Name: engineering oncogenic heterozygous gain-of-function mutations in human hematopoietic stem and progenitor cells
Uploaded: 2023-03-10T14:50:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu'ndan (FWF; sayı P32783 ve I5021) A.R.'ye verilen hibelerle desteklenmektedir. A.R.'ye ek fon, Avusturya İç Hastalıkları Derneği (Joseph Skoda Bursu), Avusturya Hematoloji ve Onkoloji Derneği (OeGHO; Klinik Araştırma Bursu) ve MEFOgraz. T.K. Lösemi ve Lenfoma Derneği'nin Özel Üyesidir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

İnsan primer HSPC'lerinin verimli ve kesin genetik manipülasyonu, normal hematopoezi ve en önemlisi hematopoetik hücrelerin lösemik transformasyonunu etkileyen süreçleri keşfetmek ve anlamak için harika bir fırsatı temsil eder.
Bu protokolde, tekrarlayan heterozigot GOF mutasyonlarını ifade etmek için insan HSPC'lerini tasarlamak için etkili bir strateji tanımlanmıştır. Bu prosedür, WT ve mutant DNA dizilerini endojen gen lokuslarına hassas bir şekilde eklemek için DNA şablonları için bağışçı olarak CRISPR / Cas9 teknolojisinden ve rAAV6 vektörlerinden yararlandı. Tasarlanmış cDNA'ların (WT ve mutant) ayrı floresan muhabir proteinleri ile bağlanması, kesin bir heterozigot duruma sahip hücrelerin zenginleşmesini ve izlenmesini sağlar.
Bu strateji, sık kullanılan lentiviral (LV) tabanlı yöntemlere kıyasla çeşitli avantajlar sunmaktadır. Ana avantajlardan biri, CRISPR / Cas9 tabanlı sistemin endojen lokuslarda hassas düzenlemeye izin vermesidir, bu da endojen promotörlerin ve düzenleyici elemanların korunmasını sağlar. Bu, hücrelerde düzenlenmiş genin ekspresyonunda homojenliğe yol açar; bu, LV tabanlı bir yöntem kullanıldığında zorlukla ulaşılabilen bir hedeftir. AG vektörleri ile gen transferi, transkripsiyonel olarak aktif bölgeler tercih edilerek genin yarı rastgele entegrasyonuna yol açar34. Bu, aktarılan genin aşırı ekspresyonuna ve düzenlenmiş hücreler arasındaki heterojenliğe dönüşebilir ve sonuçta mutasyonların ve gen etkileşimlerinin rolünü araştırmak ve analiz etmek için zorluklara neden olabilir. İkinci bir avantaj, tarif edilen sistemin, siteye özgü bir düzenleme sistemi olarak, ekleme mutajenezi35 risklerini ortadan kaldırmasıdır.
Çift floresan muhabir stratejisi, her iki alel üzerinde başarılı bir şekilde düzenlenmiş hücrelerin hassas bir şekilde zenginleştirilmesine ve izlenmesine izin verir; bir alel WT cDNA'yı entegre eder ve diğer alel mutasyona uğramış cDNA dizilerini bütünleştirir. Yalnızca tek bir muhabiri ifade eden hücreler, HDR şablonlarının aynı floresan muhabirle yalnızca monoallelik entegrasyonunu veya bialelik entegrasyonunu temsil eder. Her iki senaryo da ancak tek hücreden türetilmiş klonlar üretilir ve ayrı ayrı analiz edilirse kesin olarak ayırt edilebilir. Bununla birlikte, HSPC'ler in vitro olarak sadece sınırlı proliferatif kapasiteye sahiptir ve kültürde uzun süre tutulduğunda, HSPC'ler daha olgun soylara farklılaşmaya başlar ve kendini yenileme ve aşılama kapasitelerini kaybeder. Bu, istenen heterozigot mutasyonu barındıran tek hücreli klonların seçilmesini ve genişletilmesini mümkün kılmaz. Çift floresan protein stratejisinin uygulanması ve heterozigot mutasyonu taşıyan hücreler için akış sitometrisi ile zenginleştirilmesi, genişletilmiş in vitro kültürün neden olduğu sorunların atlanmasına izin verir.
Bu özel örnekte, heterozigot CALRDEL / WT mutasyonunu taşıyan HSPC'lerin saf popülasyonlarını elde etmek için HSPC'lerin verimli bir şekilde tasarlanabileceği ve sıralanabileceği başarıyla gösterilmiştir.
Bununla birlikte, bu sistem heterozigot çerçeve kaydırma mutasyonlarının mühendisliği ile sınırlı değildir, aynı zamanda yanlış ve saçma mutasyonlar da dahil olmak üzere diğer mutasyon türlerini oluşturmak için kolayca benimsenebilir. WT içeren AAV'lerin farklı kombinasyonlarını veya farklı floresan raporlayıcı proteinleri ile mutasyona uğramış dizileri uygulayarak, bu sistem homozigot mutasyonların tanıtılması (her ikisi de mutant cDNA taşıyan ancak farklı floresan muhabirleri taşıyan iki rAAV ile eşzamanlı transdüksiyon) veya hatta mutasyonların düzeltilmesi (her ikisi de WT cDNA taşıyan iki AAV ile eşzamanlı transdüksiyon) için de kullanılabilir. Ek olarak, bu stratejinin onkojenik GOF mutasyonlarının tanıtılmasıyla sınırlı olmadığını belirtmek önemlidir. Aslında, tarif edilen protokol, gen nakavtı, gen replasmanı36,37, transgenlerin hedefli knock-in'i (yani, kimerik antijen reseptörleri)38 ve hatta hastalığa neden olan mutasyonların düzeltilmesi 11,39 dahil olmak üzere çoklu alternatif stratejiler için kullanılabilir.
CRISPR / Cas9 ve AAV6'yı çoklu floresan muhabirlerle birleştirme stratejisinin, T hücreleri, plazmasitoid dendritik hücreler, indüklenmiş pluripotent kök hücreler, nöronal kök hücreler ve hava yolu kök hücreleri 24,38,40,41,42,43,44 dahil olmak üzere diğer birçok hücre tipinde de uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. . Bu strateji, üstün kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin üretimi için uygulanabilir. Örneğin, yakın zamanda, CAR T hücrelerindeki TGFBR2 geninin CRISPR / Cas9 aracılı nakavtının, baskılayıcı TGF β zengin tümör mikroçevre45'teki işlevlerini büyük ölçüde arttırdığı yayınlanmıştır. Böyle bir yaklaşım, hem CAR'ı eksprese etmek için T hücrelerinin mühendisliğini yapmak hem de TGFBR2 genini CAR'ı TGFBR2 geninin her iki aleline özel olarak yerleştirerek bölgeye göre nakavt etmek için tek adımlı bir protokol sağlayabilir. Dahası, bu yaklaşım, CAR'ı T hücresi reseptörü alfa sabiti (TRAC) geni46,47'ye entegre ederek evrensel CAR T hücreleri üretmek için de yararlı olabilir.
Tekrarlanabilirliği arttırmak ve hücrelerin verimli bir şekilde düzenlenmesini garanti etmek için, bazı önemli hususlara dikkat edilmesi gerekir. Hücrelerin başarılı bir şekilde düzenlenmesini sağlamak için ana kritik noktalar (i) sgRNA'nın seçimi, (ii) HDR şablonunun tasarımı ve (iii) rAAV6 üretiminde bulunur.
İyi performans gösteren bir sgRNA'nın seçimi, HDR şablonunun entegre edilebileceği maksimum alel sayısını belirleyeceği için çok önemlidir. Şu anda mevcut olan çok sayıda yazılım nedeniyle, aday sgRNA'ların araştırılması basitleştirilmiştir. İlgilenilen bölgeyi seçerek, yazılım sırasıyla istenen lokusta ve istenmeyen lokusta düzenleme şansını gösteren hedef üstü puana ve hedef dışı puana sahip bir dizi sgRNA önerebilir. Bu puanlar daha önce yayınlanmış48,49 puanlama modellerine göre hesaplanmıştır. Bu, iyi performans gösteren bir sgRNA seçmek için iyi bir başlangıç noktası olmasına rağmen, silikodaki öngörülen performansı her zaman in vitro olarak verimli bir sgRNA'ya karşılık gelmediğinden, sgRNA'nın performansının doğrulanması gerekir. Bu nedenle, en iyi sgRNA'yı bulma şansını artırmak için en az üç sgRNA tasarlamanız ve test etmeniz şiddetle tavsiye edilir. Gerçek bir iyi performans gösteren sgRNA tanımlandıktan sonra, HDR şablonunun tasarımına devam edilmesi önerilir.
HDR şablonunu tasarlarken önlemler dikkate alınmalıdır. Sol ve sağ homoloji kollarının (sırasıyla LHA ve RHA) her biri sırasıyla sgRNA kesim bölgesinin yukarı ve aşağı yönünde 400 bp yayılmalı, çünkü daha kısa HA'lar HDR frekanslarının azalmasına neden olabilir. HDR ile tanıtılabilen cDNA'nın boyutu, kabaca 4,7 kb olan AAV'lerin paketleme yeteneklerine bağlıdır. HDR şablonunda zorunlu olan çok sayıda öğe (LHA, RHA, SA, PolyA, promotör ve floresan muhabir dizisi) nedeniyle, mutasyona uğramış veya WT cDNA için kalan alan sınırlıdır. İstenilen mutasyon bir genin 3' ucunun yakınında veya genel olarak kısa bir CDS'ye sahip genlerde bulunuyorsa bu sorunsuzdur. Bununla birlikte, mutasyonun uzun bir CDS'li genlerin transkripsiyonel başlangıç tarafına (TSS) yakın bir yerde bulunduğu durumlarda (AAV'nin kalan paketleme alanını aşarak), bu tarif edilen yaklaşım mümkün olmayabilir. Bu sorunu aşmak için, HDR şablonunu iki AAV'ye bölmeye dayanan bir strateji yakın zamanda Bak ve meslektaşları tarafından geliştirilmiştir. Bu strateji, büyük bir gen50'nin nihai kesintisiz entegrasyonunu elde etmek için iki ayrı HDR aracılı entegrasyona dayanır.
Virüsün kalitesi ve titresi, hücrelerin başarılı genom mühendisliğini yapabilen veya bozabilen ek faktörlerdir. Optimum verim için, HEK293T'nin kültürde korunurken tam akıcılığa ulaşmasına izin vermemek önemlidir. İdeal olarak, HEK293T hücreleri% 70-80 akıcılığa ulaşıldığında bölünmelidir. Ek olarak, HEK293T uzun süre kültürlenmemelidir, çünkü bu onların virüs üretme yeteneklerini azaltabilir. Yeni HEK293T hücrelerinin 20 geçişten sonra çözülmesi gerekir. Yüksek virüs titreleri elde etmek, deneylerin verimliliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmak için önemlidir. Düşük viral titreler, HSPC'lerin transdüksiyonu için gerekli olan büyük hacimli rAAV çözeltisine dönüşecektir. Genel bir kural olarak, çekirdeklendirilmiş hücrelere eklenen rAAV çözeltisi, HSPC tutma ortamının toplam hacminin% 20'sini geçmemelidir. Daha yüksek hacimli AAV solüsyonu hücre ölümünün artmasına, proliferasyonun azalmasına ve transdüksiyon verimliliğinin bozulmasına neden olabilir. Düşük virüs titreleri durumunda, bu nedenle virüsün daha da konsantre edilmesi önerilir.
Özetle, bu protokol, ek çift floresan muhabirlerle CRIPSR / Cas9 ve rAAV6 donör şablonlarının eşzamanlı kullanımı yoluyla insan HSPC'lerini hassas ve verimli bir şekilde manipüle etmek için tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar. Bu yaklaşımın normal hematopoetik kök hücre biyolojisini ve mutasyonların löseminogeneze yaptığı katkıları incelemede harika bir araç olduğu kanıtlanmıştır.

Kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmiş kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / Cas9 teknolojisinin geliştirilmesiyle, bilim adamlarının araç setine yeni ve son derece güçlü bir cihaz eklenmiştir. Bu teknoloji, genomun hassas mühendisliğine izin verir ve sadece araştırma amaçlı değil (Hsu ve ark.1'de gözden geçirilmiştir) son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır, ancak daha yakın zamanda 2,3,4 klinik ortamına da başarıyla çevrilmiştir. CRISPR / Cas9 düzenleme stratejileri, bir Cas9 proteininin aktivitesine ve tek kılavuzlu bir RNA'ya (sgRNA) dayanır5,6,7. Konakçı hücrede, Cas9 proteini, DNA'da sgRNA dizisini tamamlayan ve bir DNA çift iplikçik kırılması (DSB) getirecek olan belirli bir bölgeye yönlendirilir. Bir DSB oluşturulduktan sonra, oluşabilecek iki ana ve rakip onarım mekanizması vardır: homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ve homolojiye yönelik onarım (HDR). NHEJ, yerleştirmelere ve silmelere (indels) yol açan hataya eğilimli, ağırlıklı olarak kullanılan bir onarım mekanizmasıdır, oysa HDR, kardeş kromatidini bir onarım şablonu olarak kullanarak, çok hassastır, ancak hücre döngüsü8'in S veya G2 fazı ile sınırlıdır. Genom mühendisliğinde, HDR, Cas9 ile indüklenen DSB'nin her iki DNA ucuyla aynı olan homoloji kolları tarafından kuşatılmış bir donör şablonu sağlayarak DNA'nın hedeflenen modifikasyonu için kullanılabilir (Şekil 1). HDR için kullanılan bağışçı şablonu türü, düzenleme verimliliğini büyük ölçüde etkileyebilir. İnsan HSPC'lerinde genetik mühendisliği için, adeno ilişkili virüs serotip 6 (AAV6) yakın zamanda tek sarmallı DNA şablonlarının 9,10'unun verilmesi için mükemmel bir araç olarak tanımlanmıştır.
CRISPR / Cas9 genom mühendisliği, zararlı mutasyonları düzeltmek için terapötik olarak kullanılabilir11, ancak kanser gelişimini modellemek için DNA'ya patojenik mutasyonlar sokmak için de kullanılabilir12. Lösemi gibi kan kanseri, sağlıklı HSPC'lerde somatik mutasyonların sıralı olarak edinilmesi yoluyla gelişir13,14. Erken genetik olaylar klonal proliferatif bir avantaja yol açarak, belirsiz potansiyele sahip klonal hematopoez (CHIP) ile sonuçlanır15,16. Mutasyonların daha fazla kazanılması sonunda lösemik transformasyona ve hastalığın gelişmesine yol açacaktır. Somatik mutasyonlar, kendini yenilemeyi, hayatta kalmayı, çoğalmayı ve farklılaşmayı kontrol eden genlerde bulunabilir17.
Genom mühendisliği yoluyla bireysel mutasyonların sağlıklı HSPC'lere tanıtılması, bu aşamalı lösemijenik sürecin hassas bir şekilde modellenmesini sağlar. Akut miyeloid lösemi (AML)18,19 gibi miyeloid neoplazmlarda bulunan sınırlı sayıda tekrarlayan mutasyon, bu hastalığı genom mühendisliği araçları kullanılarak özetlenmeye özellikle uygun hale getirmektedir.
Somatik mutasyonlar sadece bir alel (monoallelik/heterozigot mutasyonlar) veya her iki alel (bialelik/homozigot mutasyonlar) üzerinde ortaya çıkabilir ve genin fonksiyonu üzerinde derin etkilere sahip olabilir, bu da fonksiyon kaybına (LOF) veya fonksiyon kazancına (GOF) neden olabilir. LOF mutasyonları, genin azalmış (eğer bir alel etkilenirse) veya tam (her iki alel de etkilenirse) HOF'una yol açarken, GOF mutasyonları genin aktivasyonunun veya yeni fonksiyonunun artmasına neden olur. GOF mutasyonları tipik olarak heterozigot20'dir.
Daha da önemlisi, zigotluğun (hetero- vs homozigot) bir mutasyonu sadık bir şekilde modelleme girişimi için büyük etkileri vardır; Bu nedenle, heterozigot sıcak nokta GOF mutasyonlarını tasarlamak için bir genin sadece bir alelinin hedeflenen manipülasyonu gereklidir. Hataya eğilimli NHEJ, değişken, öngörülemeyen biyolojik sonuçlara yol açabilecek farklı uzunluklarda21 indellere yol açar. Bununla birlikte, NHEJ, bir DSB'nin tanıtılmasından sonra hücreler tarafından kullanılan baskın onarım programı olduğundan, şu anda HSPC'leri manipüle etmek için kullanılan çoğu CRISPR / Cas9 platformu, genetik sonucun22,23'ünü tam olarak tahmin etmeye izin vermemektedir. Buna karşılık, HDR yoluyla genom mühendisliği için rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) vektör tabanlı DNA donör şablonlarının kullanımı ile birlikte bir CRISPR / Cas9 aracılı çift iplikçik kırılmasının (DSB'ler) tanıtılması, insan HSPC'lerinde mutasyonların alele özgü olarak yerleştirilmesine izin verir11,24. Bir mutant ve vahşi tip (WT) dizisinin eşzamanlı entegrasyonu, bireysel aleller üzerindeki farklı floresan muhabirlerle birleştiğinde, heterozigot bir genotip seçmek için gerçekleştirilebilir (Şekil 2). Bu strateji, tekrarlayan, lösemik, heterozigot GOF hotspot mutasyonlarının HSPC fonksiyonu, hastalığın başlaması ve ilerlemesi üzerindeki etkilerini tam olarak karakterize etmek için güçlü bir araç olarak kullanılabilir.
Bu makalede, primer insan HSPC'lerinde tekrarlayan mutasyona uğramış heterozigot GOF mutasyonlarının verimli mühendisliği için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu strateji, heterozigot GOF mutasyonunun prospektif üretimi için WT ve mutant DNA donör şablonları sağlamak üzere CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift AAV6 transdüksiyonunu birleştirir. Örnek olarak, calreticulin (CALR) genindeki tekrarlayan tip 1 mutasyonlarının (52 bp delesyonu) mühendisliği25 gösterilecektir. CALR'nin ekzon 9'undaki heterozigot GOF mutasyonu, esansiyel trombositemi (ET) ve primer miyelofibroz (PMF)26 gibi miyeloproliferatif hastalıklarda tekrar tekrar bulunur. CALR, yeni sentezlenen proteinlerin katlanma sürecinde öncelikle kalite kontrol fonksiyonuna sahip endoplazmik retikulum yerleşik bir proteindir. Yapısı üç ana alana ayrılabilir: proteinin şaperon fonksiyonunda yer alan bir amino (N) terminal alanı ve prolin bakımından zengin bir P alanı ve kalsiyum depolama ve düzenleme27,28'de yer alan bir C-alanı. CALR mutasyonları +1 çerçeve kaymasına neden olur, bu da yeni bir genişletilmiş C-terminal ucunun transkripsiyonuna ve endoplazmik retikulum (ER) retansiyon sinyalinin (KDEL) kaybına yol açar. Mutant CALR'nin trombopoietin (TPO) reseptörünü bağladığı gösterilmiştir, böylece artmış proliferasyon ile TPO'dan bağımsız sinyalleşmeye yol açmıştır29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig01v2.jpg"> Resim 1: NHEJ ve HDR onarımı. DNA'da çift sarmallı bir kırılmanın ortaya çıkmasını takiben NHEJ ve HDR onarım mekanizmalarının basitleştirilmiş şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig02.jpg"> Şekil 2: Bialelik HDR düzenleme stratejisine şematik genel bakış. Donör şablonlarının hedeflenen alellere entegrasyonunu ve ardından bunların işleyen mRNA'lara çevrilmesini gösteren şematik gösterim. Turuncu noktalı kutular, sol homoloji koluna (LHA) ve sağ homoloji koluna (RHA) karşılık gelen bölgeleri gösterir. HA'ların ideal boyutu her biri 400 bp'dir. Yeşil noktalı kutu, SA dizisine karşılık gelen bölgeyi temsil eder. SA'nın boyutu 150 bp'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 635</td>
			<td>https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D Nucleofector Core Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td>For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4D Nucleofector X Unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVpro Purification Kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>1081058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically modified synthetic sgRNA</td>
			<td>Synthego</td>
			<td></td>
			<td>Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5&#8217;-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3&#8217;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2&#39;-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3&#39; phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases.&#160;&#160;&#160;&#160; *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOPCHOP sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRISPick sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRISPOR sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generation Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria Fusion</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo 10.8.0</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenAgarose L.E.</td>
			<td>Inno-train</td>
			<td>GX04090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly Master Mix</td>
			<td>New England Biolabs Inc. (NEB)</td>
			<td>E2611L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ICE</td>
			<td>Synthego</td>
			<td></td>
			<td>https://ice.synthego.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT codon optimization tool</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDT sgRNA design tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7658-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7533-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midori Green Advance</td>
			<td>Nippon Genetics</td>
			<td>MG04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1010L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monarch DNA Gel Extraction Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>T1020L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2987U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water, 5X100 ml</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Midi</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor&#160; X Kit L</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3024</td>
			<td>The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-MCS2</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>46954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDGM6</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>110660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (P/S)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966</td>
			<td>Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70&#176;C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 &#956;m filter, make 1120 &#956;L aliquots, and store at -80&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Test Tube, with Snap Cap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers&#160;</td>
			<td>Eurofins</td>
			<td>-</td>
			<td>Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Primer 1 Fwd:&#160;&#160;&#160; AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeTime qPCR Primer Assay</td>
			<td>IDT</td>
			<td>-</td>
			<td>PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers)&#160; that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std - qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5&#39;-3&#39;) : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5&#39;-3&#39;): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5&#39;-3&#39;): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5&#39; Dye/3&#39; Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Extract DNA Extraction Solution</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>QE0905T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human Flt3-ligand</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-6</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758-6X500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene</td>
			<td>Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soc outgrowth medium</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B9020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium-butyrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5887-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Regenin 1 (SR1)</td>
			<td>Biogems</td>
			<td>1224999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemSpan SFEM II</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>9655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>B49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIDE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://shinyapps.datacurators.nl/tide/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.4%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE (with phenol red), 500 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>16605-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UM171</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vector Builder codon optimization tool</td>
			<td>Vector Builder</td>
			<td></td>
			<td>https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering oncogenic heterozygous gain-of-function mutations in human hematopoietic stem and progenitor cells

Yaşamları boyunca, hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPC'ler) somatik mutasyonlar kazanırlar. Bu mutasyonlardan bazıları proliferasyon ve farklılaşma gibi HSPC fonksiyonel özelliklerini değiştirir, böylece hematolojik malignitelerin gelişimini teşvik eder. HSPC'lerin etkili ve kesin genetik manipülasyonu, tekrarlayan somatik mutasyonların fonksiyonel sonuçlarını modellemek, karakterize etmek ve daha iyi anlamak için gereklidir. Mutasyonlar bir gen üzerinde zararlı bir etkiye sahip olabilir ve fonksiyon kaybına (LOF) neden olabilir veya tam tersine, fonksiyonu artırabilir veya hatta işlev kazancı (GOF) olarak adlandırılan belirli bir genin yeni özelliklerine yol açabilir. LOF mutasyonlarının aksine, GOF mutasyonları neredeyse sadece heterozigot bir şekilde ortaya çıkar. Mevcut genom düzenleme protokolleri, bireysel alellerin seçici hedeflemesine izin vermemekte ve heterozigot GOF mutasyonlarını modelleme yeteneğini engellemektedir. Burada, verimli DNA donör şablonu transferi için CRISPR / Cas9 aracılı homoloji yönelimli onarım ve rekombinant AAV6 teknolojisini birleştirerek insan HSPC'lerinde heterozigot GOF hotspot mutasyonlarının nasıl tasarlanacağına dair ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Daha da önemlisi, bu strateji, başarılı bir şekilde heterozig olarak düzenlenmiş HSPC'lerin izlenmesine ve saflaştırılmasına izin vermek için çift floresan bir muhabir sisteminden yararlanmaktadır. Bu strateji, GOF mutasyonlarının HSPC fonksiyonunu nasıl etkilediğini ve hematolojik malignitelere doğru ilerlemesini tam olarak araştırmak için kullanılabilir.

Yukarıda tarif edilen protokol uygulanarak, heterozigot tip 1 CALR mutasyonları, kordon kanı kaynaklı HSPC'lerde tekrarlanabilir şekilde tanıtıldı. Bu mutasyon, ekzon 9'da (CALR'nin son ekzonu) 52 bp'lik bir delesyondan oluşur ve bu da +1 kare kaymasıyla sonuçlanır ve yeni bir pozitif yüklü C-terminal alanı 26,33'ün çevrilmesine yol açar. Endojen gen lokusunda CALR mutasyonunu tanıtmak için, ekzon 9'un yukarı akımında bir intronic hedefleme stratejisi benimsendi, çünkü bu, Cas9 ile indüklenen DSB'nin HDR mekanizması ile onarılmadığı durumlarda kodlama dizisindeki istenmeyen değişiklikleri atlatacaktı. Bu özel durumda, uygun homoloji kolları ile kombinasyon halinde yüksek hedef üstü ve düşük hedef dışı sekansların mevcudiyeti nedeniyle intron 7 için bir sgRNA tasarlanmıştır (dizi tekrarlarının eksikliği; Şekil 5A).
Daha sonra iki donör şablonu AAV6 vektörlerinde tasarlandı ve paketlendi. Endojen ekzonlardan entegre cDNA'ya doğru eklemeyi sağlamak için, donör şablonları (i) 3' ekleme bölgesi, dal noktası ve polipirimidin sistemini içeren bir SA dizisini, (ii) WT (CALRWT) veya mutasyona uğramış diziyi (CALRDEL DEL) içeren ekzonların kodon için optimize edilmiş cDNA dizisini içerir. ) bir durdurma kodonu dahil, (iii) bir simian virüsü 40 (SV40) poliA sinyali, (iv) ayrı bir iç promotörün kontrolü altında bir floresan proteini kodlayan bir dizi, dalak odak oluşturan virüs (SFFV) promotörü, ardından (v) bir sığır büyüme hormonu (bGH) poliA sinyali. CALR WT cDNA'yı içeren donör şablonu bir GFP kaseti içerecek şekilde tasarlanırken, CALRDEL cDNA dizisini içeren donör şablonu bir BFP kaseti içerecek şekilde tasarlanmıştır. Tüm yapı sol ve sağ HA ile çevriliydi (Şekil 5A).
RNP kompleksi ile transfeksiyon ve rAAV6 virüsleri ile transdüksiyondan iki gün sonra, hücreler akış sitometrisi ile analiz edildi. Dört ana popülasyon tespit edilebilir: (i) ne GFP'yi ne de BFP'yi ifade eden, HDR tabanlı genom düzenlemesi olmayan hücreleri temsil eden hücreler, (ii) yalnızca GFP için pozitif olan, yalnızca WT yapısını entegre edenleri temsil eden hücreler, (iii) yalnızca mutasyona uğramış yapıyı entegre edenleri temsil eden yalnızca BFP için pozitif hücreler ve (iv) GFP ve BFP çift pozitif hücreler, hem WT hem de mutasyona uğramış dizileri entegre eden hücreleri temsil eder (Şekil 5B). Heterozigot tip 1 CALR mutasyonunu taşıyan HSPC'lerin saf popülasyonlarını elde etmek için, çift pozitif hücreler akış sitometrisi ile sıralandı. Kontrol hücreleri olarak iki WT dizisinin çalındığı HSPC'ler kullanıldı (GFP + mCherry +; Şekil 5B). Kontrol hücreleri olarak kullanmak için geçerli bir alternatif, floresan proteinlerin güvenli bir liman lokusunda bialelik bir entegrasyonuna sahip HSPC'ler olacaktır (yani, AAVS1; gösterilmemiştir). Sıralanmış HSPC'lerde yapılan tripan mavisi dışlaması ile hücre sayımı, hücrelerin% 90'ından fazlasının uygulanabilir olduğunu göstermiştir.
Yapıların hedefte sorunsuz entegrasyonu, içeri-dışarı PCR stratejisi uygulanarak doğrulanmıştır (Şekil 6A). Bu özel durumda, biri çalıntı CALR WT dizisi (Şekil 6A'daki jel elektroforezinin 1. şeridi) ve diğeri de çalınan CALRDEL dizisi (Şekil 6A'daki jel elektroforezinin 2. şeridi) için olmak üzere iki ayrı içeri-çıkış PCR'si gerçekleştirdik. Jel bantlarından ekstrakte edilen DNA üzerinde gerçekleştirilen sanger dizilemesi, CALR DEL / WT HSPC'lerindeWT ve mutasyona uğramış dizilerin doğru yerleştirildiğini doğruladı (Şekil 6B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig05.jpg"> Şekil 5: Heterozigot CALR mutasyonunu taşıyan HSPC'lerin üretimi. (A) Heterozigot CALR mutasyonunun yerleştirilmesi için düzenleme stratejisini gösteren temsili şema. RNP kompleksi, CALR geninin ekzon 7 ve ekzon 8 arasındaki intronunu hedefler. Biri mutasyona uğramış ekzonlar 8-9 ve bir BFP, diğeri WT ekzonları 8-9 ve bir GFP içeren iki AAV, donör onarım şablonları olarak hizmet edecek ve mutasyona uğramış dizinin bir alelde entegrasyonunu ve WT dizisinin kalan alelde entegrasyonunu teşvik edecektir. (B) HSPC'lerin transfeksiyonu ve transdüksiyonunu takiben GFP ve BFP veya GFP ve mCherry 48 h ekspresyonunu gösteren temsili akış sitometri <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig05large.jpg" target="_blank">grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64558/64558fig06.jpg"> Şekil 6: HSPC'lerde başarılı heterozigot CALR mutasyonunun doğrulanması . (A) AAV kontrolleri, CALR WT / WT ve CALR DEL/ WT'den ekstrakte edilen genomik DNA üzerinde gerçekleştirilen içeri-dışarı PCR ürünlerinden jelelektroforezi. 100 bp DNA merdiveni kullanıldı. Kısaltma: NTC = şablon dışı denetim. (B) CALRDEL/WT üzerinde gerçekleştirilen in-out PCR'lerden elde edilen ve WT ve mutasyona uğramış dizilerin başarılı entegrasyonunu doğrulayan Sanger dizileme sonuçları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64558/64558fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells at JoVE.com

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hematopoetik kök hücre biyolojisini ve hematolojik maligniteleri daha iyi incelemek için hematopoetik kök ve progenitör hücrelerdeki (HSPC'ler) somatik mutasyonları sadık bir şekilde modellemek için yeni stratejiler gereklidir. Burada, CRISPR / Cas9 kullanımını ve çift rAAV donör transdüksiyonunu birleştirerek HSPC'lerde heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonlarını modellemek için bir protokol açıklanmaktadır.

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Bu yöntem, primer insan hematopoetik kök ve progenitör hücrelerinde tekrarlayan lösemik fonksiyon kazancı mutasyonlarının hassas bir şekilde modellenmesini ve böylece lösemik transformasyondaki rolünün araştırılmasını sağlar. Bu tekniğin temel avantajı, CRISPR-Cas9 tabanlı mutasyon mühendisliğinin bir floresan muhabirinin tanıtılmasıyla birleştirilmesidir. Bu, saf heterozig mutasyona uğramış hücre popülasyonlarının tanımlanmasına, zenginleştirilmesine ve izlenmesine benzersiz bir şekilde izin verir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırma görevlisi olan Tommaso Sconocchia olacak. Başlamak için, artı oluştur seçeneğini seçerek çevrimiçi Benchling tasarım aracını kullanarak tek kılavuzlu RNA'yı tasarlayın. Ardından, DNA dizisini tıklayın"ardından DNA dizilerini içe aktar" ve veritabanlarından içe aktar" seçeneğine tıklayın.Sonra istediğiniz geni girin ve insan "türü" nü seçin. Ara" seçeneğine tıklayın ve doğru transkript içe aktarma işlemini seçin. Çift iplikçik kopmasının tanıtılacağı ilgi alanını seçin.Ardından ekranın sağ tarafındaki "CRISPR" seçeneğini ve ardından tasarım ve analiz kılavuzlarını seçin. Ardından, SP-Cas9 ile düzenleme için kılavuz uzunluğunu 20 baz çiftine ve PAM dizisine tutarken "tek kılavuz" u seçin. Yüksek hedef içi puana ve yüksek hedef dışı puana sahip bir kılavuz seçin ve tek kılavuz RNA'yı ticari bir satıcıdan kimyasal olarak modifiye edilmiş sentetik tek kılavuz RNA olarak sipariş edin.HDR şablonunu tasarlamak için, genomik diziyi ve kodlama dizisini moleküler klonlama yazılımına aktarın. Genomik dizi dosyasından, ideal olarak, çift iplikçik kırılmalarının beş ana ucundaki 400 baz çiftini seçerek sol homoloji kolunu tasarlayın ve bu diziyi yeni bir dosyaya yapıştırın. Genomik dizi dosyasından, hedeflenen intron'un son 150 baz çiftini seçerek ve sol homoloji kolundan sonra yapıştırarak ekleme alıcı dizisini tasarlayın.Kodlama sırası dosyasından, ilgilendiğiniz cDNA'yı seçin. Codon, cDNA'yı optimize eder ve ekleme alıcı dizisinden sonra yerleştirir. İlgilenilen cDNA'dan sonra, floresan protein için bir promotör dizisini takiben üç asal poliadenilasyon sinyali ekleyin.Ardından, floresan proteini için sırayı ve bir saniye, ancak farklı bir poliadenilasyon sinyali ekleyin. Genomik dizi dosyasından, çift iplikçik kırılmalarının üç ana ucunda ideal olarak 400 baz çifti seçerek doğru homoloji kolunu tasarlayın ve ikinci poliadenilasyondan sonra diziyi ekleyin. Ardından, tüm kalıbın bir kopyasını oluşturun ve istenen mutasyonun dizisini içerecek şekilde ilgili cDNA'yı değiştirin.Floresan proteinini farklı bir floresan proteini ile değiştirin. HDR şablonlarını oluşturun ve AAV ifade vektörüne kopyalayın. Rekombinant AAV6 preparasyonu için, her biri% 10 FBS,% 1 penisilin streptomisin ve 25 milimolar HEPES ile desteklenmiş 20 mililitre DMEM'de 11 milyon HECK293T içeren 10 adet 150 milimetrelik tabak hazırlayın.Ardından, bulaşıkları inkübatöre 24 saat boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit olarak yerleştirin. Eski ortamı dikkatlice attıktan sonra,% 10 FBS, 25 milimolar HEPES ve bir milimolar sodyum bütirat ile desteklenmiş 20 mililitre antibiyotiksiz DMEM ile değiştirin. Ardından, bir ve iki adet 15 mililitrelik tüp etiketli tüp hazırlayın.Bir tüp için, beş mililitre azaltılmış serum ortamı, 60 mikrogram rekombinant AAV6 mutasyona uğramış HDR plazmid ve 220 mikrogram PDGM6 yardımcı plazmid ekleyin. İki tüp için, mililitre polietilen amin çözeltisi başına beş mililitre azaltılmış serum ortamı ve 1120 mikrolitre bir miligram ekleyin. İkinci tüpün içeriğini bir tüpe ekledikten sonra, 30 saniye boyunca vorteks yapın ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.Her yemeğe damla damla 1.1 mililitre çözelti dikkatlice ekleyin ve yavaşça dönerek dağıtın. Bulaşıkları inkübatöre 48 saat boyunca 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit olarak yerleştirin. Daha sonra her yemeğe 250 mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.Hücreleri tabakta yıkayarak toplayın ve 500 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 2000 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Peleti vorteks ile gevşetin ve bir AAV saflaştırma kiti kullanarak virüsü çıkarın.Saflaştırılmış virüsü alıntıladıktan sonra, eksi 80 santigrat derecede saklayın. CD34 pozitif hematopoetik kök ve progenitör hücreleri çözdükten sonra, hücreleri% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş 10 mililitre önceden ısıtılmış RPMI'ye aktarın. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de santrifüj.Hematopoetik kök ve progenitör hücre tutma ortamındaki hücreleri mililitre başına 250.000 hücre konsantrasyonuna kadar askıya alın ve 72 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ardından, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın. Tripan mavisi dışlaması ile hücre canlılığını sayın ve kontrol edin.Ribokukleoprotein kompleksini hazırlamak için, 1.5 mililitrelik bir tüpe 15 mikrogram Cas9 ve sekiz mikrogram tek kılavuz RNA ekleyin ve bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Ribonükleoprotein kompleksi inkübe edilirken, hücreleri beş dakika boyunca 350 G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücreleri 100 mikrolitre nükleofeksiyon çözeltisinde askıya aldıktan sonra, hücreleri ribonükleoprotein kompleksi ile karıştırın ve küvete aktarın.Artık hava kabarcıklarını çıkarmak için küvete hafifçe dokunduktan sonra, küveti transfeksiyon sisteminin tutucusuna yerleştirin ve hücreleri elektroporat yapın. Elektroporasyondan hemen sonra, penisilin streptomisin olmadan 400 mikrolitre önceden ısıtılmış hematopoetik kök ve progenitörler hücre tutma ortamı ekleyin ve ince bir transfer pipeti ile hücreleri, penisilin streptomisin olmadan önceden ısıtılmış hematopoetik kök ve progenitör hücre tutma ortamı içeren bir kültür plakasına aktarın. Ardından plakayı inkübatöre aktarın.Dondurulmuş rekombinant AAV'leri içeren şişeleri buz üzerinde çözün ve her bir rekombinant AAV6'nın optimum miktarını hücre süspansiyonuna pipetleyerek hücreleri dönüştürün. Hücre süspansiyonunu pipetle hafifçe karıştırdıktan sonra, dönüştürülmüş hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte altı ila sekiz saat boyunca inkübe edin. Altı ila sekiz saat sonra, hücreleri bir tüpte toplayın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de santrifüj yapın.Süpernatantı atın ve penisilin streptomisin ile desteklenmiş taze önceden ısıtılmış hematopoetik kök ve progenitör hücre tutma ortamı ile değiştirin ve hücreleri bir hücre kültürü plakasına aktarın. Hücreleri 48 saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Heterozigot fonksiyon kazancı mutasyonunu taşıyan mühendislik hücrelerini akış halinde sıralamak için, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve daha önce gösterildiği gibi beş dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de santrifüj yapın.Süpernatantı çıkarın ve% 0.1 PSA içeren bir mililitre DPBS'deki hücreleri askıya alın ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de tekrar santrifüj yapın. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri daha önce gösterildiği gibi hücre numarasına bağlı olarak uygun bir DPBS hacminde artı %0,1 BSA'da askıya alın. Hücreleri bir kapakla donatılmış steril bir faks tüpüne aktarın ve canlı / ölü hücre dışlaması için hücre süspansiyonuna yedi AAD veya başka bir canlılık boyası ekleyin.Floresan raporlayıcı proteinler için çift pozitif olan canlı hücreleri, 200 mikrolitre hematopoetik kök ve progenitör hücre tutma ortamı içeren bir toplama tüpüne ayırın. Sıralanmış hücreleri daha önce gösterildiği gibi beş dakika boyunca oda sıcaklığında 350 G'de santrifüj ettikten sonra, kültürde daha fazla genişleme için mililitre başına 250.000 hücre konsantrasyonuna veya hücreleri doğrudan fonksiyonel tahliller için kullanın. Ribonükleoprotein kompleksi ile transveksiyon ve rekombinant AAV6 virüsleri ile transdüksiyondan iki gün sonra, hücreler akış sitometrisi ile analiz edildi.Ne GFP'yi ne de BFP hücrelerini sadece GFP için pozitif olarak ifade eden ve sadece vahşi tip yapısı entegre edilmiş BFP hücreleri ifade etmeyen HDR tabanlı genom düzenlemesi olmayan hücreler, sadece mutasyona uğramış yapı entegre edilmiş BFP için pozitif hücreler ve hem vahşi tip hem de mutasyona uğramış diziler entegre edilmiş GFP ve BFP çift pozitif hücreler dahil olmak üzere dört ana popülasyon tespit edildi. PCR giriş/çıkış heterozigot hesapsal mutasyonlarının başarılı bir şekilde knock-in olduğunu doğrulamak için, sadece AAV ile inkübe edilen hücrelerden ve ribonükleoprotein ve AAV ile inkübe edilen hücrelerden, knocked-in calreticulin wild tipi ve calreticulin delesyon dizisi ile ekstrakte edilen genomik DNA üzerinde gerçekleştirildi. Hücreler, DNA ekstraksiyonundan önce her iki floresan muhabirinin eşzamanlı ekspresyonuna göre sıralandı.Jel elektroforezinden sonra, jelden bireysel bantlar eksize edildi ve sonraki Sanger dizilimi için DNA ekstrakte edildi. Dizileme sonuçları, heterozigot hesap-mutasyona uğramış hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde vahşi tip ve mutasyona uğramış sekansların başarılı bir şekilde kesintisiz entegrasyonunu doğruladı. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, en iyi performans gösteren tek kılavuz RNA'yı dikkatlice seçmektir, çünkü bu, genel HDR verimliliğini ve dolayısıyla heterozigot mutasyonların başarılı bir şekilde vurulma sıklığını belirleyecektir.Bu prosedürü takiben, genetiği değiştirilmiş hücreler, koloni oluşturan birim testleri, farklılaşma testleri ve bağışıklık eksikliği olan farelere transplantasyon gibi fonksiyonel in-vitro ve in-vivo deneyler için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Kombine Koşullu Knockdown ve Uyarlanmış Küre Oluşumu Çalışma Hasta Kaynaklı Mide Kanseri Kök Hücrelerin bir Stemness-Associated Gene Çalışma

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Zebrabalığında Fonksiyonel Floresan Silika Nano partikülleri ile Ksenogreftli İnsan Kanser Hücrelerinin Vivo Hedeflemesinde

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...