Name: isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles at JoVE.com

A triagem celular foi realizada no FACS Core Facility, Universidade de Aarhus, Dinamarca. As figuras foram criadas usando Biorender.com. Agradecemos ao Dr. J. Farup por compartilhar o anticorpo anti-PDGFRa do coelho. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção inicial da AUFF para E.P. e Start Package da NovoNordiskFonden para E.P. (0071113) e para A.D.M. (0071116).

O presente protocolo foi realizado de acordo com as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Aarhus e regulamentos de ética locais.
NOTA: Certifique-se de cumprir os regulamentos do comitê de ética local para experimentação animal e manuseio de amostras post-mortem de roedores. Os ratos são uma fonte potencial de alérgenos; Se disponível, ligue a ventilação de exaustão e coloque-a sobre o espaço de trabalho para evitar a exposição excessiva a alérgenos. Alternativam...

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	<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence.">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).</li><li>Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+and+signaling+in+the+muscle+stem+cell+niche.">Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche.</a> Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li><li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration.">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li><li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration.">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration.">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li><li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells.">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+Is+Required+for+the+Specification+of+Myogenic+Satellite+Cells.">Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration.">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li><li>Fukada, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle.">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Joe, A., Wang, J., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+adipogenic+progenitors+from+skeletal+muscle.">Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).</li><li>Yi, L., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+progenitors+from+skeletal+muscle.">Purification of progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-analysis+and+FACS+sorting+of+adult+muscle+fiber-associated+stem/precursor+cells.">Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells.</a> Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).</li><li>de Morree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+Pax3+controls+muscle+stem+cell+fate+and+muscle+function.">Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function.</a> Science. 366 (6466), 734-738 (2019).</li><li>Stuelsatz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraocular+muscle+satellite+cells+are+high+performance+myo-engines+retaining+efficient+regenerative+capacity+in+dystrophin+deficiency.">Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency.</a> Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).</li><li>Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+hydrolysis+of+collagen-like+peptides+by+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+evidence+for+both+endopeptidase+and+tripeptidylcarboxypeptidase+activities.">Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities.</a> Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Baghdadi, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signalling+by+Notch-Collagen+V-CALCR+retains+muscle+stem+cells+in+their+niche.">Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche.</a> Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).</li><li>van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+quiescent+muscle+stem+cells+in+vivo.">Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo.</a> Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-IRG+consortium+isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits.">SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).</li><li>Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyancy-activated+cell+sorting+using+targeted+biotinylated+albumin+microbubbles.">Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles.</a> PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).</li><li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1.">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li><li>Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+transcriptomic+atlas+characterizes+ageing+tissues+in+the+mouse.">A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse.</a> Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).</li><li>de Morr&#233;e, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence.">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li></ol>

Várias etapas são fundamentais na execução deste protocolo para alcançar bons rendimentos. Os músculos individuais têm um volume pequeno em comparação com a quantidade de músculo utilizada em protocolos de isolamento em massa. Isso resulta em um risco de o músculo secar durante a dissecção, o que reduz o rendimento. Para evitar isso, é importante adicionar meio aos músculos imediatamente após a dissecção. Além disso, se a dissecção estiver demorando mais, a pele pode ser removida de um membro de cada...

O músculo esquelético tem uma alta capacidade de regeneração devido à presença de células-tronco musculares (MuSCs). As MuSCs localizam-se nas miofibras, abaixo da lâmina basal, e residem em estado quiescente de saída prolongada e reversível do ciclo celular 1,2,3,4. Após a lesão, as MuSCs ativam-se e entram no ciclo celular para dar origem a progenitores amplificadores que podem se diferenciar e fundir-se para formar novas miofibras 2,5. Trabalhos anteriores mostraram que as CTms são absolutamente essenciais para a regeneração muscular 6,7,8. Além disso, uma única MuSC pode enxertar e gerar tanto novas células-tronco quanto novas miofibras9. O músculo esquelético também abriga uma população de células estromais mesenquimais denominadas progenitores fibroadipogênicos (PAFs), que desempenham papel crucial no suporte da função de MuSC durante a regeneração muscular 6,10,11,12.
Devido ao seu potencial para coordenar a regeneração muscular, tem havido um enorme interesse em entender como MuSCs e FAPs funcionam. MuSCs quiescentes são marcadas pela expressão dos fatores de transcrição Pax7 e Sprouty1 e do receptor de calcitonina da proteína de superfície celular, enquanto as FAPs quiescentes são marcadas pelo receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas da proteína de superfície celular (PDGFRa)10,12,13,14,15 . Estudos prévios mostraram que MuSCs e FAPs poderiam ser purificados de músculos esqueléticos usando marcadores de superfície celular e classificação celular ativada por fluorescência (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Embora esses protocolos tenham avançado muito a capacidade de estudar MuSCs e FAPs, uma desvantagem é que a maioria desses protocolos requer o isolamento de MuSCs de um pool de diferentes tecidos musculares. Trabalhos recentes nossos e de outros têm revelado diferenças no fenótipo celular e nos níveis de expressão gênica entre MuSCs isolados de diferentestecidos22,23. As CPm do diafragma, tríceps e grácil apresentam ativação mais rápida do que as CPm dos músculos dos membros posterioresinferiores 22, enquanto as CP das MuSC do músculo extraocular apresentam diferenciação mais rápida do que as CP do diafragma e dos músculos dos membros posterioresinferiores 23.
Este protocolo descreve o isolamento de MuSCs e FAPs de músculos esqueléticos individuais (Figura 1). Isso inclui a dissecção dos músculos diafragma, tríceps, grácil, tibial anterior (TA), sóleo, extensor longo dos dedos (EDL), gastrocnêmio (GA) e masseter. Os músculos dissecados são posteriormente dissociados por digestão enzimática utilizando colagenase II (protease que tem como alvo específico a sequência amino Pro-X-Gly-Pro no colágeno, possibilitando a degradação do tecido conjuntivo e dissociação tecidual24) e dispase (protease que cliva fibronectina e colágeno IV, possibilitando maior dissociação celular25). MuSCs e FAPs são isolados de suspensões de célula única por FACS. Como exemplos de ensaios a jusante para análise celular, a ativação de células-tronco é determinada pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), enquanto a pureza celular é determinada pela coloração por imunofluorescência para os marcadores específicos de tipo celular Pax7 e PDGFRa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile )</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>72.706.700</td>			
<td>1.5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.554.502</td>			
<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round-bottom tube</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>352054</td>			
<td>FACS tube without strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
<td>352235</td>			
<td>FACS tube with strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube (PP, non sterile autoclavable)</td>
			
			<td>VWR collection</td>
<td>525.0946</td>			
<td>5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.547.254</td>			
<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2420713 (Cat#A31571)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA 3</td>
			
			<td>BD</td>
<td></td>			
<td>FACS, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			
			<td>eppendorf</td>
<td>EP022628188</td>			
<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td>			
<td>Cell Proliferation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf-skin&#160;</td>
			
			<td>Bioreagent, Sigma Aldrich&#160;</td>
<td>Source: SLCK6209 (Cat# C8919)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			
			<td>Worthington, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 40H20248 (cat# L5004177 )</td>			
<td>Collagenase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )</td>			
<td>Dispase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum (non-sterile)</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 5, 110 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.327</td>			
<td>Straight forceps with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 7, 115 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.335</td>			
<td>Curved forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2453614 (cat# 31550-023)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD31</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse CD45</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>30-F11 (Cat# 103108)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (100%)</td>
			
			<td>EMSURE, Merck&#160;&#160;</td>
<td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head over head mini-tube rotator&#160;</td>
			
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
<td>15534080 (Model no. 88861052)</td>			
<td>Head over head mini-tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2482639 (cat# 10368902 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp SWB 15</td>
			
			<td>FisherBrand, Fisher Scientific</td>
<td>15325887</td>			
<td>Shaking water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS2 mini-shaker&#160;</td>
			
			<td>IKA&#160;</td>
<td></td>			
<td>Vortex unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm)</td>
			
			<td>BD microlance, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>304827</td>			
<td>20G needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral formalin buffer 10%</td>
			
			<td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-pyrogenic cell strainer (40 &#181;M)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3945.040</td>			
<td>Cell strainer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>D7 (Cat# 108120)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 primary antibody</td>
			
			<td>DSHB</td>
<td>Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x powder concentrate</td>
			
			<td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 163589 (cat# 11548876 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p10</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2140-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p1000</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2279-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p20</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2149P-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p200</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2069-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective underpad</td>
			
			<td>Abena&#160;</td>
<td>ACTC-7712</td>			
<td>&#160;60 x 40cm, 8 layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin, pipet-lite XLS</td>
			
			<td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&#160;</td>
<td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td>			
<td>Pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PDGFR-alpha</td>
			
			<td>RabMAb, abcam</td>
<td>AB134123</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (shaft no. 3)</td>
			
			<td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.502</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 11</td>
			
			<td>Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.0911</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanlaf mars</td>
			
			<td>Labogene</td>
<td>class 2 cabinet: Mars</td>			
<td>Flow bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanR</td>
			
			<td>Olympus</td>
<td></td>			
<td>Microscope, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			
			<td>FST</td>
<td>14568-09</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series 8000 DH</td>
			
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>3540-MAR</td>			
<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			
			<td>VWR</td>
<td>612-3700</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			
			<td>VWR, Avantor delivered by VWR</td>
<td>612-3702</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile&#160;</td>
			
			<td>BD Emerald, Fisher Scientific</td>
<td>307731</td>			
<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, standard</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3902</td>			
<td>Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20</td>
			
			<td>Corning, Sigma Aldrich</td>
<td>3764</td>			
<td>96-well Half bottom plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td>			
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles

O músculo esquelético abriga populações distintas de células-tronco adultas que contribuem para a homeostase e reparo do tecido. As células-tronco musculares esqueléticas (MuSCs) têm a capacidade de produzir novos músculos, enquanto os progenitores fibroadipogênicos (FAPs) contribuem para os tecidos de suporte estromais e têm a capacidade de produzir fibroblastos e adipócitos. Tanto MuSCs quanto FAPs residem em um estado de saída prolongada e reversível do ciclo celular, chamado quiescência. O estado quiescente é fundamental para sua função. As células-tronco quiescentes são comumente purificadas a partir de múltiplos tecidos musculares agrupados em uma única amostra. No entanto, estudos recentes têm revelado diferenças distintas nos perfis moleculares e na profundidade de quiescência de MuSCs isolados de diferentes músculos. O presente protocolo descreve o isolamento e estudo de MuSCs e FAPs de músculos esqueléticos individuais e apresenta estratégias para realizar análise molecular da ativação de células-tronco. Ele detalha como isolar e digerir músculos de diferentes origens de desenvolvimento, espessuras e funções, como diafragma, tríceps, grácil, tibial anterior (TA), gastrocnêmio (GA), sóleo, extensor longo dos dedos (EDL) e músculos masseteres. MuSCs e FAPs são purificados por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e analisados por coloração de imunofluorescência e ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU).

Seguindo o protocolo de isolamento individual da musculatura esquelética (Figura 2), os músculos grácil, AT, EDL, GA, sóleo, tríceps, masseter e diafragma foram isolados de três camundongos machos suíços de raça outbre que haviam sido descontinuados de um programa de melhoramento local (Figura 2). Após dissociação tecidual e coloração de anticorpos, MuSCs e FAPs dos músculos individuais foram purificados por FACS (Figura 3</st...

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Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco musculares e progenitores fibroadipogênicos de músculos esqueléticos individuais em camundongos. O protocolo envolve dissecção muscular única, isolamento de células-tronco por classificação de células ativadas por fluorescência, avaliação da pureza por coloração de imunofluorescência e medição quantitativa da entrada da fase S pelo ensaio de incorporação de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Isolamento de Populações de Células-Tronco Quiescentes de Músculos Esqueléticos Individuais

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Esse protocolo é significativo porque permite o estudo da função das células-tronco em diferentes músculos esqueléticos, aprofundando nossa compreensão de como elas contribuem para a homeostase, regeneração e progressão da doença. Usando esse protocolo, podemos isolar duas populações de células-tronco vivas de músculos específicos e estudar como elas funcionam. Para iniciar o isolamento muscular, borrife o camundongo eutanasiado com etanol e coloque-o com o abdômen voltado para cima.Usando tesoura, faça uma incisão horizontal de 0,5 centímetro de comprimento na pele abdominal. Usando ambas as mãos, puxe a pele para expor o tronco, bem como as extremidades inferiores até os membros posteriores. Localize o grácil ou o músculo interno da coxa e, usando um par de pinças curvas, agarre-o e levante levemente o músculo.Usando tesoura, faça uma incisão de 0,5 centímetro para cortar o músculo grácil. Repita o procedimento na outra perna. Com bisturi, corte a fáscia fazendo uma incisão de 0,5 centímetro ao longo da face lateral da tíbia.Em seguida, agarre a fáscia com pinça curva e retire-a puxando-a, expondo os tendões na extremidade distal do membro posterior. Em seguida, insira uma pinça reta com pontas super finas entre o tendão distal do TA e o músculo EDL. Separe os músculos deslizando a pinça em direção à extremidade proximal dos músculos.Trazer a pinça de volta para a extremidade distal e cortar o tendão distal. Segure suavemente o tendão distal do TA com pinça curva e levante o músculo para cima e sobre sua fixação proximal. Para cortar cuidadosamente o tendão proximal, corte a outra extremidade o mais próximo possível de sua fixação e transfira o TA para uma placa de Petri.Em seguida, use a pinça reta com pontas super finas para passar por baixo do tendão distal do EDL e deslize a pinça em direção à extremidade proximal do músculo para separar os músculos uns dos outros. Trazer a pinça de volta para a extremidade distal e cortar o tendão distal sem danificar o músculo. Agarrando suavemente o tendão distal do EDL com pinça curva, levante o músculo para cima e sobre sua fixação proximal para cortar cuidadosamente o tendão proximal o mais próximo possível de sua fixação.Corte a outra extremidade e transfira o músculo EDL para uma placa de Petri. Repita o procedimento para o outro membro posterior. Use pinças retas com pontas super finas para alcançar entre o tendão de Aquiles e os ossos dos membros posteriores inferiores.Deslize a pinça em direção à extremidade proximal do músculo para separar o músculo dos ossos. Trazer a pinça de volta para a extremidade distal e cortar o tendão distal. Puxe o músculo gastrocnêmio ou GA para cima e sobre a fíbula.Localizar o tendão sóleo proximal. Insira a pinça reta entre os músculos sóleo e GA e mova a pinça em direção à extremidade distal dos músculos para separar o sóleo do GA. Agora corte o tendão do sóleo proximal. Segure-o com pinça curva e levante cuidadosamente o sous para acessar seu tendão distal.Cortar o tendão distal para isolar o sóleo do AG e colocá-lo na placa de Petri contendo o meio de lavagem. Em seguida, corte o GA e coloque-o na placa de Petri. Para isolar o músculo tríceps, use pinças retas com pontas super finas para alcançar entre o tríceps e o osso úmero e deslize a pinça em direção à extremidade proximal do músculo para separar o músculo do osso.Em seguida, corte a extremidade distal do músculo tríceps e, com pinça curva, puxe-o para cima e sobre o cotovelo para acessar o tendão proximal. Corte o tendão proximal do tríceps e transfira o músculo para uma placa de Petri. Repita o procedimento para os outros quatro membros.Para remover o pelo e a pele da mandíbula, use uma tesoura para fazer uma incisão de 0,5 centímetro abaixo do olho, cortando no sentido caudal. Em seguida, usando os polegares e os dedos indicadores de ambas as mãos, aperte em cada lado da incisão e remova a pele puxando-a para cima e para baixo. Localize o tendão maior do masseter no lado caudal abaixo do olho e insira a lâmina plana de bisturi entre o osso e o músculo para cortar o tendão.Pegue o tendão masseter maior com pinça curva e corte-o com uma lâmina de bisturi ou tesoura na direção rostral para separar o músculo masseter do osso maxilar. Coloque o músculo masseter isolado na placa de Petri e repita o procedimento para o segundo músculo masseter. Use uma tesoura para fazer uma toracotomia no meio do esterno e cortar o esterno.Expor o diafragma cortando 360 graus através da caixa torácica. Em seguida, para separar a parte superior do corpo do abdômen, use uma tesoura para cortar a traqueia, esôfago, veia cava e aorta abdominal. Em seguida, usando tesoura, pré-forme uma laparotomia um centímetro abaixo do esterno e faça um corte em torno de 360 graus.Coloque a tesoura fechada entre a caixa torácica e os órgãos abdominais e pressione para baixo. Puxe suavemente a caixa torácica para separá-la dos órgãos abdominais. Para separar o diafragma da caixa torácica, segure o diafragma entre dois dedos e corte a caixa torácica com uma tesoura.Corte o diafragma o mais próximo possível das costelas em torno de 360 graus e coloque o diafragma isolado em uma placa de Petri. Pique os músculos isolados, um a um, cortando-os em pedaços de aproximadamente um milímetro. Transfira os músculos picados para um tubo cônico de 15 litros contendo cinco litros de tampão de dissociação e incube o tubo a 37 graus Celsius por 35 minutos em banho de água agitada a uma velocidade de 60 rotações por minuto.Após a digestão enzimática dos músculos picados, transfira a suspensão do tubo de 15 mililitros para um tubo de 50 mililitros. Usando uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 20, ressuspenda a amostra puxando-a para cima e para baixo através da agulha cinco vezes. Desenhe a suspensão celular para dentro da seringa e coe a amostra em um novo tubo cônico de 50 mililitros equipado com um filtro de células na parte superior.Para recuperar todas as células mononucleadas, lave o tubo cônico vazio com 20 mililitros de meio de lavagem e despeje-o através do filtro para combinar com a amostra coada. Recupere o volume restante sob o filtro de células com uma pipeta P1000. Após a dissociação tecidual e a coloração de anticorpos, as células-tronco musculares esqueléticas ou MuSCs e progenitores fibroadipogênicos ou FAPs de músculos individuais foram purificados por classificação de células ativadas por fluorescência.Após o fechamento inicial para identificar as células e separar os singlets dos duplos, portões subsequentes foram ajustados usando controles FMO para identificar os limiares de coloração. A amostra corada foi fechada e a população CD31 negativa e CD45 negativa positiva para SCA1 correspondente às FAPs foi classificada em um tubo de coleta separado. A população dupla negativa foi ainda fechada para classificar a população positiva para VCA correspondente aos MuSCs.As suspensões unicelulares do diafragma e do músculo tríceps, ao contrário das demais, apresentaram maior abundância relativa de MuSCs do que as FAPs. A coloração de EDU, embora robusta, indicou uma diferença nas frações de células positivas para EDU para os dois tipos de células-tronco e entre os diferentes músculos. Para todos os tecidos, no entanto, a fração média de MuSCs EDU positivas foi maior do que a de FAPs EDU positivos.MuSCs isolados de EDL e GA apresentaram incorporação de EDU significativamente menor em comparação com aqueles de AT, diafragma, grácil ou tríceps. Da mesma forma, variação significativa na incorporação de EDU também foi observada em FAPs isolados de diferentes músculos. Finalmente, a pureza celular foi confirmada com a coloração por imunofluorescência, indicando a especificidade do protocolo de isolamento de células-tronco.A etapa mais crítica é a digestão mecânica do tecido. Quando o tecido é cortado demais, a viabilidade diminui. Quando o tecido é cortado muito pouco, o EEL diminui.O protocolo pode ser combinado com ensaios que medem o comportamento celular, como enxertia após transplante para entender melhor as funções das células-tronco in vivo. Esta técnica pode responder se as diferenças no comportamento das células-tronco dentro dos músculos individuais podem contribuir para fenótipos de doenças e doenças caracterizadas por padrões únicos de músculos afetados.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Biologia

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Isolamento mitocondrial do músculo esquelético

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Estudar proteólise de ciclina B no nível da célula individual em populações de células inteiras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Avaliação Geração isométrica e excêntrica Força dos músculos esqueléticos Isolado de modelos murinos de Distrofias Musculares

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolamento e Cultura de miofibras individuais e suas células satélites do músculo esquelético

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolamento de Blood-derivado do navio Multipotentes Precursores do músculo-esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...