Name: tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

1. Förbereda fästmembrankammaren
<ol><li>Förbered en plan, icke-porös yta, t.ex. ett plan av glas eller en keramiskt belagd metallbas på ett armstativ genom att torka av det med 70% etanol och täck det sedan med ett enda lager plastfolie, se till att plastfolien är platt och utan bubblor eller rynkor (se figur 1A).</li>
	<li>Tejpa fast 100 % av rengöringspapperet för rayonlinser på den förberedda ytan. Se till att den är platt och något spänd med tejp över a...

<ol>
	<li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vital+signs:+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories,+2004-2016.">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li><li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+(Rhipicephalus+microplus)+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer.">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 188 (2014).</li><li>S&#252;ss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+makes+ticks+tick?+Climate+change,+ticks,+and+tick-borne+diseases.">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li><li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Pe&#241;a, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe.">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).</li><li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of Ticks. , (1991).</li><li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding.">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li><li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice.">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li><li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system.">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).</li><li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory.">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li><li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers.">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li><li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system.">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li><li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen.">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li><li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+(Canestrini,+1887)+(Ixodidae:+Acarina)+on+the+embyonated+hen+egg.">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li><li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature,+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+(Canestrini)+larvae+to+skin+slices.">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks.">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li><li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro.">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li><li>Kr&#246;ber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks.">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li><li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+(Ixodida:+Ixodidae).">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae)+by+membrane+feeding.">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li><li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+(Acari:+Ixodidae).">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li><li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time.">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li><li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment,+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis.">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li><li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States,+2013-2019.">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li><li>Gonz&#225;lez, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks.">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li><li>Kr&#243;l, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding.">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).</li><li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+ticks.">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li></ol>

Artificiell membranmatning av fästingar ger ett användbart verktyg för en mängd olika experimentella förfaranden, men kommer sannolikt inte att ersätta djurfoder för alla applikationer. Att upprätthålla stora kolonier av fästingar i alla livsstadier utan djurfoder är i allmänhet ohållbart. I stället är det artificiella utfodringssystemet värdefullt för andra ändamål, såsom att infektera fästingar med patogener som inte stöds av modellvärdar, utvärdera effekterna av kontrollerade doser av förening...

Fästingburna sjukdomar påverkar starkt människors och djurs hälsa över hela världen och ansvarar för mer än två tredjedelar av alla vektorassocierade sjukdomar i USA från 2004 till 20161. Dessutom har antalet fall ökat de senaste åren, med fler människor och boskap som drabbats av fästingar och deras associerade sjukdomar 2,3. Även om det sannolikt finns många orsaker till den uppåtgående trenden i antalet fall, är det förändrade klimatet en viktig faktor 3,4. Den förutspådda pågående ökningen av antalet fästingburna sjukdomsfall understryker behovet av att utveckla nya verktyg för att undersöka relationerna mellan fästingar och de patogener de överför.
Det är känt att fästingar genomgår förändringar i fysiologi och genuttryck under utfodring och att dessa förändringar spelar en roll i patogenöverföring 5,6. Det kan vara svårt att utföra studier som undersöker effekterna av fullständig och partiell utfodring på överföring och förvärv av patogener med hjälp av djurmodeller, särskilt i situationer där gnagarmodeller inte är mottagliga för infektion av en viss patogen. Till exempel överförs Anaplasma phagocytophilum Variant-1-stammen naturligt mellan Ixodes scapularis och rådjur men kan inte infektera möss, vilket komplicerar fästinginfektion i labbet7. Konstgjorda matningssystem kan också användas för att studera patogener som Borrelia burgdorferi via användning av transgena mutanter som har gendeletioner som hämmar överföring eller infektion8. Att använda ett artificiellt matningssystem hjälper forskare att isolera genernas roll genom att tillåta infektion eller överföring att endast ske på fästingens sida och därigenom isolera eventuella värdsvar som kan förvirra sådana studier.
På samma sätt kan vissa livsstadier av fästingar som är involverade i sjukdom och djuröverföring inte induceras att mata på vanliga laboratoriemodellarter. Ixodes scapularis honor, till exempel, måste matas på större djur, vanligtvis kaniner9. Även om de ofta är tillgängliga för laboratorieförsök, överstiger de administrativa och djurhållningskraven för att använda kaniner de för små gnagare och kan vara oöverkomliga för vissa laboratorier. Andra fästingarter, särskilt de som är av veterinärmedicinsk betydelse, måste utfodras med nötkreatur eller andra stora djur som inte är praktiska att använda i de flesta laboratorier. In vitro-utfodrings - och infektionsmetoder, såsom artificiell membranmatning, ger alternativ till att använda stora eller exotiska värddjur.
Dessutom möjliggör användningen av ett artificiellt utfodringssystem vissa analyser som kanske inte är möjliga med traditionella djurfodermetoder. Ett sådant exempel är att genom att separera blodkällan från matningsmekanismen blir undersökning av den roll som olika värdars blod kan ha vid B. burgdorferi-överföring möjlig10. Denna undersökning av värdblod och den roll blodet själv spelar i frånvaro av värdens immunsvar är en viktig faktor för att kunna förstå patogenöverföringscykler och en som artificiella matningssystem kan hjälpa till att svarapå 11. Det blir också möjligt att kvantifiera de exakta överföringsnumren för en patogen under en matning snarare än att bara undersöka överföringsframgång och etablering i en värd 8,12.
Några av de första konstgjorda matningsmembranen gjorda för hårda fästingar gjordes av djurskinn eller membran av animaliskt ursprung på 1950- och 1960-talet13,14. På grund av dessa membrans biologiska natur fanns det problem med både produktion av nya membran och hållbarhet. På 1990-talet utvecklades helt konstgjorda membran som använde en baksida av nät, papper eller tyg med silikonimpregnering15,16. Silikon var idealiskt eftersom dess fysikaliska egenskaper efterliknar hudens stretchighet och lätt klibbighet, tillsammans med dess bioinneboende natur. Baserat på detta beskrev Krober och Guerin, vars arbete denna teknik baserades på, en silikonimpregnerad rayonmembranmatningsteknik för artificiell utfodring av I. ricinus17.
Förfining av metoderna för I. scapularis, en närbesläktad art, har lett till anmärkningsvärda skillnader i hårdheten hos silikon som används vid membranimpregnering, receptet för membranproduktion, kammarens dimensioner och fäststimulansen. Medan de förbättringar som rapporterats i denna studie har resulterat i liknande membranegenskaper som de som rapporterats av Andrade et al., som också utvecklade ett silikonbaserat membran baserat på Krober och Guerin för användning i I. scapularis, finns det en skillnad i silikonimpregneringsstegen, vilket möjliggör flexibiliteten att använda detta protokoll för omogna livsstadier av I. scapularis15, 18. Denna studie beskriver också tillägg och tekniska ändringar baserat på upprepad användning av denna metod, bästa praxis som resulterar i ett framgångsrikt flöde och felsökning av problem som kan uppstå. Denna metod har använts för att mata alla aktiva livsstadier, infektera fästingar med patogena bakterier och utsätta fästingar för flera doser antibiotika19,20. Medan den konstgjorda membranmatningsmetoden som visas är för I. scapularis, är denna metod lätt anpassningsbar till andra arter av fästingar med mindre modifieringar i membrantjocklek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>00-10 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-10</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>00-50 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Ecoflex 00-50</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 Hardness Silicone</td>
			<td>Smooth-On</td>
			<td>Mold Star 30</td>
			<td>Trial size from Smooth-On Store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well cell culture plates</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A1852-1VL</td>
			<td>Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DBB500</td>
			<td>Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clingwrap</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-305654&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>09-790-2C</td>
			<td>Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene)</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>2871</td>
			<td>Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>139386-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td>100% rayon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin &#160;</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>N-750-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S37440&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin/fungizone</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 &#181;g/mL of streptomycin, and 25 &#181;g/mL of Amphotericin B)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phagostimulant</td>
			<td>Made in House</td>
			<td></td>
			<td>Collected from prior tick feeds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Pipe</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8585K204&#160;</td>
			<td>Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber O-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>9452K38&#160;</td>
			<td>5 mm thick, 1.25 inch inner diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft touch forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470315-238&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>cyanoacrylate glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unryu paper&#160;</td>
			<td>Art supply stores</td>
			<td></td>
			<td>mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tick artificial membrane feeding for ixodes scapularis

Fästingar och deras associerade sjukdomar är ett viktigt ämne för studier på grund av deras folkhälsa och veterinärbörda. Utfodringskraven för fästingar under både studier och uppfödning kan dock begränsa experimentella frågor eller laboratoriernas förmåga att undersöka fästingar och deras associerade patogener. Ett artificiellt membranmatningssystem kan minska dessa problem och öppna nya forskningsvägar som kanske inte har varit möjliga med traditionella djurfodersystem. Denna studie beskriver ett artificiellt membranmatningssystem som har förfinats för utfodring och mjölkstockningsframgång för alla Ixodes scapularis-livsstadier . Dessutom kan det artificiella membranmatningssystemet som beskrivs i denna studie modifieras för användning med andra fästingarter genom enkel förfining av den önskade membrantjockleken. Fördelarna med ett artificiellt membranmatningssystem uppvägs av systemets arbetsintensitet, de ytterligare miljöfaktorer som kan påverka utfodringsframgången och behovet av att förfina tekniken för varje ny art och livsstadium av fästingar.

En lyckad utfodring beror på om en partiell eller fullständig engorgement önskas. Framgångsrikt matad I. scapularis blir en nyans av gunmetal grå för vuxna och lossnar på egen hand från membranet. Men om de är minst ärtstorlek kan de lossna från membranet när utfodringen avslutas. För omogna stadier av I. scapularis varierar storleken för helt engorged fästingar, och eftersom de, till skillnad från vuxna, inte uppvisar en färgförändring, är lossning det bästa sättet att avgöra om ...

Watch this Scientific Journal Video about Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis at JoVE.com

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Här presenteras en metod för blodmatning av fästingar in vitro via ett artificiellt membransystem för att möjliggöra partiell eller fullständig mjölkstockning av en mängd olika fästinglivsstadier.

Markera konstgjord membranmatning för Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

Medan konstgjord membranmatning har gjorts tidigare är vårt protokoll enklare att ställa in och anpassningsbart till andra fästingarter med vissa modifieringar. Den största fördelen med artificiell membranmatning är att det möjliggör exponering för patogener och behandlingar som kanske inte är genomförbara via djurfoder. Detta artificiella membranmatningssystem kan appliceras på andra leddjursarter med viss testning för ideala fagostimulanter och modifieringar av idealisk membrantjocklek.Att producera rätt membrantjocklek kräver viss övning. Var noga med att använda en mikrometer för att mäta tjockleken på flera ställen på membranet. Benjamin Cull, postdoktor i vårt laboratorium hjälper mig att demonstrera proceduren.För att börja, torka av en plan, icke-porös yta som en glasruta eller keramisk belagd metallbas på ett armstativ med 70% etanol och täck den sedan med ett enda lager plastfolie. Se till att plastfolien är platt och utan bubblor eller rynkor. Tejpa fast rengöringspapper för 100 % rayonlins på den förberedda ytan.Se till att den är platt och något spänd med tejp över alla fyra sidor av papperet. Förbered 0010 hårdhet silikonblandning genom att mäta upp fem milliliter av varje del av silikonsatsen i en engångsbehållare. Blanda de två vätskorna lätt och tillsätt 1,5 ml hexan.Fortsätt blanda tills blandningen är homogen och noggrant blandad. Använd en liten skrapa för att fördela silikonblandningen över linspapperet och låt den stå i en minut för att säkerställa att silikonet har blött in i linspapperet. Skrapa stadigt överskottet av silikon åt sidan med skrapan med en liten mängd nedåttryck.Utför ett andra pass med skrapan utan att utöva det nedåtgående trycket för att ta bort silikonlinjer och producera ett jämnt lager. Endast för larver, doppa toppen av matningskammaren i Fluon-fluorpolymerharts flera gånger, så att den kan torka mellan appliceringarna för att producera ett konsekvent lager. Låt membranet härda i minst 24 timmar i en dammfri miljö som ett slutet kemikalie- eller biosäkerhetsskåp.Blanda sedan lika delar silikonblandning A och B för att förbereda silikonblandningen med 30 hårdhet för att fästa kamrarna på membranet. Doppa polykarbonatkamrarna ungefär en fjärdedel av en tum i silikonblandningen och placera dem sedan på membranarket, var försiktig så att du inte överlappar någon av banden. Låt den fästande silikonen härda i minst 24 timmar.Skär försiktigt membranet runt var och en av de bifogade kamrarna med en skalpell och trimma ner kanterna så att det kan passa smidigt i en brunn på de sex brunnsplattorna utan mycket skrapning på sidorna. Låt tillräckligt med material utanför kammaren för att maximera tillsatsen av membranet. Skär en liten bit av det kvarvarande membranet från varje hörn och mitten av membranarket.Ta bort plastfolien från varje bit och mät bitarna med en mikrometer för att bestämma den genomsnittliga membrantjockleken. Placera matningskamrarna tillsammans med en O-ring per kammare i en glasbägare som ska autoklaveras vid 121 grader Celsius i minst 20 minuter för att sterilisera. Låt kamrarna svalna innan du använder dem.Efter att ha tagit ut de förberedda, autoklaverade membrankamrarna och placerat O-ringen runt dem, fyll varje kammare med tillräckligt med 70% etanol för att täcka membranet. Låt den sitta i en sexbrunnsplatta i fem minuter och leta sedan efter eventuella läckor mellan kammaren och membranet och i själva membranet. Töm ut etanolen från kamrarna och låt den sedan lufttorka inuti ett biosäkerhetsskåp eller laminär flödeshuv.För att värma och aktivera komplementet i blodet, värm det vid 56 grader Celsius i 40 minuter och komplettera mekaniskt defibrillerat bovint blod med två gram per liter glukos. När membranet är torrt, applicera cirka 20 mikroliter fagostimulant på insidan av kammaren och luta kammaren för att sprida den runt ytan. När fagostimulanten är torr, lägg snabbt till fästingarna i kammaren med antingen en borste eller pincett.Försegla toppen med parafilm eftersom värmen från vattenbadet kan få den att riva. Tillsätt sedan fem milliliter värme och aktiverat blod per brunn eller kammare i ett koniskt rör och placera det i vattenbadet inställt på 36 grader Celsius. Tillsätt fem mikroliter tre millimolar ATP och 50 mikroliter 100X lager av penicillin, streptomycin, fungizone per fem milliliter blod till röret och överför 4,5 ml blod till en brunn på en sexbrunnsplatta.Placera försiktigt kammaren i brunnen och justera O-ringhöjden på kammaren så att membranet sitter i blodet, men blodnivån runt sidan inte överträffar brunnen. Placera sedan brunnen i blodet i en vinkel för att undvika luftbubbelbildning mellan blodet och membranet. Placera locket på den sex brunnsplattan ovanpå matningskamrarna.Sätt den sex brunnsplattan med kamrar i det förberedda 34 grader Celsius vattenbadet och locket. Tillsätt fem mikroliter tre millimolar ATP och 50 mikroliter 100X lager av penicillin, streptomycin, fungizone per brunn till blodröret och överför 4,5 ml blod till en brunn av en ny sexbrunnsplatta, som visats tidigare. Ta ut sexbrunnsplattan med fästkammaren från vattenbadet och ta bort kammaren från brunnen.Skölj utsidan av kammaren och membranet med 10 ml steriliserad 1X PBS för att avlägsna blodet. Använd autoklaverat filterpapper, torka försiktigt membranet och kammaren för att ta bort överflödigt PBS. Om det finns mycket kondens inuti kammaren, torka de våta fläckarna med autoklaverat filterpapper innan du förseglar det med ny parafilm.Byt sedan ut parafilmen på toppen av kammaren. Placera fästkammaren i den nya sexbrunnsplattan med färskt blod, justera O-ringens höjd om det behövs. Upprepa dessa steg för varje kammare på plattan.Slutligen placera locket på sexbrunnsplattan över toppen av kamrarna och flytta den nya sexbrunnsplattan tillbaka till 34 grader Celsius vattenbad. Ett pågående flöde med delvis engorged ixodes scapularis nymfer visas här. De svarta eller bruna prickarna runt fästplatserna är frosten som kan samlas under och efter matningen för att göra fagostimulanten.Delvis engorged ixoder scapularis nymfer ses fästa vid membranet. Ett skal av den engorged larvae mögel kan också ses här. Fästingens engorgementnummer och äggmassavikter presenteras i denna tabell.Larv- och nymphal engorgement experimentella förhållanden hade hjortorganhomogenat tillsatt till blodet utöver de kosttillskott som används i denna teknik. Här definierades framgångsrik engorgement som antingen engorged fästingar som framgångsrikt smälte till nästa levande scen eller engorged honor som framgångsrikt lade ägg. Det krävs övning för att få acceptabel tjocklek när man applicerar silikon på linspapperet, så det är alltid viktigt att mäta membranets tjocklek före användning.Membranmatning kan utsätta fästingar för patogener eller antibiotika. Effekterna av dessa på aspekter av fästingbiologi som smältframgång, äggläggning och överlevnad kan bedömas efter matning.

Research

JoVE Journal

Biology

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Testa Nikotin Tolerans i Bladlöss med konstgjord Diet experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Beredning av Artificiell bilayers för elektrofysiologi Experiment

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Kristalliserande Membrane proteiner för strukturbestämning med Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Användning av en robot för hög kapacitet Kristallisering av membranproteiner i lipidisk mesofaser

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Avverkning och Cryo-kylning Kristaller av membranproteiner som odlas i lipida mesofaser för strukturbestämning genom Makromolekylär kristallografi

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Mikroperfusionskammarens Teknik för att undersöka Reglering av mikrokärls permeabilitet i Rat krös

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Fettrik Utfodring Paradigm för Larvernas Zebrafish: Feeding, Live avbildning och kvantifiering av matkonsumtionen

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Grundtillståndet utarmning super resolution Imaging i däggdjursceller

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...