Name: isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles at JoVE.com

Cellsortering utfördes vid FACS Core Facility, Århus universitet, Danmark. Siffror skapades med hjälp av Biorender.com. Vi tackar Dr. J. Farup för att dela kaninanti-PDGFRa-antikroppen. Detta arbete stöddes av ett AUFF Starting Grant till E.P. och Start Package bidrag från NovoNordiskFonden till E.P. (0071113) och A.D.M. (0071116).

Detta protokoll utfördes i enlighet med riktlinjer för djurvård vid Århus universitet och lokala etiska föreskrifter.
OBS: Se till att följa föreskrifterna från den lokala etiska kommittén för djurförsök och hantering av prover från gnagare efter slakt. Möss är en potentiell källa till allergener; Om tillgängligt, slå på frånluftsventilation och placera den över arbetsytan för att undvika överdriven exponering för allergener. Alternativt, bära ansiktsmask om experiment...

<ol>
	<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers.">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li><li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells.">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).</li><li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence.">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).</li><li>Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+contact+and+signaling+in+the+muscle+stem+cell+niche.">Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche.</a> Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).</li><li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repairing+skeletal+muscle:+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells.">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li><li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells,+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration.">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li><li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration.">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li><li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration.">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li><li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells.">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).</li><li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+injury+activates+resident+fibro/adipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis.">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li><li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle.">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li><li>Uezumi, A., Fukada, S. -. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle.">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li><li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax7+Is+Required+for+the+Specification+of+Myogenic+Satellite+Cells.">Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li><li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration.">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li><li>Fukada, S. -. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle.">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li><li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting.">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Joe, A., Wang, J., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+adipogenic+progenitors+from+skeletal+muscle.">Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).</li><li>Yi, L., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+progenitors+from+skeletal+muscle.">Purification of progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).</li><li>Sherwood, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors:+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle.">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119 (4), 543-554 (2004).</li><li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration.">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li><li>Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-analysis+and+FACS+sorting+of+adult+muscle+fiber-associated+stem/precursor+cells.">Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells.</a> Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).</li><li>de Morree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+polyadenylation+of+Pax3+controls+muscle+stem+cell+fate+and+muscle+function.">Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function.</a> Science. 366 (6466), 734-738 (2019).</li><li>Stuelsatz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraocular+muscle+satellite+cells+are+high+performance+myo-engines+retaining+efficient+regenerative+capacity+in+dystrophin+deficiency.">Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency.</a> Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).</li><li>Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+of+hydrolysis+of+collagen-like+peptides+by+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenases:+evidence+for+both+endopeptidase+and+tripeptidylcarboxypeptidase+activities.">Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities.</a> Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).</li><li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispase,+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa,+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase.">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li><li>Baghdadi, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+signalling+by+Notch-Collagen+V-CALCR+retains+muscle+stem+cells+in+their+niche.">Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche.</a> Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).</li><li>van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+quiescent+muscle+stem+cells+in+vivo.">Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo.</a> Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells.">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li><li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation.">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li><li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-IRG+consortium+isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits.">SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).</li><li>Liou, Y. -. R., Wang, Y. -. H., Lee, C. -. Y., Li, P. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buoyancy-activated+cell+sorting+using+targeted+biotinylated+albumin+microbubbles.">Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles.</a> PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).</li><li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1.">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li><li>Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+transcriptomic+atlas+characterizes+ageing+tissues+in+the+mouse.">A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse.</a> Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).</li><li>de Morr&#233;e, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence.">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li></ol>

Flera steg är nyckeln till genomförandet av detta protokoll för att uppnå god avkastning. De enskilda musklerna har en liten volym jämfört med mängden muskler som används i bulkisoleringsprotokoll. Detta resulterar i en risk för att muskeln torkar ut under dissektionen, vilket minskar avkastningen. För att förhindra detta är det viktigt att lägga till medium i musklerna omedelbart efter dissektion. Dessutom, om dissektion tar längre tid, kan huden avlägsnas från en lem i taget för att minska tiden för e...

Skelettmuskulaturen har en hög kapacitet för regenerering på grund av närvaron av muskelstamceller (MuSC). MuSCs är belägna på myofibrerna, under basallamina, och ligger i ett vilande tillstånd av långvarig, reversibel cellcykelutgång 1,2,3,4. Vid skada aktiveras MuSCs och går in i cellcykeln för att ge upphov till förstärkande föregångare som kan differentiera och smälta samman för att bilda nya myofibrer 2,5. Tidigare arbete har visat att MuSCs är absolut nödvändiga för muskelregenerering 6,7,8. Dessutom kan en enda MuSC transplantera och generera både nya stamceller och nya myofibrer9. Skelettmuskulaturen har också en population av mesenkymala stromaceller som kallas fibro-adipogenic progenitors (FAPs), som spelar en avgörande roll för att stödja MuSC-funktionen under muskelregenerering 6,10,11,12.
På grund av deras potential att samordna muskelregenerering har det varit ett enormt intresse för att förstå hur MuSC och FAP fungerar. Vilande MuSCs markeras genom uttryck av transkriptionsfaktorerna Pax7 och Sprouty1 och cellyteproteinkalcitoninreceptorn, medan vilande FAP markeras av cellytans proteintrombocythärledda tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRa)10,12,13,14,15. Tidigare studier har visat att MuSC och FAP kunde renas från skelettmuskulaturen med hjälp av cellytemarkörer och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)9,15,16,17,18,19,20,21. Även om dessa protokoll har avancerat förmågan att studera MuSC och FAP, är en nackdel att de flesta av dessa protokoll kräver isolering av MuSC från en pool av olika muskelvävnader. Nyligen arbete från oss och andra har avslöjat skillnader i cellfenotyp och genuttrycksnivåer mellan MuSCs isolerade från olika vävnader22,23. MuSCs från membranet, triceps och gracilis visar snabbare aktivering än MuSCs från nedre bakbensmusklerna22, medan MuSCs från extraokulär muskel visar snabbare differentiering än MuSCs från membranet och nedre bakbensmusklerna23.
Detta protokoll beskriver isoleringen av MuSC och FAP från enskilda skelettmuskler (figur 1). Detta inkluderar dissektion av membranet, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA) och massetermuskler. Dissekerade muskler dissocieras därefter genom enzymatisk nedbrytning med användning av kollagenas II (ett proteas som specifikt riktar sig mot Pro-X-Gly-Pro-aminosekvensen i kollagen, vilket möjliggör nedbrytning av bindväv och vävnadsdissociation24) och dispas (ett proteas som klyver fibronektin och kollagen IV, vilket möjliggör ytterligare celldissociation25). MuSC och FAP isoleras från encellssuspensioner av FACS. Som exempel på nedströmsanalyser för cellanalys bestäms stamcellsaktivering genom analys av 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU) inkorporering, medan cellrenhet bestäms genom immunofluorescensfärgning för celltypspecifika markörer Pax7 och PDGFRa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile )</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>72.706.700</td>			
<td>1.5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.554.502</td>			
<td>15 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round-bottom tube</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>352054</td>			
<td>FACS tube without strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap</td>
			
			<td>Falcon, Fisher Scientific&#160;&#160;</td>
<td>352235</td>			
<td>FACS tube with strainer cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL tube (PP, non sterile autoclavable)</td>
			
			<td>VWR collection</td>
<td>525.0946</td>			
<td>5 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>62.547.254</td>			
<td>50 mL tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L)</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2420713 (Cat#A31571)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARIA 3</td>
			
			<td>BD</td>
<td></td>			
<td>FACS, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810</td>
			
			<td>eppendorf</td>
<td>EP022628188</td>			
<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye</td>
			
			<td>Invitrogen, Thermo Fisher</td>
<td>Lot: 2387287 (Cat# C10337)</td>			
<td>Cell Proliferation Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen from calf-skin&#160;</td>
			
			<td>Bioreagent, Sigma Aldrich&#160;</td>
<td>Source: SLCK6209 (Cat# C8919)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			
			<td>Worthington, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 40H20248 (cat# L5004177 )</td>			
<td>Collagenase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot: 2309415 (cat# 17105-041 )</td>			
<td>Dispase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum (non-sterile)</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 5, 110 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.327</td>			
<td>Straight forceps with fine tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont nr. 7, 115 mm</td>
			
			<td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1606.335</td>			
<td>Curved forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2453614 (cat# 31550-023)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD31</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>MEC13.3 (Cat # 102506)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Anti-mouse CD45</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>30-F11 (Cat# 103108)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid (100%)</td>
			
			<td>EMSURE, Merck&#160;&#160;</td>
<td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head over head mini-tube rotator&#160;</td>
			
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
<td>15534080 (Model no. 88861052)</td>			
<td>Head over head mini-tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 2482639 (cat# 10368902 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp SWB 15</td>
			
			<td>FisherBrand, Fisher Scientific</td>
<td>15325887</td>			
<td>Shaking water bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS2 mini-shaker&#160;</td>
			
			<td>IKA&#160;</td>
<td></td>			
<td>Vortex unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm)</td>
			
			<td>BD microlance, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>304827</td>			
<td>20G needle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral formalin buffer 10%</td>
			
			<td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-pyrogenic cell strainer (40 &#181;M)</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3945.040</td>			
<td>Cell strainer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>D7 (Cat# 108120)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax7 primary antibody</td>
			
			<td>DSHB</td>
<td>Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x powder concentrate</td>
			
			<td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td>
<td>BP665-1</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1)</td>
			
			<td>BioLegend, NordicBioSite</td>
<td>429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			
			<td>Gibco, Fisher Scientific&#160;</td>
<td>Lot. 163589 (cat# 11548876 )</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p10</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2140-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p1000</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2279-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p20</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2149P-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips p200</td>
			
			<td>Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific</td>
<td>2069-05</td>			
<td>Low retention, pre-sterilized, filter tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protective underpad</td>
			
			<td>Abena&#160;</td>
<td>ACTC-7712</td>			
<td>&#160;60 x 40cm, 8 layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin, pipet-lite XLS</td>
			
			<td>Mettler Toledo, Thermo Scientific&#160;</td>
<td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td>			
<td>Pipettes (P10, P20, P200, P1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-PDGFR-alpha</td>
			
			<td>RabMAb, abcam</td>
<td>AB134123</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel (shaft no. 3)</td>
			
			<td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.502</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 11</td>
			
			<td>Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>1902.0911</td>			
<td>Scalpel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanlaf mars</td>
			
			<td>Labogene</td>
<td>class 2 cabinet: Mars</td>			
<td>Flow bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ScanR</td>
			
			<td>Olympus</td>
<td></td>			
<td>Microscope, Core facility Aarhus University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			
			<td>FST</td>
<td>14568-09</td>			
<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Series 8000 DH</td>
			
			<td>Thermo Scientific</td>
<td>3540-MAR</td>			
<td>Incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			
			<td>VWR</td>
<td>612-3700</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			
			<td>VWR, Avantor delivered by VWR</td>
<td>612-3702</td>			
<td>Sterile, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile&#160;</td>
			
			<td>BD Emerald, Fisher Scientific</td>
<td>307731</td>			
<td>Syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 100, standard</td>
			
			<td>Sarstedt AG &#38; Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td>
<td>83.3902</td>			
<td>Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20</td>
			
			<td>Corning, Sigma Aldrich</td>
<td>3764</td>			
<td>96-well Half bottom plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			
			<td>Sigma Aldrich, Merck</td>
<td>Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td>			
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles

Skelettmuskulaturen har distinkta populationer av vuxna stamceller som bidrar till homeostas och reparation av vävnaden. Skelettmuskelstamceller (MuSC) har förmågan att skapa nya muskler, medan fibro-adipogenic progenitorer (FAPs) bidrar till stromala stödvävnader och har förmågan att göra fibroblaster och adipocyter. Både MuSC och FAP ligger i ett tillstånd av långvarig reversibel cellcykelutgång, kallad quiescence. Det vilande tillståndet är nyckeln till deras funktion. Vilande stamceller renas vanligen från flera muskelvävnader som slås samman i ett enda prov. Nya studier har dock avslöjat tydliga skillnader i molekylära profiler och vilodjup hos MuSCs isolerade från olika muskler. Detta protokoll beskriver isolering och studier av MuSC och FAP från enskilda skelettmuskler och presenterar strategier för att utföra molekylär analys av stamcellsaktivering. Den beskriver hur man isolerar och smälter muskler av olika utvecklingsursprung, tjocklekar och funktioner, såsom membranet, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL) och massetermusklerna. MuSC och FAP renas genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och analyseras genom immunofluorescensfärgning och 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU) inkorporeringsanalys.

Efter protokollet för individuell skelettmuskelisolering (figur 2) isolerades gracilis-, TA-, EDL-, GA-, soleus-, triceps-, masseter- och membranmusklerna från tre schweiziska manliga utavlade möss som hade avbrutits från ett lokalt avelsprogram (figur 2). Efter vävnadsdissociation och antikroppsfärgning renades MuSC och FAP från de enskilda musklerna med FACS (figur 3). Den ursprungliga grinden erhölls med ett ofärgat prov...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles at JoVE.com

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

Detta protokoll beskriver isoleringen av muskelstamceller och fibro-adipogenic progenitorer från enskilda skelettmuskler hos möss. Protokollet innefattar dissektion av enstaka muskler, stamcellsisolering genom fluorescensaktiverad cellsortering, renhetsbedömning genom immunofluorescensfärgning och kvantitativ mätning av S-fasinträde med 5-etynyl-2'-deoxiuridininkorporeringsanalys.

Isolering av vilande stamcellspopulationer från enskilda skelettmuskler

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det möjliggör studier av stamcellsfunktion över olika skelettmuskler, vilket fördjupar vår förståelse för hur de bidrar till homeostas, regenerering och sjukdomsprogression. Med hjälp av detta protokoll kan vi isolera två populationer av levande stamceller från specifika muskler och studera hur de fungerar. För att börja muskelisolering, spraya ner den avlivade musen med etanol och placera den med buken uppåt.Använd sax och gör ett 0,5 centimeter långt horisontellt snitt i bukhuden. Dra i huden med båda händerna för att exponera bålen såväl som de nedre extremiteterna upp till bakbenen. Leta reda på gracilis eller den inre lårmuskeln och använd ett par böjda pincett ta tag i den och lyft muskeln något.Använd sax och gör ett snitt på 0,5 centimeter för att skära ut gracilismuskeln. Upprepa proceduren på det andra benet. Använd en skalpell, skär fascia genom att göra ett 0,5 centimeter snitt längs sidosidan av skenbenet.Ta sedan fascia med böjda pincett och ta bort den genom att dra, exponera senorna vid bakbenets distala ände. Sätt sedan in ett par raka pincett med superfina spetsar mellan TA: s distala sena och EDL-muskeln. Separera musklerna genom att skjuta pincetten mot den proximala änden av musklerna.För pincetten tillbaka till den distala änden och skär den distala senan. Ta försiktigt tag i TA: s distala sena med böjda pincett och lyft muskeln upp och över dess proximala fäste. För att försiktigt skära den proximala senan, skär den andra änden närmast dess fastsättning och överför TA till en petriskål.Använd sedan de raka pincetterna med superfina spetsar för att gå under EDL: s distala sena och skjut pincetten mot den proximala änden av muskeln för att skilja musklerna från varandra. Ta pincetten tillbaka till den distala änden och skär den distala senan utan att skada muskeln. Genom att försiktigt ta tag i EDL: s distala sena med böjda pincett, lyft muskeln upp och över dess proximala fäste för att försiktigt skära den proximala senan så nära dess fäste som möjligt.Skär den andra änden och överför EDL-muskeln till en petriskål. Upprepa proceduren för den andra bakbenet. Använd raka pincett med superfina spetsar för att nå in mellan hälsenan och de nedre bakbenen.Skjut pincetten mot den proximala änden av muskeln för att separera muskeln från benen. För pincetten tillbaka till den distala änden och skär den distala senan. Dra gastrocnemius eller GA-muskeln upp och över vadbenet.För att lokalisera den proximala soleussenan. Sätt in de raka pincetterna mellan soleus- och GA-musklerna och flytta pincetten mot den distala änden av musklerna för att separera soleus från GA. Skär nu den proximala soleussenan. Ta tag i den med böjda pincett och lyft försiktigt sousen för att komma åt dess distala sena.Skär av den distala senan för att isolera soleus från GA och placera soleus i petriskålen som innehåller tvättmediet. Skär sedan GA och lägg den i petriskålen. För att isolera tricepsmuskeln, använd raka pincett med superfina spetsar för att nå in mellan triceps och humerusbenet och skjut pincetten mot den proximala änden av muskeln för att separera muskeln från benet.Skär sedan den distala änden av tricepsmuskeln och dra den upp och över armbågen med böjda pincett för att komma åt den proximala senan. Skär triceps proximala sena och överför muskeln till en petriskål. Upprepa proceduren för de andra fyra lemmarna.För att ta bort pälsen och huden från käken, använd sax för att göra ett 0,5 centimeter snitt under ögat, skär i kaudal riktning. Använd sedan tummarna och pekfingrarna på båda händerna, nyp på vardera sidan av snittet och ta bort huden genom att dra den uppåt och nedåt. Leta reda på massörens huvudsena i den kaudala sidan under ögat och sätt in det platta skalpellbladet mellan benet och muskeln för att skära senan.Ta tag i den stora massetersenan med böjda pincett och skär den med ett skalpellblad eller sax i rostral riktning för att separera massetermuskeln från käkbenet. Placera den isolerade massetermuskeln i petriskålen och upprepa proceduren för den andra massetermuskeln. Använd sax för att göra en thorakotomi i mitten av bröstbenet och skär genom bröstbenet.Exponera membranet genom att skära 360 grader genom bröstkorgen. För att separera överkroppen från buken använd sax för att skära genom luftstrupen, matstrupen, vena cava och bukaorta. Därefter, med sax, förforma en laparotomi en centimeter under bröstbenet och gör ett snitt runt 360 grader.Placera den stängda saxen mellan bröstkorgen och bukorganen och tryck ner. Dra försiktigt i ribbburet för att skilja det från bukorganen. För att separera membranet från bröstkorgen, håll membranet löst mellan två fingrar och skär genom bröstkorgen med sax.Skär membranet så nära revbenen som möjligt cirka 360 grader och placera det isolerade membranet i en petriskål. Hacka de isolerade musklerna en efter en genom att skära dem i bitar på ungefär en millimeter. Överför de malda musklerna till ett 15 liters koniskt rör innehållande fem liter dissociationsbuffert och inkubera röret vid 37 grader Celsius i 35 minuter i ett skakande vattenbad med en hastighet av 60 varv per minut.Efter enzymatisk nedbrytning av de malet musklerna, överför suspensionen från 15 ml röret till ett 50 ml rör. Använd en 10 ml spruta försedd med en 20 gauge nål, återsuspendera provet genom att dra det upp och ner genom nålen fem gånger. Dra in cellsuspensionen i sprutan och sila provet i ett nytt 50 ml koniskt rör försett med en cellsil ovanpå.För att hämta alla monokärnförsedda celler, tvätta det tomma koniska röret med 20 ml tvättmedia och häll det genom silen för att kombinera med det ansträngda provet. Hämta återstående volym under cellsilen med en P1000-pipett. Efter vävnadsdissociation och antikroppsfärgning renades skelettmuskelstamcellerna eller MuSCs och fibro adipogenic progenitorer eller FAP från enskilda muskler genom fluorescensaktiverad cellsortering.Efter inledande grind för att identifiera cellerna och separera singlets från dubletter, sattes efterföljande grindar med FMO-kontroller för att identifiera färgningströsklar. Fläckprovet gated och den SCA1-positiva CD31-negativa och CD45-negativa populationen motsvarande FAP sorterades in i ett separat uppsamlingsrör. Den dubbla negativa populationen gated vidare för att sortera VCA-positiv befolkning som motsvarar MuSCs.Diafragman och tricepsmuskelns encellssuspensioner, till skillnad från de andra, hade en högre relativ förekomst av MuSC än FAP. EDU-färgning, även om den var robust, indikerade en skillnad i fraktioner av EDU-positiva celler för de två stamcellstyperna och mellan de olika musklerna. För alla vävnader var dock den genomsnittliga andelen EDU-positiva MuSCs högre än för EDU-positiva FAPs.MuSCs isolerade från EDL och GA visade signifikant lägre EDU-inkorporering jämfört med de från TA, membran, gracilis eller triceps. På liknande sätt observerades också signifikant variation i EDU-inkorporering i FAP isolerade från olika muskler. Slutligen bekräftades cellrenhet med immunofluorescerande färgning, vilket indikerar specificiteten hos stamcellsisoleringsprotokollet.Det mest kritiska steget är den mekaniska matsmältningen av vävnaden. När vävnaden skärs för mycket minskar livskraften. När vävnaden skärs för lite minskar ålen.Protokollet kan kombineras med analyser som mäter cellbeteende, såsom engraftment efter transplantation för att bättre förstå stamcellsfunktioner in vivo. Denna teknik kan svara på om skillnader i stamcellsbeteende inom enskilda muskler kan bidra till sjukdomsfenotyper och sjukdomar som kännetecknas av unika mönster av drabbade muskler.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolering och transplantation av hematopoetiska stamceller (HSCs)

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

DNA Transfektion av däggdjurs Skelettmuskulatur hjälp In Vivo Elektroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitokondriell Isolering från skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Robust generationens Hepatocyte-liknande celler från mänskliga embryonala patientgrupper Stem Cell

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studera Proteolys av cyklin B på den inre cellnivå i hela cellpopulationer

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Isometrisk och excentrisk styrkebidragsprocessen Bedömning av muskler isolerat från musmodeller av muskeldystrofi

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering och odling av individuella Myofibers och deras satellit celler från vuxna skelettmuskulatur

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolering av blod-kärl-härledda multi prekursorer från Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering individuella mänskliga embryonala stamceller genom kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...