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March 10th, 2023
DOI :
March 10th, 2023
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Introduction
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sgRNA Design
1:57
Homology-Directed Repair Vector Construction
5:42
Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells
9:48
Results: Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining the Use of CRISPR/Cas9 and Dual rAAV Donor Transduction
11:19
Conclusion
Transcript
यह विधि प्राथमिक मानव हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं में आवर्तक ल्यूकेमोजेनिक गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन के सटीक मॉडलिंग की अनुमति देती है और इस तरह ल्यूकेमिक परिवर्तन में भूमिका की जांच करती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि CRISPR-Cas9-आधारित उत्परिवर्तन इंजीनियरिंग को एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की शुरूआत के साथ जोड़ा जाता है। यह विशिष्ट रूप से शुद्ध विषम-उत्परिवर्तित सेल आबादी की पहचान, संवर्धन और ट्रैकिंग की अनुमति देता है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन मेरी प्रयोगशाला से एक पोस्ट-डॉक्टरेट रिसर्च फेलो टॉमासो स्कोनोकिया होगा। शुरू करने के लिए, प्लस क्रिएट विकल्प का चयन करके ऑनलाइन बेंचलिंग डिज़ाइन टूल का उपयोग करके एकल गाइड आरएनए डिज़ाइन करें। फिर, डीएनए अनुक्रम पर क्लिक करें "इसके बाद डीएनए अनुक्रम आयात करें" और डेटाबेस से आयात करें"विकल्प।
फिर वांछित जीन दर्ज करें और प्रजातियों के रूप में मानव का चयन करें। खोज "विकल्प" पर क्लिक करें और सही प्रतिलेख आयात का चयन करें। डबल स्ट्रैंड ब्रेक पेश करने के लिए रुचि के क्षेत्र का चयन करें।
फिर स्क्रीन के दाईं ओर CRISPR"विकल्प का चयन करें, इसके बाद डिज़ाइन और विश्लेषण गाइड। इसके बाद, एसपी-सीएएस 9 के साथ संपादन के लिए गाइड की लंबाई को 20 बेस जोड़े और पीएएम अनुक्रम रखते हुए एकल गाइड का चयन करें। एक उच्च ऑन-टारगेट स्कोर और एक उच्च ऑफ-टारगेट स्कोर के साथ एक गाइड चुनें और एक वाणिज्यिक विक्रेता से रासायनिक रूप से संशोधित सिंथेटिक सिंगल गाइड आरएनए के रूप में एकल गाइड आरएनए का आदेश दें।
एचडीआर टेम्पलेट को डिजाइन करने के लिए, आणविक क्लोनिंग के लिए सॉफ्टवेयर में जीनोमिक अनुक्रम और कोडिंग अनुक्रम आयात करें। जीनोमिक अनुक्रम फ़ाइल से, डबल स्ट्रैंड ब्रेक के पांच प्रमुख छोर पर आदर्श रूप से, 400 बेस जोड़े का चयन करके बाएं होमोलॉजी आर्म को डिज़ाइन करें और इस अनुक्रम को एक नई फ़ाइल में पेस्ट करें। जीनोमिक अनुक्रम फ़ाइल से, लक्षित इंट्रोन के अंतिम 150 बेस जोड़े का चयन करके और इसे बाएं होमोलॉजी आर्म के बाद चिपकाकर स्प्लिस स्वीकर्ता अनुक्रम डिजाइन करें।
कोडिंग अनुक्रम फ़ाइल से, रुचि के सीडीएनए का चयन करें। कोडन सीडीएनए को अनुकूलित करता है और स्प्लिस स्वीकर्ता अनुक्रम के बाद इसे सम्मिलित करता है। रुचि के सीडीएनए के बाद, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए प्रमोटर अनुक्रम के बाद तीन प्रमुख पॉलीएडेनाइलेशन सिग्नल डालें।
फिर, फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक दूसरे, लेकिन अलग पॉलीएडेनाइलेशन सिग्नल के लिए अनुक्रम डालें। जीनोमिक अनुक्रम फ़ाइल से, डबल स्ट्रैंड ब्रेक के तीन प्रमुख छोर पर आदर्श रूप से 400 बेस जोड़े का चयन करके सही होमोलॉजी आर्म डिज़ाइन करें और दूसरे पॉलीएडेनाइलेशन के बाद अनुक्रम डालें। फिर, पूरे टेम्पलेट की एक प्रति बनाएं और रुचि के सीडीएनए को संशोधित करें ताकि इसमें वांछित उत्परिवर्तन का अनुक्रम हो।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक्सचेंज करें। एएवी अभिव्यक्ति वेक्टर में एचडीआर टेम्प्लेट का निर्माण और क्लोन करें। पुनः संयोजक एएवी 6 तैयारी के लिए, 10% एफबीएस, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन और 25 मिलीमोलर एचईपीईएस के साथ पूरक डीएमईएम के 20 मिलीलीटर में 11 मिलियन हेके293 टी वाले 10 150 मिलीमीटर व्यंजन तैयार करें।
फिर, व्यंजनों को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 24 घंटे के लिए रखें। पुराने माध्यम को सावधानीपूर्वक त्यागने के बाद, इसे 20 मिलीलीटर एंटीबायोटिक-मुक्त डीएमईएम के साथ बदलें जो 10% एफबीएस, 25 मिलीमोलर एचईपीईएस और एक मिलीमोलर सोडियम ब्यूटाइरेट के साथ पूरक है। इसके बाद, दो 15 मिलीलीटर ट्यूब तैयार करें जिन्हें ट्यूब एक और दो लेबल किया गया है।
ट्यूब एक में, कम सीरम माध्यम के पांच मिलीलीटर, पुनः संयोजक एएवी 6-उत्परिवर्तित एचडीआर प्लास्मिड के 60 माइक्रोग्राम और पीडीजीएम 6 हेल्पर प्लास्मिड के 220 माइक्रोग्राम जोड़ें। ट्यूब दो के लिए, कम सीरम माध्यम के पांच मिलीलीटर और एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पॉलीथीन अमाइन समाधान के 1120 माइक्रोलीटर जोड़ें। ट्यूब दो की सामग्री को ट्यूब वन में जोड़ने के बाद, 30 सेकंड के लिए भंवर, और फिर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
सावधानी से प्रत्येक डिश में घोल के ड्रॉप-वार 1.1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से घूमकर वितरित करें। व्यंजनों को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 48 घंटे के लिए रखें। फिर प्रत्येक डिश में 0.5 मोलर ईडीटीए के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें और उन्हें 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें।
डिश को धोकर कोशिकाओं को काटें और 500 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूज 2000 जी पर 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर और सतह पर तैरने वाला छोड़ दें। भंवर द्वारा गोली को ढीला करें और एएवी शुद्धिकरण किट का उपयोग करके वायरस निकालें।
शुद्ध वायरस को एलिकोट करने के बाद, इसे शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस नीचे स्टोर करें। सीडी 34 पॉजिटिव हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं को पिघलाने के बाद, कोशिकाओं को 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 10 मिलीलीटर पूर्व-गर्म आरपीएमआई में स्थानांतरित करें। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 350 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल प्रतिधारण माध्यम में कोशिकाओं को 250,000 कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता तक निलंबित करें और 72 घंटों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर ट्यूब में काटें। ट्राइपैन ब्लू बहिष्करण द्वारा सेल व्यवहार्यता की गणना और जांच करें।
राइबोक्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स तैयार करने के लिए, 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कैस 9 के 15 माइक्रोग्राम और एकल गाइड आरएनए के आठ माइक्रोग्राम जोड़ें और हीटिंग ब्लॉक में 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जबकि राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स इनक्यूबेट हो रहा है, कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए 350 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। न्यूक्लियोफेक्शन समाधान के 100 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को निलंबित करने के बाद, कोशिकाओं को राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स के साथ मिलाएं और उन्हें क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
किसी भी अवशिष्ट हवा के बुलबुले को हटाने के लिए क्यूवेट को धीरे से टैप करने के बाद, क्वेट को अभिकर्मक प्रणाली के धारक में डालें और कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करें। इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद, पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के बिना प्री-वार्मेड हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल प्रतिधारण माध्यम के 400 माइक्रोलीटर जोड़ें और पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के बिना प्री-वार्मेड हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल प्रतिधारण माध्यम वाले कल्चर प्लेट में एक महीन स्थानांतरण पिपेट के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। फिर प्लेट को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
बर्फ पर जमे हुए पुनः संयोजक एएवी युक्त शीशियों को पिघलाएं और प्रत्येक पुनः संयोजक एएवी 6 की इष्टतम मात्रा को सेल निलंबन में पाइप करके कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें। धीरे से सेल निलंबन को पिपेट के साथ मिलाने के बाद, ट्रांसड्यूस कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर छह से आठ घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। छह से आठ घंटे के बाद, कोशिकाओं को एक ट्यूब में इकट्ठा करें और उन्हें पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 350 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
सुपरनैटेंट को त्याग दें और इसे पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक ताजा प्री-वार्मेड हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल प्रतिधारण माध्यम के साथ बदलें और कोशिकाओं को सेल कल्चर प्लेट में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। विषमयुग्मी गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन वाले इंजीनियर कोशिकाओं को क्रमबद्ध करने के लिए, कोशिकाओं को 15 मिलीलीटर ट्यूब में काटें और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 350 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें जैसा कि पहले दिखाया गया था।
सतह पर तैरने वाले को हटा दें और कोशिकाओं को डीपीबीएस के एक मिलीलीटर में 0.1% पीएसए और सेंट्रीफ्यूज युक्त कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए फिर से 350 ग्राम पर निलंबित करें। सुपरनैटेंट को त्यागने के बाद, सेल संख्या के आधार पर डीपीबीएस प्लस 0.1% बीएसए की उचित मात्रा में कोशिकाओं को निलंबित करें जैसा कि पहले दिखाया गया है। कोशिकाओं को कैप से लैस बाँझ फैक्स ट्यूब में स्थानांतरित करें और जीवित / मृत सेल बहिष्करण के लिए सेल निलंबन में सात एएडी या अन्य व्यवहार्यता डाई जोड़ें।
फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के लिए डबल पॉजिटिव जीवित कोशिकाओं को एक संग्रह ट्यूब में क्रमबद्ध करें जिसमें हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल प्रतिधारण माध्यम के 200 माइक्रोलीटर होते हैं। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 350 जी पर क्रमबद्ध कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करने के बाद, संस्कृति में आगे विस्तार के लिए प्रति मिलीलीटर 250,000 कोशिकाओं की एकाग्रता या कार्यात्मक परख के लिए सीधे कोशिकाओं का उपयोग करें। राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स के साथ संक्रमण और पुनः संयोजक एएवी 6 वायरस के साथ पारगमन के दो दिन बाद, कोशिकाओं का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था।
चार मुख्य आबादी का पता लगाया गया था, जिसमें एचडीआर-आधारित जीनोम संपादन वाली कोशिकाएं शामिल थीं, जो न तो जीएफपी और न ही बीएफपी कोशिकाओं को केवल जीएफपी के लिए सकारात्मक व्यक्त करती हैं, केवल जंगली प्रकार के निर्माण के साथ एकीकृत कोशिकाएं, केवल उत्परिवर्तित निर्माण एकीकृत के साथ बीएफपी के लिए सकारात्मक कोशिकाएं, और जंगली प्रकार और उत्परिवर्तित अनुक्रम दोनों के साथ जीएफपी और बीएफपी डबल पॉजिटिव कोशिकाएं एकीकृत हैं। पीसीआर में/आउट विषमयुग्मी कैलेरेटिकुलिन उत्परिवर्तनों के सफल नॉक-इन को मान्य करने के लिए केवल एएवी के साथ इनक्यूबेट की गई कोशिकाओं से निकाले गए जीनोमिक डीएनए पर और राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन और एएवी के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं से नॉक-इन कैलेरेटिकुलिन जंगली प्रकार और कैलेरेटिकुलिन विलोपन अनुक्रम के साथ प्रदर्शन किया गया था। डीएनए निष्कर्षण से पहले दोनों प्रतिदीप्ति संवाददाताओं की एक साथ अभिव्यक्ति के आधार पर कोशिकाओं को क्रमबद्ध किया गया था।
जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद, जेल से अलग-अलग बैंड निकाले गए और बाद में सेंगर अनुक्रमण के लिए डीएनए निकाला गया। अनुक्रमण के परिणामों ने जंगली प्रकार के सफल निर्बाध एकीकरण और विषमयुग्मी कैलरेटिकुलिन-उत्परिवर्तित हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं में उत्परिवर्तित अनुक्रमों की पुष्टि की। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय याद रखने वाली सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाले एकल गाइड आरएनए का सावधानीपूर्वक चयन करें, क्योंकि यह समग्र एचडीआर दक्षता निर्धारित करेगा और इसलिए, विषम उत्परिवर्तन के सफल नॉक-इन की आवृत्ति।
इस प्रक्रिया के बाद, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर कोशिकाओं का उपयोग कार्यात्मक इन-विट्रो और इन-विवो प्रयोगों के लिए किया जा सकता है जैसे कि कॉलोनी बनाने वाली इकाई परख, भेदभाव परख, और प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहों में प्रत्यारोपण।
हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) में दैहिक उत्परिवर्तन को ईमानदारी से मॉडल करने के लिए नई रणनीतियां हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल जीव विज्ञान और हेमेटोलॉजिकल विकृतियों का बेहतर अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं। यहां, CRISPR / Cas9 और दोहरे rAAV दाता पारगमन के उपयोग के संयोजन से HSPCs में विषम लाभ-ऑफ-फ़ंक्शन उत्परिवर्तन को मॉडल करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।
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