Name: isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles at JoVE.com

Cellesortering blev udført på FACS Core Facility, Aarhus Universitet, Danmark. Figurer blev oprettet ved hjælp af Biorender.com. Vi takker Dr. J. Farup for at dele kanin-anti-PDGFRa-antistoffet. Dette arbejde blev støttet af en AUFF Starting Grant til E.P. og Start Package bevillinger fra NovoNordiskFonden til E.P. (0071113) og til A.D.M. (0071116).

Denne protokol er udført i overensstemmelse med Aarhus Universitets retningslinjer for dyrepleje og lokale etiske regler.
BEMÆRK: Sørg for at overholde reglerne fra den lokale etiske komité for dyreforsøg og håndtering af post mortem gnaverprøver. Mus er en potentiel kilde til allergener; Hvis det er tilgængeligt, skal du tænde for udstødningsventilation og placere det over arbejdsområdet for at undgå overdreven eksponering for allergener. Alternativt kan du bære en ansigtsmaske, ...

<ol>
	<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence.">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).</li><li>Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+and+signaling+in+the+muscle+stem+cell+niche.">Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche.</a> Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li><li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration.">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li><li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration.">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration.">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li><li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells.">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+Is+Required+for+the+Specification+of+Myogenic+Satellite+Cells.">Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration.">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li><li>Fukada, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle.">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Joe, A., Wang, J., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+adipogenic+progenitors+from+skeletal+muscle.">Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).</li><li>Yi, L., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+progenitors+from+skeletal+muscle.">Purification of progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).</li><li>Sherwood, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors:+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle.">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119 (4), 543-554 (2004).</li><li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration.">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li><li>Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-analysis+and+FACS+sorting+of+adult+muscle+fiber-associated+stem/precursor+cells.">Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells.</a> Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).</li><li>de Morree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+Pax3+controls+muscle+stem+cell+fate+and+muscle+function.">Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function.</a> Science. 366 (6466), 734-738 (2019).</li><li>Stuelsatz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraocular+muscle+satellite+cells+are+high+performance+myo-engines+retaining+efficient+regenerative+capacity+in+dystrophin+deficiency.">Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency.</a> Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).</li><li>Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+hydrolysis+of+collagen-like+peptides+by+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+evidence+for+both+endopeptidase+and+tripeptidylcarboxypeptidase+activities.">Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities.</a> Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Baghdadi, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signalling+by+Notch-Collagen+V-CALCR+retains+muscle+stem+cells+in+their+niche.">Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche.</a> Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).</li><li>van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+quiescent+muscle+stem+cells+in+vivo.">Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo.</a> Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-IRG+consortium+isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits.">SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).</li><li>Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyancy-activated+cell+sorting+using+targeted+biotinylated+albumin+microbubbles.">Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles.</a> PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).</li><li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1.">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li><li>Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+transcriptomic+atlas+characterizes+ageing+tissues+in+the+mouse.">A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse.</a> Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).</li><li>de Morr&#233;e, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence.">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li></ol>

Flere trin er nøglen til udførelsen af denne protokol for at opnå gode udbytter. De enkelte muskler har et lille volumen sammenlignet med mængden af muskler, der anvendes i bulkisoleringsprotokoller. Dette resulterer i en risiko for, at musklen tørrer ud under dissektionen, hvilket reducerer udbyttet. For at forhindre dette er det vigtigt at tilføje medium til musklerne umiddelbart efter dissektion. Hertil kommer, at hvis dissektion tager længere tid, kan huden fjernes fra et lem ad gangen for at reducere musklern...

Skeletmuskulatur har en høj kapacitet til regenerering på grund af tilstedeværelsen af muskelstamceller (MuSC'er). MuSC'er er placeret på myofibrene under basallamina og befinder sig i en hvilende tilstand af langvarig, reversibel cellecyklusudgang 1,2,3,4. Ved skade aktiveres MuSC'er og kommer ind i cellecyklussen for at give anledning til forstærkende forfædre, der kan differentiere og smelte sammen til dannelse af nye myofibre 2,5. Tidligere arbejde har vist, at MuSC'er er absolut afgørende for muskelregenerering 6,7,8. Desuden kan en enkelt MuSC indpode og generere både nye stamceller og nye myofibre9. Skeletmuskulatur har også en population af mesenkymale stromale celler kaldet fibro-adipogene forfædre (FAP'er), som spiller en afgørende rolle i at understøtte MuSC-funktionen under muskelregenerering 6,10,11,12.
På grund af deres potentiale til at koordinere muskelregenerering har der været enorm interesse for at forstå, hvordan MuSC'er og FAP'er fungerer. Hvilende MuSC'er er kendetegnet ved ekspression af transkriptionsfaktorerne Pax7 og Sprouty1 og celleoverfladeproteinet calcitoninreceptor, mens hvilende FAP'er er markeret med celleoverfladeproteinblodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa (PDGFRa)10,12,13,14,15. Tidligere undersøgelser har vist, at MuSC'er og FAP'er kunne renses fra skeletmuskler ved hjælp af celleoverflademarkører og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Mens disse protokoller i høj grad har avanceret evnen til at studere MuSC'er og FAP'er, er en ulempe, at de fleste af disse protokoller kræver isolering af MuSC'er fra en pulje af forskellige muskelvæv. Nyligt arbejde fra os og andre har afsløret forskelle i cellefænotype og genekspressionsniveauer mellem MuSC'er isoleret fra forskellige væv22,23. MuSC'er fra membranen, triceps og gracilis viser hurtigere aktivering end MuSC'er fra nedre bagbensmuskler22, mens MuSC'er fra ekstraokulær muskel viser hurtigere differentiering end MuSC'er fra membranen og nedre bagbenmuskler23.
Denne protokol beskriver isoleringen af MuSC'er og FAP'er fra individuelle skeletmuskler (figur 1). Dette omfatter dissektion af membranen, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA) og tyggemuskler. Dissekerede muskler dissocieres efterfølgende ved enzymatisk fordøjelse ved hjælp af collagenase II (en protease, der specifikt er rettet mod Pro-X-Gly-Pro-aminosekvensen i kollagen, hvilket muliggør nedbrydning af bindevæv og vævsdissociation24) og dispase (en protease, der spalter fibronectin og kollagen IV, hvilket muliggør yderligere celledissociation25). MuSC'er og FAP'er isoleres fra enkeltcellesuspensioner af FACS. Som eksempler på nedstrømsassays til celleanalyse bestemmes stamcelleaktivering ved assay af 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) inkorporering, mens cellerenhed bestemmes ved immunofluorescensfarvning for de celletypespecifikke markører Pax7 og PDGFRa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile )</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>72.706.700</td>			
<td>1.5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.554.502</td>			
<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round-bottom tube</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>352054</td>			
<td>FACS tube without strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
<td>352235</td>			
<td>FACS tube with strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube (PP, non sterile autoclavable)</td>
			
			<td>VWR collection</td>
<td>525.0946</td>			
<td>5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.547.254</td>			
<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2420713 (Cat#A31571)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA 3</td>
			
			<td>BD</td>
<td></td>			
<td>FACS, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			
			<td>eppendorf</td>
<td>EP022628188</td>			
<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td>			
<td>Cell Proliferation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf-skin&#160;</td>
			
			<td>Bioreagent, Sigma Aldrich&#160;</td>
<td>Source: SLCK6209 (Cat# C8919)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			
			<td>Worthington, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 40H20248 (cat# L5004177 )</td>			
<td>Collagenase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )</td>			
<td>Dispase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum (non-sterile)</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 5, 110 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.327</td>			
<td>Straight forceps with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 7, 115 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.335</td>			
<td>Curved forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2453614 (cat# 31550-023)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD31</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse CD45</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>30-F11 (Cat# 103108)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (100%)</td>
			
			<td>EMSURE, Merck&#160;&#160;</td>
<td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head over head mini-tube rotator&#160;</td>
			
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
<td>15534080 (Model no. 88861052)</td>			
<td>Head over head mini-tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2482639 (cat# 10368902 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp SWB 15</td>
			
			<td>FisherBrand, Fisher Scientific</td>
<td>15325887</td>			
<td>Shaking water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS2 mini-shaker&#160;</td>
			
			<td>IKA&#160;</td>
<td></td>			
<td>Vortex unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm)</td>
			
			<td>BD microlance, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>304827</td>			
<td>20G needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral formalin buffer 10%</td>
			
			<td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-pyrogenic cell strainer (40 &#181;M)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3945.040</td>			
<td>Cell strainer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>D7 (Cat# 108120)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 primary antibody</td>
			
			<td>DSHB</td>
<td>Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x powder concentrate</td>
			
			<td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 163589 (cat# 11548876 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p10</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2140-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p1000</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2279-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p20</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2149P-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p200</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2069-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective underpad</td>
			
			<td>Abena&#160;</td>
<td>ACTC-7712</td>			
<td>&#160;60 x 40cm, 8 layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin, pipet-lite XLS</td>
			
			<td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&#160;</td>
<td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td>			
<td>Pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PDGFR-alpha</td>
			
			<td>RabMAb, abcam</td>
<td>AB134123</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (shaft no. 3)</td>
			
			<td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.502</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 11</td>
			
			<td>Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.0911</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanlaf mars</td>
			
			<td>Labogene</td>
<td>class 2 cabinet: Mars</td>			
<td>Flow bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanR</td>
			
			<td>Olympus</td>
<td></td>			
<td>Microscope, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			
			<td>FST</td>
<td>14568-09</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series 8000 DH</td>
			
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>3540-MAR</td>			
<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			
			<td>VWR</td>
<td>612-3700</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			
			<td>VWR, Avantor delivered by VWR</td>
<td>612-3702</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile&#160;</td>
			
			<td>BD Emerald, Fisher Scientific</td>
<td>307731</td>			
<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, standard</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3902</td>			
<td>Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20</td>
			
			<td>Corning, Sigma Aldrich</td>
<td>3764</td>			
<td>96-well Half bottom plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td>			
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles

Skeletmuskulatur har forskellige populationer af voksne stamceller, der bidrager til homeostase og reparation af vævet. Skeletmuskulaturstamceller (MuSC'er) har evnen til at lave nye muskler, mens fibro-adipogene stamceller (FAP'er) bidrager til stromale understøttende væv og har evnen til at fremstille fibroblaster og adipocytter. Både MuSC'er og FAP'er befinder sig i en tilstand af langvarig reversibel cellecyklusudgang, kaldet hvile. Den hvilende tilstand er nøglen til deres funktion. Hvilende stamceller renses almindeligvis fra flere muskelvæv samlet sammen i en enkelt prøve. Nylige undersøgelser har imidlertid afsløret tydelige forskelle i molekylære profiler og hviledybde af MuSC'er isoleret fra forskellige muskler. Denne protokol beskriver isolering og undersøgelse af MuSC'er og FAP'er fra individuelle skeletmuskler og præsenterer strategier til at udføre molekylær analyse af stamcelleaktivering. Det beskriver, hvordan man isolerer og fordøjer muskler af forskellig udviklingsmæssig oprindelse, tykkelser og funktioner, såsom membran, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL) og tyggemusklerne. MuSC'er og FAP'er renses ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og analyseres ved immunofluorescensfarvning og 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) inkorporeringsassay.

Efter protokollen for individuel skeletmuskelisolering (figur 2) blev gracilis-, TA-, EDL-, GA-, soleus-, triceps-, tygger- og membranmusklerne isoleret fra tre schweiziske hanmus, der var blevet afbrudt fra et lokalt avlsprogram (figur 2). Efter vævsdissociation og antistoffarvning blev MuSC'er og FAP'er fra de enkelte muskler renset af FACS (figur 3). Den oprindelige gating blev opnået med en ufarvet prøve for at identificere c...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles at JoVE.com

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Denne protokol beskriver isoleringen af muskelstamceller og fibro-adipogene forfædre fra individuelle skeletmuskler hos mus. Protokollen involverer enkelt muskeldissektion, stamcelleisolering ved fluorescensaktiveret cellesortering, renhedsvurdering ved immunofluorescensfarvning og kvantitativ måling af S-faseindgang ved 5-ethynyl-2'-deoxyuridininkorporeringsassay.

Isolering af hvilende stamcellepopulationer fra individuelle skeletmuskler

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Denne protokol er vigtig, fordi den muliggør undersøgelse af stamcellefunktion på tværs af forskellige skeletmuskler og uddyber vores forståelse af, hvordan de bidrager til homeostase, regenerering og sygdomsprogression. Ved hjælp af denne protokol kan vi isolere to populationer af levende stamceller fra specifikke muskler og studere, hvordan de fungerer. For at begynde muskelisolering skal du sprøjte den aflivede mus ned med ethanol og placere den med maven opad.Brug en saks til at lave et 0,5 centimeter langt vandret snit i mavehuden. Brug begge hænder til at trække huden for at udsætte torsoen såvel som underekstremiteterne op til bagbenene. Find gracilis eller den indre lårmuskel og brug et par buede tang til at gribe fat i den og løft musklen lidt.Brug en saks til at lave et 0,5 centimeter snit for at skære gracilis muskelen ud. Gentag proceduren på det andet ben. Brug en skalpel til at skære fascia ved at lave et 0,5 centimeter snit langs sidesiden af skinnebenet.Tag derefter fat i fascia ved hjælp af buede tang og fjern den ved at trække og udsætte senerne i den distale ende af bagbenet. Indsæt derefter et par lige tang med superfine spidser mellem TA's distale sene og EDL-musklen. Adskil musklerne ved at glide tangen mod den proksimale ende af musklerne.Bring tangen tilbage til den distale ende og skær den distale sene. Tag forsigtigt fat i TA's distale sene med buede tang og løft musklen op og over dens proksimale fastgørelse. For forsigtigt at skære den proksimale sene skal du skære den anden ende tættest muligt på dens fastgørelse og overføre TA til en petriskål.Brug derefter den lige tang med superfine spidser til at gå under EDL's distale sene og skub tangen mod den proksimale ende af musklen for at adskille musklerne fra hinanden. Bring tangen tilbage til den distale ende og skær den distale sene uden at beskadige musklen. Ved forsigtigt at tage fat i den distale sener af EDL med buede tang, løft musklen op og over dens proksimale fastgørelse for forsigtigt at skære den proksimale sene så tæt på dens fastgørelse som muligt.Skær den anden ende og overfør EDL-musklen til en petriskål. Gentag proceduren for det andet bagben. Brug lige tang med superfine spidser til at nå ind mellem akillessenen og knoglerne i underbenene.Skub tangen mod den proksimale ende af musklen for at adskille musklen fra knoglerne. Bring tangen tilbage til den distale ende og skær den distale sene. Træk gastrocnemius eller GA-musklen op og over fibulaen.At lokalisere den proksimale soleus senen. Indsæt den lige tang mellem soleus og GA musklerne og flyt tangen mod den distale ende af musklerne for at adskille soleus fra GA. Skær nu den proksimale soleus sene. Tag fat i den med buet tang og løft forsigtigt sous for at få adgang til dens distale sene.Skær den distale sene for at isolere soleus fra GA og læg soleus i petriskålen, der indeholder vaskemediet. Skær derefter GA og læg den i petriskålen. For at isolere tricepsmusklen skal du bruge lige tang med superfine spidser til at nå ind mellem triceps og humerusbenet og glide tangen mod den proksimale ende af musklen for at adskille musklen fra knoglen.Skær derefter den distale ende af tricepsmusklen og træk den op og over albuen ved hjælp af buede tang for at få adgang til den proksimale sene. Skær triceps proksimale sene og overfør musklen til en petriskål. Gentag proceduren for de andre fire lemmer.For at fjerne pelsen og huden fra kæben skal du bruge en saks til at lave et 0,5 centimeter snit under øjet og skære i kaudale retninger. Brug derefter tommelfingrene og pegefingrene på begge hænder til at klemme på hver side af snittet og fjern huden ved at trække den opad og nedad. Find masseterens store sene i halesiden under øjet, og indsæt det flade skalpelblad mellem knoglen og musklen for at skære senen.Tag fat i den store massetersene med buede tang og klip den med et skalpelblad eller en saks i rostral retning for at adskille tyggemusklen fra kæbebenet. Placer den isolerede tyggemuskel i petriskålen og gentag proceduren for den anden massetermuskel. Brug en saks til at lave en thoracotomi midt på brystbenet og skære gennem brystbenet.Udsæt membranen ved at skære 360 grader gennem brystkassen. For at adskille overkroppen fra maven skal du bruge en saks til at skære gennem luftrøret, spiserøret, vena cava og abdominal aorta. Brug derefter en saks til at præforme en laparotomi en centimeter under brystbenet og lav et snit omkring 360 grader.Placer den lukkede saks mellem ribbenburet og maveorganerne og tryk ned. Træk forsigtigt i ribbenburet for at adskille det fra abdominale organer. For at adskille membranen fra ribbenburet skal du holde membranen løst mellem to fingre og skære gennem ribbenburet med en saks.Skær mellemgulvet så tæt på ribbenene som muligt omkring 360 grader og læg det isolerede mellemgulv i en petriskål. Hak de isolerede muskler en efter en ved at skære dem i stykker på cirka en millimeter. Overfør de hakkede muskler til et 15 liters konisk rør indeholdende fem liter dissociationsbuffer, og inkuber røret ved 37 grader Celsius i 35 minutter i et rystende vandbad med en hastighed på 60 rotationer pr. Minut.Efter enzymatisk fordøjelse af hakket muskler overføres suspensionen fra 15 ml røret til et 50 ml rør. Brug en 10 ml sprøjte udstyret med en 20 gauge nål til at genophænge prøven ved at trække den op og ned gennem nålen fem gange. Træk cellesuspensionen ind i sprøjten og sil prøven i et nyt 50 ml konisk rør udstyret med en cellesi ovenpå.For at hente alle mononukleerede celler vaskes det tomme koniske rør med 20 ml vaskemedie og hældes gennem silen for at kombinere med den anstrengte prøve. Hent det resterende volumen under cellesilen med en P1000-pipette. Efter vævsdissociation og antistoffarvning blev skeletmuskulaturens stamceller eller MuSC'er og fibroadipogene stamfædre eller FAP'er fra individuelle muskler renset ved fluorescensaktiveret cellesortering.Efter indledende gating for at identificere cellerne og adskille singlets fra dubletter, blev efterfølgende porte indstillet ved hjælp af FMO-kontroller til at identificere farvningstærskler. Pletprøven var indhegnet, og den SCA1-positive CD31-negative og CD45-negative population svarende til FAP'er blev sorteret i et separat opsamlingsrør. Den dobbelte negative population blev yderligere gated for at sortere den VCA-positive population svarende til MuSC'erne.Membran- og tricepsmuskel-enkeltcellesuspensionerne havde i modsætning til de andre en højere relativ overflod af MuSC'er end FAP'er. EDU-farvning, selvom den var robust, indikerede en forskel i fraktioner af EDU-positive celler for de to stamcelletyper og på tværs af de forskellige muskler. For alle væv var den gennemsnitlige fraktion af EDU-positive MuSC'er imidlertid højere end for EDU-positive FAP'er.MuSC'er isoleret fra EDL og GA viste signifikant lavere EDU-inkorporering sammenlignet med dem fra TA, membran, gracilis eller triceps. Tilsvarende blev der også observeret signifikant variation i EDU-inkorporering i FAP'er isoleret fra forskellige muskler. Endelig blev cellerenheden bekræftet med immunofluorescerende farvning, hvilket indikerer specificiteten af stamcelleisolationsprotokollen.Det mest kritiske trin er den mekaniske fordøjelse af vævet. Når vævet skæres for meget, falder levedygtigheden. Når vævet skæres for lidt, falder ålen.Protokollen kan kombineres med assays, der måler celleadfærd, såsom engraftment efter transplantation for bedre at forstå stamcellefunktioner in vivo. Denne teknik kan svare på, om forskelle i stamcelleadfærd inden for individuelle muskler kan bidrage til sygdomsfænotyper og sygdomme karakteriseret ved unikke mønstre af berørte muskler.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust Generering af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige embryonale stamceller populationer

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studere Proteolyse af cyclin B på enkelt celle niveau i hele cellepopulationer

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Isometrisk og Excentrisk styrkeopbygningsprocessen Vurdering af skeletmuskulatur isoleret fra murine modeller af muskeldystrofier

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering og dyrkning af individuelle myofibre og deres satellit celler fra voksne skeletmuskler

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering af blod-fartøj-afledt Multipotente Forstadier fra human skeletmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering Individuelle humane embryonale stamceller ved kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...