이 방법을 사용하면 1차 인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 재발성 백혈구 기능 획득 돌연변이를 정밀하게 모델링하여 백혈병 변형에서의 역할을 조사할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 CRISPR-Cas9 기반 돌연변이 공학이 형광 리포터의 도입과 결합된다는 것입니다. 이를 통해 순수 이형접합체 돌연변이 세포 집단의 식별, 농축 및 추적을 고유하게 수행할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사후 연구원 인 Tommaso Sconocchia입니다. 시작하려면 더하기 만들기 옵션을 선택하여 온라인 벤치링 설계 도구를 사용하여 단일 가이드 RNA를 설계합니다. 그런 다음 DNA 서열"다음 DNA 서열 가져 오기"및 데이터베이스에서 가져 오기"옵션을 클릭하십시오.
그런 다음 원하는 유전자를 입력하고 인간"을 종으로 선택하십시오. 검색"옵션을 클릭하고 올바른 성적 증명서 가져 오기를 선택하십시오. 이중 스트랜드 브레이크를 도입할 관심 영역을 선택합니다.
그런 다음 화면 오른쪽에서 CRISPR" 옵션을 선택한 다음 설계 및 분석 가이드를 선택합니다. 다음으로 SP-Cas9로 편집하기 위해 가이드 길이를 20 염기쌍과 PAM 시퀀스로 유지하면서 단일 가이드를 선택하십시오. 높은 온 타겟 점수와 높은 오프 타겟 점수를 가진 가이드를 선택하고 단일 가이드 RNA를 상용 공급 업체의 화학적으로 변형 된 합성 단일 가이드 RNA로 주문하십시오.
HDR 템플릿을 설계하려면 게놈 서열과 코딩 서열을 분자 클로닝을 위해 소프트웨어로 가져옵니다. 게놈 서열 파일로부터, 이상적으로는 이중 가닥 절단의 5개의 프라임 말단에서 400개의 염기쌍을 선택하여 왼쪽 상동성 암을 설계하고 이 서열을 새 파일에 붙여넣는다. 게놈 서열 파일로부터, 표적화된 인트론의 마지막 150개 염기쌍을 선택하고 이를 좌측 상동성 암 뒤에 붙여넣음으로써 스플라이스 수용체 서열을 설계한다.
코딩 서열 파일에서, 관심 있는 cDNA를 선택한다. 코돈은 cDNA를 최적화하고 스플라이스 수용체 서열 뒤에 삽입한다. 관심있는 cDNA 후에, 형광 단백질에 대한 프로모터 서열을 따르는 3개의 프라임 폴리아데닐화 신호를 삽입한다.
이어서, 형광 단백질과 상이한 폴리아데닐화 신호에 대한 서열을 삽입한다. 게놈 서열 파일로부터, 이중 가닥 절단의 3개의 프라임 말단에 이상적으로 400개의 염기쌍을 선택하여 우측 상동성 암을 설계하고 2차 폴리아데닐화 후에 서열을 삽입한다. 그런 다음 전체 템플릿의 사본을 만들고 원하는 돌연변이의 서열을 포함하도록 관심 있는 cDNA를 수정합니다.
형광 단백질을 다른 형광 단백질로 교환한다. HDR 템플릿을 구성하고 AAV 발현 벡터에 클로닝합니다. 재조합 AAV6 준비를 위해 10% FBS, 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 25밀리몰 hepes가 보충된 DMEM 20밀리리터에 각각 1,100만 HECK293T가 포함된 10개의 150mm 접시를 준비하십시오.
그런 다음 접시를 섭씨 37도, 5%이산화탄소의 인큐베이터에 24시간 동안 두십시오. 오래된 배지를 조심스럽게 버린 후 10 % FBS, 25 밀리몰 hepes 및 1 밀리몰 나트륨 부티레이트가 보충 된 항생제가없는 DMEM 20 밀리리터로 교체하십시오. 다음으로, 튜브 1과 2라고 표시된 두 개의 15 밀리리터 튜브를 준비하십시오.
튜브 1에 5밀리리터의 환원된 혈청 배지, 60마이크로그램의 재조합 AAV6 돌연변이 HDR 플라스미드 및 220마이크로그램의 PDGM6 헬퍼 플라스미드를 추가합니다. 튜브 2에 5 밀리리터의 환원 된 혈청 배지와 1120 밀리리터 당 1 밀리그램의 폴리에틸렌 아민 용액을 첨가하십시오. 튜브 2의 내용물을 튜브 1에 첨가한 후 30초 동안 와동시킨 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다.
조심스럽게 각 접시에 1.1 밀리리터의 용액을 떨어 뜨리고 부드럽게 소용돌이 치며 분배하십시오. 접시를 섭씨 37도, 5%이산화탄소의 인큐베이터에 48시간 동안 두십시오. 그런 다음 각 접시에 250 마이크로 리터의 0.5 몰 EDTA를 넣고 10 분 동안 인큐베이터에 넣으십시오.
접시에서 세포를 씻어서 수확하고 500 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 10분 동안 2000G에서 원심분리하고 상층액을 버린다. 소용돌이 현상을 통해 펠릿을 풀고 AAV 정제 키트를 사용하여 바이러스를 추출합니다.
정제 된 바이러스를 분취 한 후 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. CD34 양성 조혈 줄기 및 전구 세포를 해동 한 후, 세포를 1 % 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 된 예열 된 RPMI 10ml로 옮깁니다. 실온에서 350G에서 10 분 동안 원심 분리합니다.
조혈 줄기 및 전구 세포 보유 배지에 세포를 밀리리터 당 250, 000 세포 농도로 현탁시키고 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 72 시간 동안 배양합니다. 다음으로 15 밀리리터 튜브에서 세포를 수확하십시오. 트리판 블루 배제에 의한 세포 생존율을 계수하고 확인한다.
리보 쿠클 레오 단백질 복합체를 준비하려면 1.5 밀리리터 튜브에 15 마이크로 그램의 Cas9와 8 마이크로 그램의 단일 가이드 RNA를 넣고 가열 블록에서 섭씨 25도에서 10 분 동안 배양합니다. 리보 핵 단백질 복합체가 배양되는 동안 세포를 350G에서 5 분 동안 원심 분리하고 상청액을 버립니다. 세포를 100 마이크로 리터의 뉴 클레오 펙션 용액에 현탁시킨 후, 세포를 리보 핵 단백질 복합체와 혼합하고 큐벳으로 옮깁니다.
큐벳을 부드럽게 두드려 잔류 기포를 제거한 후 큐벳을 형질주입 시스템의 홀더에 삽입하고 세포를 전기천공합니다. 전기 천공 직후, 페니실린 스트렙토 마이신이없는 400 마이크로 리터의 예열 된 조혈 줄기 및 전구 세포 보존 배지를 추가하고 미세 전달 피펫으로 세포를 페니실린 스트렙토 마이신이없는 사전 예열 된 조혈 줄기 및 전구 세포 보유 배지가 들어있는 배양 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다.
동결된 재조합 AAV를 함유하는 바이알을 얼음 상에서 해동하고, 각각의 재조합 AAV6의 최적량을 세포 현탁액에 피펫팅하여 세포를 형질도입한다. 세포 현탁액을 피펫과 부드럽게 혼합한 후, 형질도입된 세포를 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 6 내지 8시간 동안 배양한다. 6 내지 8시간 후, 세포를 튜브에 모으고 실온에서 350G에서 5분 동안 원심분리한다.
상청액을 버리고 페니실린 스트렙토 마이신이 보충 된 새로운 예열 된 조혈 줄기 및 전구 세포 보유 배지로 교체하고 세포를 세포 배양 플레이트로 옮깁니다. 세포를 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 48 시간 동안 배양하십시오. 이형접합체 기능 획득 돌연변이가 있는 조작된 세포를 유동 분류하려면 15밀리리터 튜브에서 세포를 수확하고 앞에서 설명한 대로 실온에서 350G에서 5분 동안 원심분리합니다.
상청액을 제거하고 세포를 0.1% PSA를 함유하는 DPBS 1밀리리터에 현탁시키고 실온에서 350G에서 5분 동안 다시 원심분리한다. 상청액을 폐기한 후 이전에 입증된 세포 수에 따라 적절한 부피의 DPBS와 0.1% BSA에 세포를 현탁시킵니다. 세포를 캡이 장착된 멸균 팩스 튜브로 옮기고 살아있는/죽은 세포 배제를 위해 세포 현탁액에 7개의 AAD 또는 기타 생존 염료를 추가합니다.
형광 리포터 단백질에 대해 이중 양성인 살아있는 세포를 200마이크로리터의 조혈 줄기 및 전구 세포 보유 배지가 들어 있는 수집 튜브에 분류합니다. 이전에 입증된 바와 같이 분류된 세포를 실온에서 5분 동안 350G에서 원심분리한 후, 배양에서 추가 확장을 위해 밀리리터당 250, 000 세포의 농도로 하거나 세포를 기능 분석을 위해 직접 사용한다. 리보 핵 단백질 복합체를 사용한 형질 도입 및 재조합 AAV6 바이러스로 형질 도입 한 지 이틀 후, 세포를 유세포 분석기에 의해 분석하였다.
야생형 구축물만 통합된 GFP에 대해서만 양성인 GFP 또는 BFP 세포를 발현하지 않는 HDR 기반 게놈 편집이 없는 세포, 돌연변이된 구축물만 통합된 BFP에 대해서만 양성인 세포, 야생형 및 돌연변이 서열이 모두 통합된 GFP 및 BFP 이중 양성 세포를 포함하여 4개의 주요 집단이 검출되었습니다. 이형접합체 칼레티쿨린 돌연변이의 성공적인 녹인을 검증하기 위해 AAV만 배양한 세포와 녹인 칼레티쿨린 야생형 및 칼레티쿨린 결실 서열을 가진 리보핵단백질 및 AAV로 배양된 세포에서 추출한 게놈 DNA에 대해 PCR을 수행했습니다. 세포는 DNA 추출 전에 두 형광 리포터의 동시 발현에 기초하여 분류하였다.
겔 전기영동 후, 개별 밴드를 겔로부터 절제하고, 후속 Sanger 시퀀싱을 위해 DNA를 추출하였다. 시퀀싱 결과는 이형 접합 calreticulin-돌연변이 조혈 줄기 및 전구 세포에서 야생형 및 돌연변이 서열의 성공적인 원활한 통합을 확인했습니다. 이 절차를 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 전체 HDR 효율과 이형 접합 돌연변이의 성공적인 녹인 빈도를 결정하기 때문에 가장 성능이 좋은 단일 가이드 RNA를 신중하게 선택하는 것입니다.
이 절차에 따라 유전자 조작 세포는 콜로니 형성 단위 분석, 분화 분석 및 면역 결핍 마우스로의 이식과 같은 기능적 시험관 내 및 생체 내 실험에 사용될 수 있습니다.
