Name: culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

نحن ممتنون لديل ميرتس من جامعة شيكاغو لإعداد الرسوم البيانية، وللدكتور محمد شريف أيدين لدعمه الفني في معهد أبحاث العلوم والتقنيات الصحية بجامعة اسطنبول ميديبول، وللدكتورة رنا كاظمي من جامعة مالتيبي لتحرير المخطوطة.

1. زراعة المواد العضوية والكروية
<ol><li>ضع الهيدروجيل على الثلج طوال الليل (في الثلاجة أو غرفة باردة) ليذوب.</li>
	<li>ضع الجهاز متعدد الأغراض المتاح تجاريا (MD ؛ انظر جدول المواد) في الحاضنة قبل يوم واحد من التجربة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) للتدفئة.</li>
	<li>ضع أطراف ماصة معقمة عريض?...

MD ، المكمل للتركيبات والبروتوكولات الموصوفة هنا ، يسهل النمو السريع والعفوي 3D للعضويات والكروية في بيئة أكثر تحكما ويواصل التجربة في نفس الظروف. تبقى العينة في نفس البيئة خلال العملية بأكملها ، ويبقى ما يقرب من 100٪ من البنى المتنامية 3D سليمة في الحاوية. هذا يحسن التجانس أثناء التجارب المت?...

يكمن مستقبل أبحاث الخلايا والعلاج في مزارع الخلايا ثلاثية الأبعاد1،2،3. تعمل النماذج العضوية والكروية على سد الفجوة بين التجارب في المختبر والنماذج الحيوانية من خلال إنشاء نماذج أفضل تحاكي نمو جسم الإنسان وعلم وظائف الأعضاء والأمراض4،5،6،7،8،9. ومع ذلك ، فإن قابلية استنساخ وتكرار هذه النماذج لا تزال صعبة. علاوة على ذلك ، فإن التعامل مع هذه الهياكل وحصادها ونقلها وطردها بالطرد المركزي باستخدام التقنيات الحالية يؤدي إلى فقدان أو تلف المواد العضوية والكروية في العديد من الظروف ، مما يؤثر بشكل كبير على النتائج.

على الرغم من العديد من البروتوكولات الخاصة بالتلوين النسيجي ، والتلوين الكيميائي المناعي ، ووضع العلامات المناعية ، والحفظ بالتبريد ، لا يوجد نهج عالمي يتعلق بتوحيد الظروف التجريبية ، والتعامل مع هذه الهياكل الحساسة ومعالجتها دون فقدانها أو إتلافها. البروتوكولات الحالية هي أيضا طويلة بشكل لا يصدق ، بالتناوب من بضعة أيام إلى عدة أسابيع ، وتشمل إجراءات معقدة مع الكواشف المختلفة10،11،12،13،14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الحصاد ، والماصات ، والطرد المركزي ، ونقل الهياكل المتنامية 3D بين أوعية زراعة الخلايا و cryovials تسبب تغييرات في وضع الهياكل والقوى الميكانيكية ، وتؤثر في النهاية على تمايز ونضج المواد العضوية والكروية. تم الإبلاغ عن أن طوبولوجيا الأنسجة ، وتحديد مواقع الخلايا ، والقوى الميكانيكية تؤثر بشكل كبير على تمايز الخلايا ونضجها6،15،16،17.

لذلك ، من المستحسن تحسين التقنيات التقليدية الحالية لتوليد المواد العضوية والكروية بجودة مستقرة. إن الطريقة / الجهاز الذي سيتخطى الطرد المركزي والخطوات الأخرى الموضحة أعلاه ويوفر المواد في بيئة آمنة واحدة من بداية العمليات المتعددة إلى نهايتها سيكون مفيدا للوصول إلى البيانات الأكثر اتساقا وموثوقية. بالإضافة إلى ذلك ، سيؤدي ذلك إلى تقليل قيود الوقت والعمالة والتكلفة.
يوفر الجهاز متعدد الأغراض (MD) الموصوف هنا بيئة آمنة واحدة لعمليات متعددة من المواد العضوية والكروية (الشكل التكميلي 1). يلغي هذا الجهاز والبروتوكولات المكملة خطوات الحصاد والماصات والنقل والطرد المركزي. تبقى المواد العضوية والكروية في بيئتها المختبرية أثناء العمليات المتسلسلة. تتكون هذه البيئة بشكل أساسي من مكونات مصفوفة خارج الخلية طبيعية أو اصطناعية ، مثل الهلاميات المائية المتاحة تجاريا. بمعنى آخر ، تسمح الطرق الموضحة هنا بمعالجة عينة كاملة من المواد العضوية / الكروية وفحصها وتجميدها أثناء وجودها في قطرة هيدروجيل.
الجهاز المتوافق حيويا مقاوم لدرجات الحرارة بين 60 درجة مئوية و -160 درجة مئوية ، مما يجعل من الممكن استعادة المواد العضوية / المنشطات في خزان النيتروجين السائل عند -160 درجة مئوية أو تحضير كتل الراتنج للمجهر الإلكتروني عند 60 درجة مئوية. تم تصميم مكانة الجهاز لتحديد مساحة محدودة للهياكل المتنامية ثلاثية الأبعاد وتحفيز تكوين الأجسام الكروية أو العضوية بناء على الدراسات السابقة18،19،20،21،22،23. هذا الجزء من الجهاز شفاف ويحتوي على بلاستيك محدد يوفر جودة بصرية عالية (معامل الانكسار: 1.43 ؛ قيمة آبي: 58 ؛ السماكة: 7.8 مل [0.0078 بوصة أو 198 ميكرومتر]). يتسبب كل من الكوة والجزء "الجانبي" المحيط في التألق الذاتي. تبلغ مساحة الكوة الشفافة في الوسط 80 مم 2 ، بينما يبلغ الجزء الجانبي 600 مم2. عمق الحاوية 15 مم ، وسمكها 1.5 مم. هذه الميزات ، بالإضافة إلى حجم وتصميم الجهاز ، تجعل من الممكن إجراء ملاحظات تحت أنواع مختلفة من المجهر عالي التقنية وإعداد العينات للفحوصات المجهرية الإلكترونية (الشكل 2). يوفر نظام إغلاق الجهاز وضعين ، أحدهما مغلق في الثلاجة والآخر يسمح بتدفق الغاز في الحاضنة. تظهر فحوصات انتشار CCK8 والسمية الخلوية تأثيرات مماثلة على الخلايا مقارنة بأطباق زراعة الخلايا التقليدية (الشكل التكميلي 2). يوضح اختبار استبعاد التريبان الأزرق قابلية عالية للخلايا (94٪) أثناء زراعة الخلايا في MD (الشكل 3).
تشمل العمليات التي يمكن إجراؤها لعينة واحدة في الجهاز الواحد (1) الزراعة ، (2) التلوين النسيجي ، (3) التلطيخ المناعي ، بما في ذلك وضع العلامات المناعية الكيميائية والتألقية المناعية ، (4) التجميد ، (5) الذوبان ، (6) الفحص تحت المجاهر الضوئية ، مثل برايتفيلد ، داركفيلد ، مضان ، مجاهر ، بؤرية ، وفائقة الدقة ، (7) طلاء وفحص مباشرة تحت المجهر الإلكتروني الماسح ، أو (8) التحضير للمجهر الإلكتروني النافذ ( الشكل 2).
توجد منهجيات مختلفة للتلطيخ النسيجي ، أو وضع العلامات المناعية الكيميائية ، أو وضع العلامات الفلورية على المواد العضوية والكروية 10،11،12،13،14،24،25. حصادها من هيدروجيل هو الخطوة الأولى والرئيسية للتكنولوجيا الحالية. بعد هذه الخطوة ، تسمح بعض الطرق بوضع العلامات المناعية بالكامل. يتم تضمين المواد العضوية المحصودة في البارافين ، مجزأة ، وموسومة للتلطيخ والمناعة في الآخرين. ومع ذلك ، قد لا تقدم الأقسام العينة بأكملها وتوفر بيانات محدودة فقط تتعلق ببنية 3D للهيكل. علاوة على ذلك ، فإن الأضرار التي لحقت بهذه الهياكل 3D وفقدان المستضدات هي الآثار الجانبية المعروفة لهذه التقنيات.
تسمح البروتوكولات الجديدة التكميلية للفحوصات المجهرية في هذه المقالة بتحليل عينات كاملة لا تزال في هيدروجيل. تتضمن البروتوكولات الموصوفة هنا تركيبتين مطورتين حديثا: محلول للكيمياء الهيستولوجية المناعية (S-IHC) ومحلول لوضع العلامات المناعية (S-IF). تسمح طرق هذه الحلول للباحثين بالحصول على بيانات أكثر دقة ، حيث لا توجد آثار ضارة لسير العمل التقليدي ، مثل الطرد المركزي ، وسحب العينات ، ونقل الهياكل الحساسة. يلغي البروتوكول الموصوف هنا أيضا الحاجة إلى خطوات الحصاد والحجب والتطهير واسترجاع المستضد ، ويقصر الإجراء بأكمله إلى 6-8 ساعات. علاوة على ذلك ، تسمح المنهجية بإضافة واحد إلى ثلاثة أجسام مضادة في وقت واحد إلى نفس S-IF. لذلك ، من الممكن الحصول على النتائج في نفس اليوم حتى بعد تجارب وضع العلامات المتعددة ، وهي ميزة أخرى للبروتوكول الموصوف هنا ؛ عادة ما تستغرق بروتوكولات وضع العلامات المناعية التقليدية الكاملة ما بين 3 أيام وعدة أسابيع10،11،12،13،14.
كما تم حذف تضمين البارافين ، وهو خطوة ضارة أخرى تقلل من المستضد. يبقى هيكل 3D في بيئته في المختبر من بداية إلى نهاية الفحص المجهري. نظرا لأن بنية 3D لا تزال في ظروف نموها ، فإن تعبير البروتين وبيانات التوطين تحاكي ظروف الجسم الحي بشكل أفضل. من المتوقع الحصول على نتائج أكثر دقة ، لأن المنهجية تلغي الخطوات التي تؤثر على تعبير مستضد العينة. يوضح الجدول 1 والجدول 2 كيف أن هذه البروتوكولات الجديدة تلغي الخطوات ، وتوفر الوقت والعمل في المختبر ، وتقلل التكاليف ومنتجات النفايات مقارنة بسير العمل التقليدي.
بالإضافة إلى الخطوات الحاسمة الموضحة أعلاه ، هناك مشكلة أخرى تتمثل في توفير وسيط حفظ بالتبريد وطريقة للحفاظ على بنية 3D للعينة بمعدلات صلاحية خلية أعلى26،27،28،29،30،31. يعد الحفظ بالتبريد ضروريا لإنشاء نظام نموذجي مستقر وتمكين البنوك الحيوية للعضويات والكروية32,33. البنوك الحيوية سيسمح هيكل 3D الأصلي بأكمله بتلخيص أكثر إخلاصا للحالة الطبيعية للصحة أو المرض. الاعتبارات الرئيسية هي راحة وموثوقية الحفظ بالتبريد وذوبان المواد العضوية / الكروية. الانتعاش العضوي بعد الذوبان منخفض جدا في معظم التقنيات الحالية ، وغالبا ما يكون أقل من 50٪. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة نتائج واعدة مع تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة26،27،28،29. أظهر Lee et al. أن 78٪ من الخلايا الكروية نجت بعد الحفظ بالتبريد عندما استخدموا محلول جامعة ويسكونسن الذي يحتوي على 15٪ DMSO28. زادت نسبة بقاء الخلية إلى 83٪ في دراسة Arai et al.29. ومع ذلك ، تتأثر النتائج بعد الحفظ بالتبريد بشكل كبير لأن هياكل 3D لا يمكنها الحفاظ على نفس الخصائص والجودة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الكواشف الخالية من المصل مطلوبة لممارسة التصنيع الجيدة في الإعدادات الصيدلانية والتشخيصية. تستخدم تدفقات العمل التقليدية وسيطا يحتوي على مصل بقري جنيني (FBS) وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لطريقة التجميد البطيء ، وكلاهما مرتبط بالإعاقات. FBS هو منتج مشتق من الحيوانات ويمكن أن يكون له اختلافات في الدفعات. DMSO هو مادة واقية من التبريد ناجحة للغاية ، ولكن التعرض طويل الأمد ، خاصة أثناء الذوبان ، قد يسبب تأثيرات سامة للخلايا30,31.
توضح هذه المقالة أيضا منهجية التجميد / الذوبان للعضويات أو الكرويات بأكملها أثناء وجودها في هيدروجيل. تم استخدام صيغتين لتجميد المواد العضوية والكروية في الدراسة: (1) 10٪ DMSO يحتوي على محلول تجميد تقليدي (FS) و (2) وسط حفظ بالتبريد خال من المصل و DMSO. يحتوي وسيط الحفظ بالتبريد هذا على مكونات مصفوفة خارج الخلية ، والتي تختلف عن الصيغ الحالية. تتكون المصفوفة خارج الخلية من فئتين رئيسيتين من الجزيئات الكبيرة ، البروتيوغليكان ، والبروتينات الليفية ، والتي تعتبر ضرورية للسقالات الفيزيائية للمكونات الخلوية ، ولكنها تبدأ أيضا العمليات المطلوبة لتشكل الأنسجة والتمايز والتوازن34،35،36،37،38،39،40 . توفر الكولاجين قوة الشد ، وتنظم التصاق الخلايا ، وتدعم الانجذاب الكيميائي والهجرة ، وتطور الأنسجة المباشر37. بالإضافة إلى ذلك ، توفر ألياف الإيلاستين ارتدادا للأنسجة التي تخضع لتمدد متكرر38. يوجه بروتين ليفي ثالث ، الفبرونيكتين ، تنظيم المصفوفة الخلالية خارج الخلية وله دور حاسم في التوسط في ارتباط الخلية ويعمل كمنظم ميكانيكي خارج الخلية39. أظهر Du et al. التأثير الواقي من البرودة لهيدروليزات كولاجين الدجاج على نظام نموذج الأكتوميوسين الطبيعي41. تشير نتائجهم إلى أن تحلل الكولاجين يمكن أن يمنع نمو بلورات الجليد ، ويقلل من تمسخ تجميد البروتين والأكسدة بشكل مشابه للمواد الواقية من التبريد التجارية ، ويوفر بنية هلام أفضل بعد دورات التجميد والذوبان. لذلك ، فإن إضافة مكونات المصفوفة خارج الخلية إلى وسائط الحفظ بالتبريد توفر بيئة أكثر أمانا وحماية للعينة وتدعم الهياكل الحية للشفاء بعد التجميد والذوبان.
بالإضافة إلى ذلك ، تصف الدراسة الحالية بروتوكولا مباشرا لتسمية الأغشية السيتوبلازمية ونوى الكائنات العضوية الحية والكروية أثناء وجودها في الهيدروجيل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

أصبحت الكائنات العضوية والكروية ، وهي هياكل متنامية ثلاثية الأبعاد في مختبرات زراعة الخلايا ، معترف بها بشكل متزايد كنماذج متفوقة مقارنة بنماذج الثقافة ثنائية الأبعاد ، لأنها تحاكي جسم الإنسان بشكل أفضل ولها مزايا على الدراسات على الحيوانات. ومع ذلك ، تواجه هذه الدراسات عادة مشاكل في التكاثر والاتساق. خلال العمليات التجريبية الطويلة - مع نقل المواد العضوية والكروية بين أوعية زراعة الخلايا المختلفة ، والماصات ، وأجهزة الطرد المركزي - غالبا ما تتلف هذه الهياكل المتنامية 3D الحساسة والهشة أو تضيع. في النهاية ، تتأثر النتائج بشكل كبير ، لأن هياكل 3D لا يمكنها الحفاظ على نفس الخصائص والجودة. تقلل الطرق الموضحة هنا من هذه الخطوات المجهدة وتضمن بيئة آمنة ومتسقة للعضويات والكروية طوال تسلسل المعالجة بينما لا تزال في هيدروجيل في جهاز متعدد الأغراض. يمكن للباحثين أن ينمووا ، ويتجمدوا ، ويذوبوا ، ويعالجوا ، ويلطخوا ، ويلصقوا ، ثم يفحصون بنية الكائنات العضوية أو الكروية تحت أدوات مختلفة عالية التقنية ، من المجاهر البؤرية إلى المجاهر الإلكترونية ، باستخدام جهاز واحد متعدد الأغراض. تعمل هذه التقنية على تحسين قابلية استنساخ الدراسات وموثوقيتها وصلاحيتها ، مع الحفاظ على بيئة مستقرة ووقائية للهياكل المتنامية 3D أثناء المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التخلص من الخطوات المجهدة يقلل من أخطاء المعالجة ، ويقلل من الوقت المستغرق ، ويقلل من خطر التلوث.

تمثل هذه المقالة جهازا متعدد الأغراض (MD) ومنهجيات تكميلية للزراعة والتجميد والذوبان والتلوين النسيجي والتلوين الكيميائي المناعي ووضع العلامات المناعية والطلاء ومعالجة المواد العضوية أو الكروية بأكملها بينما لا تزال في هيدروجيل في بيئة واحدة مصممة بشكل فريد. تم تصميم الدراسة الحالية لإ?...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

تصف هذه الدراسة منهجيات زراعة وتجميد وإذابة ومعالجة وتلطيخ ووضع العلامات وفحص كرويات وعضويات كاملة تحت مجاهر مختلفة ، بينما تظل سليمة في هيدروجيل داخل جهاز متعدد الأغراض.

زراعة وتجميد ومعالجة وتصوير عضويات وكرويات كاملة أثناء وجودها في هيدروجيل

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

المواد العضوية والكروية ، كونها هشة للغاية ، تتضرر بشكل خطير أثناء التعامل معها. يضمن بروتوكولنا بقاء هذه الهياكل المتنامية 3D سليمة أثناء العمليات المختلفة ، وبالتالي زيادة الدقة والتكرار والموثوقية والتكرار. يمكن للباحث زراعة وتجميد وإذابة ومعالجة وتلطيخ وتسمية وفحص عضويات وكرويات كاملة تحت مجاهر مختلفة بينما تظل سليمة في هيدروجيل داخل جهاز واحد متعدد الأغراض.يتيح إنشاء نموذج مرض وتتبع الخطوات المتسلسلة في جهاز واحد متعدد الأغراض. توفر هذه التقنية مزيدا من الدقة عند فحص المؤشرات الحيوية لتشخيص الأمراض وتشخيصها. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي نظام نمو 3D ، بما في ذلك المواد العضوية أو الكروية أو الخلايا الفردية أو الكائنات الحية.لبدء الثقافة العضوية أو الكروية ، ضع الهيدروجيل المذاب بشكل صحيح على الجليد داخل غطاء تدفق رقائقي لمدة 15 دقيقة. أيضا ، احتفظ بالأنبوب الذي يحتوي على حبيبات من سرطان الخلايا الكبدية ، أو خلايا HEPG2 ، على الثلج. بعد ذلك ، قم بلوحة 30 إلى 35 ميكرولتر من هيدروجيل 100٪ داخل مكانة الجهاز متعدد الأغراض الذي تم تسخينه مسبقا لإنشاء قطرة هلام ، ضع 10،000 خلية HEPG2 في وسط الجزء العلوي من قطرة هيدروجيل ، واحتضان الإعداد عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.بعد الحضانة ، قم بتغطية قطرة الهيدروجيل ب 200 ميكرولتر من وسط النسر المعدل من Dulbecco ، أو DMEM ، الذي يحتوي على 10٪ من مصل الأبقار الجنيني ، أو FBS. ضع الغطاء على الجهاز بشكل صحيح ، مما يسمح بتدفق الغاز ، قبل وضعه في الحاضنة. كل يوم ، قم بتغذية الخلايا ب 200 ميكرولتر من DMEM تحتوي على 10٪ FBS.تحقق من نمو الأجسام الكروية تحت المجهر المقلوب. قبل البدء في وضع العلامات المناعية للعضويات ، قم بتسخين الوسائط والحلول المطلوبة إلى 37 درجة مئوية. قم بشفط وسط زراعة الخلايا المحيط بقطرة الهيدروجيل قبل إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية وقم بإصلاحه بوضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة.بعد ذلك ، قم بشفط المثبت وغسل المحلول لوضع العلامات المناعية ، أو SIF ، قبل تسخينه إلى 37 درجة مئوية ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. أضف الماء المقطر إلى المنطقة المحيطة بالمكان المناسب لتوفير الرطوبة قبل متابعة الخطوات التالية. استنشاق SIF المحيط بقطرة الهيدروجيل وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية الدافئة مسبقا في SIF إلى الهيدروجيل قبل حضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة.بعد ذلك ، قم بشفط محلول الجسم المضاد الأساسي واغسله باستخدام SIF المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما. بعد الغسيل ، استنشاق SIF المتبقي وإضافة 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي الذي تم تسخينه مسبقا في SIF إلى الهيدروجيل. احتضان هيدروجيل عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 إلى 60 دقيقة.بعد الحضانة ، استنشق محلول الأجسام المضادة الثانوي واغسل قطرة هيدروجيل مع PBS عند 37 درجة مئوية ثلاث مرات في الظلام لمدة 10 دقائق لكل منها. بعد ذلك ، استنشاق PBS المتبقي واحتضان الهيدروجيل مع 100 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي النووي التي تحتوي على وسط متصاعد أو الجلسرين عند 37 درجة مئوية في الظلام. املأ مكانه بالجلسرين لتجنب التجفيف قبل إغلاق الجهاز متعدد الأغراض الذي يحتوي على هيدروجيل بإحكام.لفحص المواد العضوية بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر ، اضبط معلمات المجهر باتباع التعليمات الواردة في المخطوطة. لتجميد المواد العضوية ، قم بشفط وسائط زراعة الخلايا ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول التجميد قبل التسخين ، واحتضان العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أغلق غطاء الجهاز بإحكام قبل وضعه داخل صندوق رغوة.ضع صندوق الرغوة هذا في صندوق رغوة آخر وأغلق صندوقي الرغوة بإحكام. احتفظ بالصندوق عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعتين ، ثم اتركه طوال الليل في مجمد درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. لتخزين المواد العضوية لمدة تزيد عن ستة أشهر ، قم بإزالة الجهاز متعدد الأغراض الذي يحتوي على المواد العضوية من الصناديق وانقله إلى خزان النيتروجين السائل.لإذابة المواد العضوية ، أخرج الجهاز متعدد الأغراض الذي يحتوي على العينة إما من الفريزر أو خزان النيتروجين السائل وضعه مباشرة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. بمجرد إذابته ، قم بشفط خليط المحلول المتوسط والتجميد برفق قبل إضافة وسط جديد والمضي قدما في تصوير الهيدروجيل العضوي بالكامل. في التصوير الحي ، أصبحت الكائنات العضوية المتنامية داخل الهيدروجيل مرئية بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من إدخال حبيبات الخلية ، خاصة في محيط قبة الهيدروجيل.تظهر هنا السلسلة الزمنية للصور على مستويات مختلفة من هيدروجيل يحتوي على كرويات تحت مجهر تباين الطور المقلوب. أظهرت صور الفحص المجهري متحد البؤر للعضويات الحية الكاملة بعد تلطيخ غشاء الخلية والنواة كثافة وسم مماثلة في المحيط والمركز. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء وضع العلامات المناعية للستيرويدات الكاملة بنجاح باستخدام جسم مضاد واحد ، واثنين من الأجسام المضادة ، بالإضافة إلى ثلاثة أجسام مضادة ، مما يلغي أي حاجة لخطوات علاج إضافية.يوضح التحليل التمثيلي اثنين من عضويات مجرى الهواء التي تحمل علامة المناعي في الجهاز. أشارت صور SEM للكرويات بأكملها في الجهاز متعدد الأغراض و 10 صور من المنشطات المجزأة إلى بنية 3D محفوظة جيدا من الأجسام الكروية والعضيات السيتوبلازمية وغيرها من الميزات الخلوية فائقة البنية ، مما يدل على فعالية البروتوكول الموصوف. كان عدم الانتظام عند حدود قبة الهيدروجيل واضحا بعد تجميد العينات.ومع ذلك ، ظل حجم واستدارة الأجسام الكروية متشابهة. لوحظت هجرة الخلايا على سطح المزرعة بعد إذابة العينات المجمدة. هذه التقنية بسيطة جدا.ومع ذلك ، يجب أن يكون الباحث لطيفا جدا أثناء استنشاق أو إضافة أي سوائل تحيط بقطرة الهيدروجيل لمنع إتلاف العينة. يمكن للباحث النظر إلى نفس العينة في جهاز واحد باستخدام مجهر عالي التقنية وإجراء دراسة مترابطة.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

تجميد الخلايا البشرية ES

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

فلاش التجميد وCryosectioning E12.5 مخ الفأر

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

الفرز الأنسجة وتجميد لنماذج من الأمراض العضلات الهيكلية

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

عالية الإنتاجية تحليل صورة الأجسام الشبه الكروية ورم: A برمجيات صديقة للمستخدم التطبيق لقياس حجم الأجسام الشبه الكروية تلقائيا وبدقة

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

جنبا إلى جنب تجميد الضغط العالي والسريع تجميد استبدال الأنسجة النباتية للنقل المجهر الإلكتروني

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

الكميات التعبير البروتين والتعاون التعريب عن طريق تعدد المناعية النسيجية تلطيخ والمتعددة الأطياف التصوير

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

وحيد الخلية القرار التصوير ثلاثي الأبعاد من organoids سليمة

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

منصة عالية الإنتاجية للثقافة والتصوير 3D من المواد العضوية

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...