo-cristales de proteínas de membrana cultivadas en mesofases lipídicas para la Determinación de la estructura por cristalografía macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Microperfusión Técnica de investigar Reglamento de Microvessel Permeabilidad en Rata Mesenterio

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

La alimentación de las larvas de pez cebra paradigma para la alta en grasas: Alimentación, imágenes en vivo, y Cuantificación de la ingesta de alimentos

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

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La proyección de imagen de resolución súper Estado de agotamiento de la tierra en células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...