Name: engineering oncogenic heterozygous gain-of-function mutations in human hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2023-03-10T14:50:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

这项工作得到了奥地利科学基金（FWF;编号P32783和I5021）对A.R.的资助，奥地利内科医学会（约瑟夫·斯柯达奖学金），奥地利血液学和肿瘤学会（OeGHO;临床研究基金）和MEFOgraz。T.K.是白血病和淋巴瘤协会的特别研究员。

作者没有什么可透露的。

人类原代HSPC的高效和精确的遗传操作为探索和理解影响正常造血的过程，最重要的是造血细胞的白血病转化提供了很好的机会。
在该协议中，描述了一种设计人类HSPC以表达复发性杂合GOF突变的有效策略。该程序利用CRISPR / Cas9技术和rAAV6载体作为DNA模板的供体，将WT和突变DNA序列精确地插入其内源性基因位点。将工程化的cDNA（WT和突变体）与分离的荧光报告蛋白偶联，可以富集和跟踪具有明确杂合状态的细胞。
与常用的基于慢病毒（LV）的方法相比，该策略具有几个优点。一个主要优点是基于CRISPR/Cas9的系统允许对内源性位点进行精确编辑，从而保存内源性启动子和调控元件。这导致编辑基因在细胞中的表达呈同质性，当使用基于LV的方法时，这一目标几乎无法实现。与左心室载体的基因转移导致基因的半随机整合，优先于转录活性位点34。这可能转化为转移基因的过表达和编辑细胞之间的异质性，最终导致难以研究和分析突变和基因相互作用的作用。第二个优点是所描述的系统作为位点特异性编辑系统，消除了插入诱变的风险35。
双荧光报告策略允许对在两个等位基因上成功编辑的细胞进行精确富集和跟踪，其中一个等位基因整合WT cDNA，另一个等位基因整合突变的cDNA序列。仅表达单个报告基因的细胞仅代表具有相同荧光报告基因的HDR模板的单等位基因整合或双等位基因整合。只有产生单细胞衍生克隆并进行单独分析，才能精确区分这两种情况。然而，HSPC在 体外的增殖能力有限，当长时间培养时，HSPC开始分化为更成熟的后代，并失去其自我更新和植入能力。这使得选择和扩增携带所需杂合突变的单细胞克隆不可行。双荧光蛋白策略的应用和流式细胞术富集携带杂合突变的细胞可以绕过扩展体 外 培养引起的问题。
在这个具体的例子中，成功地证明了HSPC可以有效地设计和分类，以获得携带杂合 CALRDEL/WT突变的纯HSPC群体。
然而，该系统不仅限于工程杂合移码突变，而且还可以很容易地用于创建其他突变类型，包括错义和无义突变。通过应用含有WT的AAV的不同组合或具有不同荧光报告蛋白的突变序列，该系统还可用于引入纯合突变（同时转导两个rAAV都携带突变cDNA，但荧光报告基因不同）甚至校正突变（同时转导两个AAV都携带WT cDNA，但荧光报告基因不同）。此外，值得一提的是，该策略不仅限于引入致癌性GOF突变。事实上，所描述的方案可用于多种替代策略，包括基因敲除、基因替换36，37、转基因（即嵌合抗原受体）的靶向敲入38，甚至用于校正致病突变11，39。
将 CRISPR/Cas9 和 AAV6 与多种荧光报告基因相结合的策略也被证明适用于许多其他细胞类型，包括 T 细胞、浆细胞样树突状细胞、诱导多能干细胞、神经元干细胞和气道干细胞24，38，40，41，42，43，44.该策略可用于生产上嵌合抗原受体（CAR）T细胞。例如，最近发表的CRISPR/Cas9介导的敲除CAR-T细胞中TGFBR2基因的敲除大大增加了它们在抑制性TGF-β丰富的肿瘤微环境中的功能45。这种方法可以提供一步方案，既可以设计T细胞以表达CAR，也可以通过将CAR特异性插入TGFBR2基因的两个等位基因中来敲除TGFBR2基因。此外，这种方法还可用于通过将CAR整合到T细胞受体α常数（TRAC）基因46，47中来产生通用CAR-T细胞。
为了提高可重复性并保证细胞的有效编辑，需要考虑一些重要的因素。确保细胞成功编辑的主要关键点在于（i）sgRNA的选择，（ii）HDR模板的设计，以及（iii）rAAV6的生产。
选择性能良好的sgRNA至关重要，因为它将决定可以整合HDR模板的最大等位基因数量。由于现在有许多软件可用，因此对候选sgRNA的搜索已得到简化。通过选择感兴趣的区域，该软件可以提出一系列具有靶标评分和脱靶评分的sgRNA，分别指示在所需位点和不需要的位点进行编辑的机会。这些分数是根据以前发布的评分模型48，49 计算得出的。虽然这是选择性能良好的sgRNA的良好起点，但sgRNA的性能需要确认，因为它在 计算机中的 预测性能并不总是与 体外有效的sgRNA相对应。因此，强烈建议设计和测试至少三种sgRNA，以增加找到最佳sgRNA的机会。一旦鉴定出真正表现良好的sgRNA，建议继续进行HDR模板的设计。
设计 HDR 模板时应考虑预防措施。左同源臂和右同源臂（分别为LHA和RHA）应分别跨越sgRNA切割位点的上游和下游400 bp，因为较短的HA可能导致HDR频率降低。 可以通过 HDR引入的cDNA的大小取决于AAV的包装能力，大约为4.7 kb。由于HDR模板中有许多必需的元素（LHA，RHA，SA，PolyA，启动子和荧光报告序列），突变或WT cDNA的剩余空间是有限的。如果所需的突变位于基因的3'末端附近或具有整体短CDS的基因中，则这是没有问题的。然而，如果突变位于具有长CDS的基因的转录起始侧（TSS）附近（超过AAV的剩余包装空间），这种描述的方法可能不可行。为了解决这个问题，Bak及其同事最近开发了一种依赖于将HDR模板拆分为两个AAV的策略。该策略依赖于两个独立的HDR介导的整合来获得大基因50的最终无缝整合。
病毒的质量及其滴度是可以成就或破坏细胞基因组工程成功的其他因素。为了获得最佳产量，重要的是不要让HEK293T在培养物中保持完全汇合。理想情况下，HEK293T细胞应在达到70%-80%汇合时分裂。此外，HEK293T不应长时间培养，因为这会降低其产生病毒的能力。新的HEK293T细胞需要在20代后解冻。获得高病毒滴度对于提高实验的效率和可重复性非常重要。低病毒滴度将转化为HSPC转导所需的大量rAAV溶液。作为一般规则，添加到核化细胞中的rAAV溶液不应超过HSPC保留培养基总体积的20%。较高体积的AAV溶液可能导致细胞死亡增加，增殖降低和转导效率受损。因此，在病毒滴度低的情况下，建议进一步浓缩病毒。
总之，该协议提供了一种可重复的方法，通过同时使用CRIPSR / Cas9和rAAV6供体模板以及额外的双荧光报告基因，精确有效地操作人类HSPC。这种方法已被证明是研究正常造血干细胞生物学以及突变对白血病发生的贡献的重要工具。

随着成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9技术的发展，科学家的工具包中增加了一种新的极其强大的仪器。该技术允许基因组的精确工程，并且已经证明自己不仅对研究目的非常有用（Hsu等人1中审查），而且最近也已成功转化为临床环境2，3，4。CRISPR/Cas9编辑策略依赖于Cas9蛋白和单向导RNA（sgRNA）的活性5，6，7。在宿主细胞中，Cas9蛋白被引导到DNA中与sgRNA序列互补的特定位点，并将引入DNA双链断裂（DSB）。一旦生成DSB，就会发生两种主要且相互竞争的修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ是一种容易出错的，主要使用的修复机制导致插入和缺失（插入缺失），而HDR通过使用姐妹染色单体作为修复模板，非常精确，但仅限于细胞周期的S或G2期8。在基因组工程中，HDR 可用于 DNA 的靶向修饰，方法是提供供体模板，该供体模板两侧是与 Cas9 诱导的 DSB 的两个 DNA 末端相同的同源臂（图 1）。用于 HDR 的捐赠者模板类型会极大地影响编辑效率。对于人类HSPC的基因工程，腺相关病毒血清6型（AAV6）最近被描述为递送单链DNA模板的极好载体9，10。
CRISPR / Cas9基因组工程可用于治疗性纠正有害突变11 ，但也可用于将致病突变引入DNA以模拟癌症发展12。血癌，如白血病，通过健康HSPC中体细胞突变的顺序获得 而 发展13，14。早期遗传事件导致克隆增殖优势，导致不确定潜力的克隆造血（CHIP）15，16。突变的进一步获得最终将导致白血病转化和疾病的发展。体细胞突变可以在控制自我更新、存活、增殖和分化的基因中找到17.
通过基因组工程 将 单个突变引入健康的HSPC可以精确地模拟这种逐步白血病生成过程。在骨髓性肿瘤（如急性髓性白血病（AML））中发现的复发性突变数量有限18，19 使这种疾病特别适合使用基因组工程工具进行概括。
体细胞突变可能只出现在一个等位基因（单等位基因/杂合突变）或两个等位基因（双等位基因/纯合突变）上，并且可以对基因的功能产生深远的影响，这可能导致功能丧失（LOF）或功能获得（GOF）。LOF突变导致基因的LOF减少（如果一个等位基因受到影响）或完全（如果两个等位基因都受到影响），而GOF突变导致基因的激活或新功能增加。GOF突变通常是杂合的20。
重要的是，合子性（异合子与纯合子）对尝试忠实地模拟突变具有重大意义;因此，仅对基因的一个等位基因进行靶向操作对于设计杂合热点GOF突变是必要的。容易出错的NHEJ导致不同长度的插入缺失21 ，这可能导致不同的，不可预测的生物学后果。然而，由于NHEJ是引入DSB后细胞采用的主要修复程序，因此目前用于操纵HSPC的大多数CRISPR / Cas9平台都不允许精确预测遗传结果22，23。相比之下，引入 CRISPR/Cas9 介导的双链断裂 （DSB），结合使用基于重组腺相关病毒 （rAAV） 载体的 DNA 供体模板通过 HDR 进行 基因组工程，允许在人类 HSPC 中插入等位基因特异性突变11，24。可以同时整合突变体和野生型（WT）序列，并在单个等位基因上结合不同的荧光报告基因，以选择杂合基因型（图2）。该策略可用作精确表征复发性、白血病性、杂合性 GOF 热点突变对 HSPC 功能、疾病起始和进展的影响的有力工具。
本文提供了原代人HSPC中复发性突变杂合GOF突变的有效工程的详细方案。该策略结合了CRISPR / Cas9和双AAV6转导的使用，为杂合GOF突变的预期生成提供WT和突变DNA供体模板。例如，钙网蛋白（CALR）基因中复发性1型突变（52 bp缺失）的工程将显示25。 CALR 外显子 9 中的杂合 GOF 突变经常见于骨髓增殖性疾病，例如原发性血小板增多症 （ET） 和原发性骨髓纤维化 （PMF）26。CALR是一种内质网驻留蛋白，在新合成蛋白质的折叠过程中主要具有质量控制功能。其结构可分为三个主要结构域：参与蛋白质伴侣功能的氨基（N）末端结构域和富含脯氨酸的P结构域，以及参与钙储存和调节的C结构域27，28。 CALR 突变导致 +1 帧偏移，导致新型扩展 C 端的转录和内质网 （ER） 保留信号 （KDEL） 的丢失。突变型 CALR 已被证明可结合血小板生成素 （TPO） 受体，从而导致 TPO 非依赖性信号传导，增殖增加29。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig01v2.jpg"> 图 1：NHEJ 和 HDR 修复。 在DNA中引入双链断裂后NHEJ和HDR修复机制的简化示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig02.jpg"> 图 2：双等位基因 HDR 编辑策略的示意图。 示意图显示了供体模板与目标等位基因的整合，然后将它们翻译成功能性mRNA。橙色虚线框表示对应于左同源臂 （LHA） 和右同源臂 （RHA） 的区域。每个 HA 的理想大小为 400 bp。绿色虚线框表示对应于 SA 序列的区域。SA 的大小为 150 bp。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 635</td>
			<td>https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D Nucleofector Core Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td>For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D Nucleofector X Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVpro Purification Kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically modified synthetic sgRNA</td>
			<td>Synthego</td>
			<td></td>
			<td>Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5&#8217;-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3&#8217;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2&#39;-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3&#39; phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases.&#160;&#160;&#160;&#160; *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOPCHOP sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRISPick sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRISPOR sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenAgarose L.E.</td>
			<td>Inno-train</td>
			<td>GX04090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs Inc. (NEB)</td>
			<td>E2611L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICE</td>
			<td>Synthego</td>
			<td></td>
			<td>https://ice.synthego.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT codon optimization tool</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7658-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advance</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MG04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, 5X100 ml</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor&#160; X Kit L</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-MCS2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDGM6</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>110660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td>Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70&#176;C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 &#956;m filter, make 1120 &#956;L aliquots, and store at -80&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers&#160;</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td>-</td>
			<td>Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Primer 1 Fwd:&#160;&#160;&#160; AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Primer Assay</td>
			<td>IDT</td>
			<td>-</td>
			<td>PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers)&#160; that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std - qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5&#39;-3&#39;) : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5&#39;-3&#39;): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5&#39;-3&#39;): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5&#39; Dye/3&#39; Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Extract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE0905T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Flt3-ligand</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soc outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-butyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5887-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Regenin 1 (SR1)</td>
			<td>Biogems</td>
			<td>1224999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM II</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>9655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIDE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://shinyapps.datacurators.nl/tide/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (with phenol red), 500 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>16605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UM171</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Builder codon optimization tool</td>
			<td>Vector Builder</td>
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			<td>https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html</td>
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engineering oncogenic heterozygous gain-of-function mutations in human hematopoietic stem and progenitor cells

在其一生中，造血干细胞和祖细胞（HSPC）获得体细胞突变。其中一些突变改变了HSPC的功能特性，如增殖和分化，从而促进血液系统恶性肿瘤的发展。需要对HSPC进行有效和精确的遗传操作，以建模，表征和更好地了解复发性体细胞突变的功能后果。突变可能对基因产生有害影响并导致功能丧失（LOF），或者形成鲜明对比的是，可能增强功能，甚至导致特定基因的新特征，称为功能获得（GOF）。与LOF突变相反，GOF突变几乎完全以杂合方式发生。目前的基因组编辑方案不允许选择性靶向单个等位基因，从而阻碍了模拟杂合子GOF突变的能力。在这里，我们提供了一个详细的协议，说明如何通过结合CRISPR / Cas9介导的同源定向修复和重组AAV6技术来设计人类HSPC中的杂合GOF热点突变，以实现高效的DNA供体模板转移。重要的是，该策略利用双荧光报告系统来跟踪和纯化成功的杂合编辑HSPC。该策略可用于精确研究GOF突变如何影响HSPC功能及其向血液恶性肿瘤的进展。

通过应用上述方案，杂合子1型 CALR 突变可重复地引入脐带血来源的HSPC中。该突变包括外显子 9（ CALR 的最后一个外显子）中的 52 bp 缺失，导致 +1 帧偏移，导致一种新的带正电荷的 C 端结构域26，33 的翻译。为了在内源性基因位点引入CALR突变，采用了外显子9上游的内含子靶向策略，因为在Cas9诱导的DSB未通过 HDR 机制 修复 的情况下，这将规避编码序列中任何不必要的变化。在这种特定情况下，由于具有高靶上和低脱靶序列以及有利的同源臂（缺乏序列重复; 图5A）。
然后将两个供体模板设计并包装在AAV6载体中。为了实现从内源性外显子到整合的cDNA的正确剪接，供体模板包含（i）SA序列，包括3'剪接位点，分支点和聚嘧啶束，（ii）外显子8-9的密码子优化cDNA序列，包含WT（CALRWT）或突变序列（CALRDEL）包括终止密码子，（iii）猿病毒40（SV40）polyA信号，（iv）在单独的内部启动子，脾病灶形成病毒（SFFV）启动子的控制下编码荧光蛋白的序列，然后是（v）牛生长激素（bGH）polyA信号。含有 CALR WT cDNA 的供体模板设计为包含 GFP 盒，而含有 CALRDEL cDNA 序列的供体模板设计为包含 BFP 盒。整个结构的两侧是左右HA（图5A）。
在用RNP复合物转染和用rAAV6病毒转导两天后，通过流式细胞术分析细胞。可以检测到四个主要群体：（i）既不表达GFP也不表达BFP的细胞，代表没有基于HDR的基因组编辑的细胞，（ii）仅对GFP呈阳性的细胞，代表仅整合WT构建体的细胞，（iii）仅对BFP呈阳性的细胞，代表仅整合突变构建体的细胞，以及（iv）GFP和BFP双阳性细胞， 代表整合了WT和突变序列的细胞（图5B）。为了获得携带杂合1型 CALR 突变的HSPC纯群体，通过流式细胞术对双阳性细胞进行分选。其中两个WT序列被敲入的HSPC用作对照细胞（GFP+ mCherry+; 图 5B）。用作对照细胞的有效替代方案是HSPC，其荧光蛋白在安全港位点（即AAVS1;未显示）中的双等位基因整合。对分选的HSPC进行的台盼蓝排除细胞计数表明，超过90%的细胞是活的。
通过应用In-Out PCR策略证实了构建体的无缝靶向整合（图6A）。在这种特定情况下，我们进行了两个单独的输入输出PCR，一个用于敲入CALR WT序列（图6A中凝胶电泳的泳道1），另一个用于敲入的CALRDEL序列（图6A凝胶电泳的泳道2）。对从凝胶条带中提取的DNA进行的Sanger测序证实了WT和突变序列在CALRDEL / WT HSPC中的正确插入（图6B）。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig05.jpg"> 图5：携带杂合CALR突变的HSPC的产生 。 （A）描述杂合 CALR 突变插入的编辑策略的代表性方案。RNP 复合物靶向 CALR 基因的外显子 7 和外显子 8 之间的内含子。两个AAV，一个包含突变外显子8-9和一个BFP，另一个包含WT外显子8-9和一个GFP，将作为供体修复模板，并将促进突变序列在一个等位基因中的整合以及WT序列在其余等位基因中的整合。（B）代表性流式细胞术图，描述HSPC转染和转导后48小时GFP和BFP或GFP和mCherry的表达。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig06.jpg"> 图 6：HSPC 中成功杂合 CALR 突变的验证。 （A） 对从 AAV 对照、CALR WT/WT 和 CALRDEL/WT 中提取的基因组 DNA 进行的进出 PCR 产物的凝胶电泳。使用100 bp DNA分子量标准。缩写：NTC = 非模板控件。（B）从对CALRDEL/WT 进行的进出PCR获得的Sanger测序结果，证实了WT和突变序列的成功整合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

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Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

忠实地模拟造血干细胞和祖细胞（HSPC）体细胞突变的新策略对于更好地研究造血干细胞生物学和血液恶性肿瘤是必要的。在这里，描述了通过结合使用CRISPR / Cas9和双rAAV供体转导来模拟HSPC中杂合功能获得突变的方案。

工程人造血干细胞和祖细胞中的致癌杂合功能获得突变

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

该方法允许精确模拟原代人造血干细胞和祖细胞中复发性白血病功能获得突变，从而研究其在白血病转化中的作用。该技术的主要优点是将基于CRISPR-Cas9的突变工程与荧光报告基因的引入相结合。这允许对纯杂合突变细胞群进行独特的鉴定、富集和跟踪。演示该程序的将是Tommaso Sconocchia，我实验室的博士后研究员。首先，使用在线 Benchling 设计工具通过选择加号创建选项来设计单向导 RNA。然后，单击DNA序列“其次是导入DNA序列”和从数据库导入“选项。然后输入所需的基因并选择“人类”作为物种。单击搜索“选项并选择正确的成绩单导入。选择要在其中引入双链断路的感兴趣区域。然后选择屏幕右侧的CRISPR“选项，然后选择设计和分析指南。接下来，选择单导板“同时将导线长度保持在 20 个碱基对和 PAM 序列，以便使用 SP-Cas9 进行编辑。选择具有高靶标分数和高脱靶分数的指南，并从商业供应商处订购单向导RNA作为化学修饰的合成单向导RNA。要设计HDR模板，请将基因组序列和编码序列导入软件以进行分子克隆。从基因组序列文件中，通过在双链断裂的五个素数端选择400个碱基对来设计左同源臂，并将该序列粘贴到新文件中。从基因组序列文件中，通过选择目标内含子的最后 150 个碱基对并将其粘贴到左同源臂之后来设计剪接受体序列。从编码序列文件中，选择感兴趣的cDNA。密码子优化cDNA并将其插入剪接受体序列之后。在感兴趣的cDNA之后，在荧光蛋白的启动子序列之后插入三个素数聚腺苷酸化信号。然后，插入荧光蛋白的序列和第二个但不同的聚腺苷酸化信号。从基因组序列文件中，通过在双链断裂的三个素数端选择理想的400个碱基对并在第二次聚腺苷酸化后插入序列来设计正确的同源臂。然后，创建整个模板的副本并修改感兴趣的cDNA，使其包含所需突变的序列。用不同的荧光蛋白交换荧光蛋白。构建 HDR 模板并将其克隆到 AAV 表达载体中。对于重组AAV6制备，准备10个150毫米培养皿，每个培养皿含有1100万个HECK293T，在20毫升DMEM中补充有10%FBS，1%青霉素链霉素和25毫摩尔HEPES。然后，将培养皿放入37摄氏度，5%二氧化碳的培养箱中24小时。小心丢弃旧培养基后，用 20 毫升补充有 10% FBS、25 毫摩尔 HEPES 和 1 毫摩尔丁酸钠的不含抗生素的 DMEM 代替。接下来，准备两个标有管一和二的15毫升管。对于试管，加入 5 毫升还原血清培养基、60 μg 重组 AAV6 突变 HDR 质粒和 220 μg PDGM6 辅助质粒。对于二管，加入五毫升还原血清培养基和每毫升1120微升1毫克聚乙烯胺溶液。将试管二的内容物加入试管一后，涡旋30秒，然后在室温下孵育15分钟。小心地将 1.1 毫升溶液滴入每个培养皿中，轻轻旋转。将培养皿放入37摄氏度，5%二氧化碳的培养箱中48小时。然后在每个培养皿中加入250微升0.5摩尔EDTA，并将它们放入培养箱中10分钟。通过洗净培养皿上的细胞来收获细胞并转移到500毫升离心管中。在4摄氏度下以2000G离心10分钟，弃去上清液。通过涡旋松开沉淀，并使用AAV纯化试剂盒提取病毒。将纯化的病毒等分后，将其储存在零下80摄氏度。解冻CD34阳性造血干细胞和祖细胞后，将细胞转移到补充有1%青霉素链霉素的10毫升预热RPMI中。在室温下以350G离心10分钟。将细胞悬浮在造血干细胞和祖细胞保留培养基中至每毫升250， 000个细胞的浓度，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育72小时。接下来，在15毫升管中收获细胞。通过台盼蓝排除液计数并检查细胞活力。为了制备核糖核蛋白复合物，在1.5毫升的管中加入15微克Cas9和8微克的单向导RNA，并在25摄氏度下在加热块中孵育10分钟。当核糖核蛋白复合物孵育时，将细胞以350G离心五分钟并弃去上清液。将细胞悬浮在100微升核连接溶液中后，将细胞与核糖核蛋白复合物混合并将它们转移到比色皿中。轻轻敲击比色皿以去除任何残留的气泡后，将比色皿插入转染系统的支架并电穿孔细胞。电穿孔后立即加入400微升不含青霉素链霉素的预热造血干细胞和祖细胞保留培养基，并用细转移移液管将细胞转移到含有预热造血干细胞和不含青霉素链霉素的祖细胞保留培养基的培养板中。然后将板转移到培养箱中。在冰上解冻含有冷冻重组AAV的小瓶，并通过将每种重组AAV6的最佳量移液到细胞悬液中来转导细胞。将细胞悬液与移液器轻轻混合后，将转导的细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育6至8小时。六到八个小时后，将细胞收集在管中，并在室温下以350 G离心五分钟。弃去上清液，用补充有青霉素链霉素的新鲜预热造血干细胞和祖细胞保留培养基代替，并将细胞转移到细胞培养板上。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育48小时。为了对带有杂合功能获得突变的工程细胞进行流动分选，将细胞收获在 15 毫升管中，并在室温下以 350 G 离心五分钟，如前所述。除去上清液并将细胞悬浮在含有0.1%PSA的一毫升DPBS中，并在室温下再次以350G离心5分钟。弃去上清液后，根据先前所示的细胞数，将细胞悬浮在适当体积的DPBS加0.1%BSA中。将细胞转移到配有盖子的无菌传真管中，并向细胞悬液中加入七种AAD或其他活性染料以进行活/死细胞排除。将荧光报告蛋白双重阳性的活细胞分选到含有200微升造血干和祖细胞保留培养基的收集管中。如前所述，将分选的细胞在室温下以350 G离心5分钟后，浓度为每毫升250，000个细胞，以便在培养物中进一步扩增或直接将细胞用于功能测定。在用核糖核蛋白复合物转流和用重组AAV6病毒转导两天后，通过流式细胞术分析细胞。检测到四个主要群体，包括没有基于HDR的基因组编辑的细胞，这些细胞既不表达GFP细胞，也不表达仅对GFP阳性的细胞，仅整合野生型构建体，仅对BFP呈阳性的细胞仅整合突变型构建体，以及GFP和BFP双阳性细胞，同时整合野生型和突变序列。为了验证杂合钙网蛋白突变的成功敲入，对仅与AAV孵育的细胞以及与核糖核蛋白和AAV一起孵育的细胞与敲入的钙网蛋白野生型和钙网蛋白缺失序列一起孵育的细胞进行了PCR。在DNA提取之前，根据两个荧光报告基因的同时表达对细胞进行分选。凝胶电泳后，从凝胶中切除单个条带并提取DNA用于随后的Sanger测序。测序结果证实野生型和突变序列在杂合钙网状突变造血干细胞和祖细胞中成功无缝整合。尝试此过程时要记住的最重要的事情是仔细选择性能最佳的单向导RNA，因为这将决定整体HDR效率，从而决定成功敲入杂合突变的频率。按照此过程，基因工程细胞可用于功能性体外和体内实验，例如集落形成单位测定，分化测定和移植到免疫缺陷小鼠中。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

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科研

癌症研究

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Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

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