Name: culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

We zijn Dale Mertes van de Universiteit van Chicago dankbaar voor het opstellen van diagrammen, dr. Mehmet Serif Aydin voor zijn technische ondersteuning aan het Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies, en dr. Rana Kazemi van de Maltepe University voor het redigeren van het manuscript.

1. Kweken van organoïden en sferoïden
<ol><li>Leg de hydrogel een nacht op ijs (in een koelkast of een koude ruimte) om te ontdooien.</li>
	<li>Plaats het in de handel verkrijgbare multifunctionele apparaat (MD; zie materiaaltabel) 1 dag voor het experiment (37 °C, 5% CO2) in de incubator om op te warmen.</li>
	<li>Plaats steriele pipetpunten met brede uiteinden in de koelkast bij 4 °C. OPMERKING: Stappen 1.1-1.3 moeten worden uitgevoerd op dag 0 en stappen 1.4-1.11 m...

De MD, als aanvulling op formuleringen en protocollen die hier worden beschreven, vergemakkelijkt snelle en spontane 3D-groei van organoïden en sferoïden in een meer gecontroleerde omgeving en zet het experiment voort in dezelfde omstandigheden. Het monster blijft gedurende het hele proces in dezelfde omgeving en bijna 100% van de 3D-groeiarchitecturen blijven intact in de container. Dit verbetert de homogeniteit tijdens de sequentiële experimenten en maakt een langere kweekperiode mogelijk. Bovendien is het aantal st...

De toekomst van celonderzoek en -therapie ligt binnen 3D-celculturen 1,2,3. Organoïde en sferoïde modellen dichten de kloof tussen in vitro experimenten en diermodellen door betere modellen te maken die de ontwikkeling van het menselijk lichaam, fysiologie en ziekten nabootsen 4,5,6,7,8,9. De reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid van deze modellen blijven echter een uitdaging. Bovendien resulteert het hanteren, oogsten, overbrengen en centrifugeren van deze structuren met de huidige technologieën in verlies of beschadiging van de organoïden en sferoïden in veel omstandigheden, wat de resultaten aanzienlijk beïnvloedt.

Ondanks vele protocollen voor histologische kleuring, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentie-etikettering en cryopreservatie, is er geen universele benadering met betrekking tot het standaardiseren van experimentele omstandigheden, het hanteren en verwerken van deze delicate structuren zonder ze te verliezen of te beschadigen. De huidige protocollen zijn ook ongelooflijk lang, afwisselend van enkele dagen tot enkele weken, en omvatten complexe procedures met verschillende reagentia 10,11,12,13,14. Bovendien veroorzaken het oogsten, pipetteren, centrifugen en overbrengen van 3D-groeistructuren tussen celkweekvaten en cryovialen veranderingen in de positionering van de structuren en mechanische krachten en beïnvloeden ze uiteindelijk de differentiatie en rijping van de organoïden en sferoïden. Er is gemeld dat weefseltopologie, positionering van de cellen en mechanische krachten een significante invloed hebben op celdifferentiatie en rijping 6,15,16,17.

Daarom is het wenselijk om de huidige conventionele technologieën te verbeteren om organoïden en sferoïden met stabiele kwaliteit te genereren. Een methode/apparaat dat de hierboven beschreven centrifugatie en andere stappen overslaat en het materiaal van het begin tot het einde van de meerdere processen in één veilige omgeving levert, zou gunstig zijn om de meest consistente en betrouwbare gegevens te bereiken. Bovendien zal dit de tijds-, arbeids- en kostenbeperkingen verminderen.
Het hier beschreven multipurpose device (MD) biedt één veilige omgeving voor meerdere processen van organoïden en sferoïden (aanvullende figuur 1). Dit apparaat en aanvullende protocollen elimineren de stappen voor het oogsten, pipetteren, overbrengen en centrifugeren. De organoïden en sferoïden blijven in hun in vitro omgeving tijdens de sequentiële processen. Deze omgeving bestaat voornamelijk uit natuurlijke of synthetische extracellulaire matrixcomponenten, zoals in de handel verkrijgbare hydrogels. Met andere woorden, de hier beschreven methoden maken het mogelijk om een monster van organoïden / sferoïden in zijn geheel te verwerken, te onderzoeken en te invriezen terwijl het nog in een hydrogeldruppel zit.
Het biocompatibele apparaat is bestand tegen temperaturen tussen 60 °C en -160 °C, wat het mogelijk maakt om de organoïden/steroïden in een tank met vloeibare stikstof bij -160 °C te herstellen of om harsblokken voor te bereiden voor elektronenmicroscopie bij 60 °C. De niche in het apparaat is ontworpen om een beperkte ruimte voor 3D-groeistructuren te definiëren en de vorming van sferoïden of organoïden te stimuleren op basis van de vorige studies 18,19,20,21,22,23. Dat deel van het apparaat is transparant en bevat een specifieke kunststof die een hoge optische kwaliteit biedt (brekingsindex: 1,43; abbewaarde: 58; dikte: 7,8 mil [0,0078 in of 198 μm]). Zowel de nis als het omringende 'zijdeel' veroorzaken autofluorescentie. De transparante nis in het midden heeft een 80 mm2-oppervlak, terwijl het zijgedeelte 600 mm2 is. De diepte van de container is 15 mm en de dikte is 1,5 mm. Deze kenmerken, naast de grootte en het ontwerp van het apparaat, maken het mogelijk om waarnemingen te doen onder verschillende soorten hightech microscoop en de monsters voor te bereiden op elektronenmicroscopisch onderzoek (figuur 2). Het sluitsysteem van het apparaat biedt twee posities, een verzegeld in de vriezer en de andere waardoor gasstroom in de incubator mogelijk is. CCK8-proliferatie- en cytotoxiciteitstests tonen vergelijkbare effecten op cellen in vergelijking met de traditionele celkweekschalen (aanvullende figuur 2). Trypan blue exclusion test toont een hoge levensvatbaarheid van cellen (94%) tijdens de celkweek in de MD (figuur 3).
De processen die kunnen worden uitgevoerd voor één monster in het enkele apparaat omvatten (1) kweken, (2) histologische kleuring, (3) immunostaining, inclusief immunohistochemische en immunofluorescentielabeling, (4) invriezen, (5) ontdooien, (6) onderzoeken onder optische microscopen, zoals brightfield,darkfield, fluorescentie, confocale en superresolutie microscopen, (7) coating en onderzoek rechtstreeks onder een scanning elektronenmicroscoop, of (8) voorbereiding op transmissie-elektronenmicroscopie ( Figuur 2).
Er bestaan verschillende methodologieën voor histologische kleuring, immunohistochemische etikettering of fluorescerend labelen van organoïden en sferoïden 10,11,12,13,14,24,25. Het oogsten van hen uit de hydrogel is de eerste en belangrijkste stap van de huidige technologie. Na deze stap maken sommige methoden immuno-labeling met hele mount mogelijk. De geoogste organoïden zijn ingebed in paraffine, gesegmenteerd en gelabeld voor kleuring en immunostaining in anderen. Het is echter mogelijk dat de secties niet het volledige monster presenteren en slechts beperkte gegevens bevatten met betrekking tot de 3D-architectuur van de structuur. Bovendien zijn schade aan deze 3D-structuren en verlies van antigeniciteit bekende bijwerkingen van deze technologieën.
De aanvullende nieuwe protocollen voor microscopisch onderzoek in dit artikel maken een analyse mogelijk van monsters van de hele montering die nog in een hydrogel zitten. De hier beschreven protocollen omvatten twee nieuw ontwikkelde formuleringen: oplossing voor immunohistochemie (S-IHC) en oplossing voor immunofluorescentie-etikettering (S-IF). De methoden met deze oplossingen stellen onderzoekers in staat om nauwkeurigere gegevens te verkrijgen, omdat er geen schadelijke effecten zijn van traditionele workflows, zoals centrifuging, pipetteren en overbrengen van de delicate structuren. Het hier beschreven protocol elimineert ook de noodzaak voor het oogsten, blokkeren, opruimen en ophalen van antigeen en verkort de hele procedure tot 6-8 uur. Bovendien maakt de methodologie het mogelijk om tegelijkertijd één tot drie antilichamen toe te voegen aan dezelfde S-IF. Daarom is het mogelijk om de resultaten op dezelfde dag te krijgen, zelfs na de meerdere etiketteringsexperimenten, wat een ander voordeel is van het hier beschreven protocol; traditionele immunofluorescentie-etiketteringsprotocollen met hele mount duren meestal tussen de 3 dagen en enkele weken 10,11,12,13,14.
Paraffine-inbedding, een andere schadelijke stap die de antigeniciteit vermindert, wordt ook weggelaten. De 3D-structuur blijft in zijn in vitro omgeving van het begin tot het einde van het microscopisch onderzoek. Omdat de 3D-structuur in zijn groeiomstandigheden blijft, bootsen de eiwitexpressie- en lokalisatiegegevens in vivo omstandigheden beter na. Er worden nauwkeurigere resultaten verwacht, omdat de methodologie de stappen elimineert die de antigeenexpressie van het monster beïnvloeden. Tabel 1 en tabel 2 laten zien hoe deze nieuwe protocollen stappen elimineren, tijd en arbeid in het laboratorium besparen en kosten en afvalproducten verlagen in vergelijking met traditionele workflows.
Naast de cruciale stappen die hierboven zijn beschreven, is een ander probleem het bieden van een cryopreservatiemedium en een methode om de 3D-structuur van het monster te behouden met hogere levensvatbaarheidssnelhedenvan cellen 26,27,28,29,30,31. Cryopreservatie is essentieel voor het creëren van een stabiel modelsysteem en het mogelijk maken van de biobanking van organoïden en sferoïden32,33. Biobanking van de hele originele 3D-structuur zal een meer getrouwe recapitulatie van de natuurlijke gezondheidstoestand of ziekte mogelijk maken. De belangrijkste overwegingen zijn het gemak en de betrouwbaarheid van cryopreservatie en het ontdooien van organoïden / sferoïden. Post-dooi organoïde herstel is zeer laag in de meeste huidige technologieën, vaak minder dan 50%. Recente studies hebben echter veelbelovende resultaten laten zien met verbeterde overlevingskansenvan 26,27,28,29. Lee et al. toonden aan dat 78% van de sferoïde cellen overleefde na cryopreservatie toen ze de oplossing van de Universiteit van Wisconsin gebruikten die 15% DMSO28 bevatte. De celoverlevingsratio steeg tot 83% in de studie van Arai et al.29. De resultaten na cryopreservatie worden echter aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. Bovendien zijn serumvrije reagentia vereist voor goede productiepraktijken in farmaceutische en diagnostische omgevingen. Traditionele workflows gebruiken een medium met foetaal runderserum (FBS) en dimethylsulfoxide (DMSO) voor de langzaam invriezende methode, die beide geassocieerd zijn met handicaps. FBS is een dierlijk product en kan batchvariaties hebben. DMSO is een zeer succesvol cryoprotectant, maar langdurige blootstelling, vooral tijdens het ontdooien, kan cytotoxische effecten veroorzaken30,31.
Dit artikel beschrijft ook de bevriezings-/ontdooimethode van hele organoïden of sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten. In het onderzoek worden twee formules voor het invriezen van organoïden en sferoïden gebruikt: (1) 10% DMSO met traditionele vriesoplossing (FS) en (2) een serum- en DMSO-vrij cryopreservatiemedium. Dit cryopreservatiemedium bevat extracellulaire matrixcomponenten, die verschillen van de huidige formules. De extracellulaire matrix bestaat uit twee hoofdklassen van macromoleculen, proteoglycanen en vezelige eiwitten, die essentieel zijn voor fysieke steigers voor de cellulaire bestanddelen, maar ook processen initiëren die nodig zijn voor weefselmorfogenese, differentiatie en homeostase 34,35,36,37,38,39,40 . Collageen biedt treksterkte, reguleert de celadhesie, ondersteunt chemotaxis en migratie en directe weefselontwikkeling37. Bovendien bieden elastinevezels terugslag naar weefsels die herhaalde rek ondergaan38. Een derde vezelig eiwit, fibronectine, stuurt de organisatie van de interstitiële extracellulaire matrix en heeft een cruciale rol bij het bemiddelen van celaanhechting en functioneert als een extracellulaire mechano-regulator39. Du et al. hebben het cryoprotectieve effect van kippencollageenhydrolysaat op het natuurlijke actomyosinemodelsysteem41 aangetoond. Hun resultaten suggereren dat collageenhydrolysaat de groei van ijskristallen kan remmen, eiwitbevriezing en oxidatie kan verminderen, vergelijkbaar met commerciële cryoprotectanten, en een betere gelstructuur kan bieden na vries-dooicycli. Daarom biedt het toevoegen van extracellulaire matrixcomponenten aan de cryopreservatiemedia een veiligere en beschermende omgeving voor het monster en ondersteunt het de levende structuren om te genezen na bevriezing-ontdooien.
Bovendien beschrijft de huidige studie een eenvoudig protocol om cytoplasmatische membranen en kernen van levende organoïden en sferoïden te labelen terwijl ze zich nog in de hydrogel bevinden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

Organoïden en sferoïden, driedimensionale groeistructuren in celkweeklaboratoria, worden steeds meer erkend als superieure modellen in vergelijking met tweedimensionale kweekmodellen, omdat ze het menselijk lichaam beter nabootsen en voordelen hebben ten opzichte van dierstudies. Deze studies hebben echter vaak problemen met reproduceerbaarheid en consistentie. Tijdens de lange experimentele processen - met overdrachten van organoïden en sferoïden tussen verschillende celkweekvaten, pipetteren en centrifugeren - worden deze gevoelige en fragiele 3D-groeistructuren vaak beschadigd of verloren. Uiteindelijk worden de resultaten aanzienlijk beïnvloed, omdat de 3D-structuren niet dezelfde kenmerken en kwaliteit kunnen behouden. De hier beschreven methoden minimaliseren deze stressvolle stappen en zorgen voor een veilige en consistente omgeving voor organoïden en sferoïden gedurende de hele verwerkingssequentie terwijl ze zich nog in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat bevinden. De onderzoekers kunnen groeien, bevriezen, ontdooien, verwerken, vlekken, labelen en vervolgens de structuur van organoïden of sferoïden onderzoeken onder verschillende hightech-instrumenten, van confocale tot elektronenmicroscopen, met behulp van een enkel multifunctioneel apparaat. Deze technologie verbetert de reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en validiteit van de studies, terwijl een stabiele en beschermende omgeving voor de 3D-groeistructuren tijdens de verwerking behouden blijft. Bovendien minimaliseert het elimineren van stressvolle stappen afhandelingsfouten, vermindert het de benodigde tijd en vermindert het het risico op besmetting.

Dit artikel vertegenwoordigt een multifunctioneel apparaat (MD) en vormt een aanvulling op methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, histologische kleuring, immunohistochemische kleuring, immunofluorescentie-etikettering, coating en verwerking van volledige organoïden of sferoïden terwijl ze zich nog in een hydrogel bevinden in een enkele uniek ontworpen omgeving. De huidige studie is ontworpen om HepG2-leverkankersferoïden te bereiden in 35 hydrogeldruppels in 35 MD's. Experimenten werden uitgevoerd in d...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

De huidige studie beschrijft methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, kleuren, labelen en onderzoeken van volledige sferoïden en organoïden onder verschillende microscopen, terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat.

Kweken, invriezen, verwerken en afbeelden van volledige organoïden en sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Organoïden en sferoïden, die zeer kwetsbaar zijn, raken ernstig beschadigd tijdens het hanteren. Ons protocol zorgt ervoor dat deze 3D-teeltstructuren intact blijven tijdens verschillende processen, waardoor de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid, betrouwbaarheid en herhaalbaarheid toenemen. De onderzoeker kan hele organoïden en sferoïden kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, beitsen, labelen en onderzoeken onder verschillende microscopen terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een enkel multifunctioneel apparaat.Het maakt het mogelijk om een ziektemodel te maken en sequentiële stappen in één multifunctioneel apparaat te volgen. De technologie brengt meer nauwkeurigheid bij het onderzoeken van biomarkers voor diagnose en prognose van ziekten. Deze methode kan worden toegepast op elk 3D-groeisysteem, inclusief organoïden, sferoïden, individuele cellen of levende organismen.Om de organoïde of sferoïde cultuur te beginnen, plaatst u de goed ontdooide hydrogel gedurende 15 minuten op ijs in een laminaire stromingskap. Houd ook de buis met een pellet van het hepatocellulair carcinoom, of HEPG2-cellen, op ijs. Vervolgens plaat 30 tot 35 microliter 100% hydrogel binnen de nis van het voorverwarmde multifunctionele apparaat om een geldruppel te maken, plaats 10.000 HEPG2-cellen in het midden van de bovenkant van de hydrogeldruppel en incubeer de opstelling bij 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.Bedek na incubatie de hydrogeldruppel met 200 microliter Dulbecco's Modified Eagle Medium, of DMEM, met 10% foetaal runderserum of FBS. Plaats het deksel op de juiste manier op het apparaat, zodat het gas kan stromen, voordat u het in de incubator plaatst. Voed de cellen om de dag met 200 microliter DMEM met 10% FBS.Controleer de groei van de sferoïden onder een omgekeerde microscoop. Voordat u begint met immunofluorescentie-etikettering van de organoïden, warmt u de benodigde media en oplossingen op tot 37 graden Celsius. Adem het celkweekmedium rond de hydrogeldruppel aan voordat u 200 microliter 4% paraformaldehyde toevoegt, voorverwarmd tot 37 graden Celsius en fixeer het door het gedurende 15 tot 30 minuten in een incubator op 37 graden Celsius te plaatsen.Aspirateer vervolgens het fixatiemiddel en was de oplossing voor immunofluorescentielabeling, of SIF, drie keer voorverwarmd tot 37 graden Celsius gedurende 10 minuten elk. Voeg gedestilleerd water toe aan het gebied rond de nis om vochtigheid te bieden voordat u doorgaat met de volgende stappen. Aspirateer de SIF rond de hydrogeldruppel en voeg 100 microliter van de voorverwarmde primaire antilichaamoplossing in SIF toe aan de hydrogel voordat u deze gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius incubeert.Aspirateer vervolgens de primaire antilichaamoplossing en was met SIF voorverwarmd tot 37 graden Celsius drie keer gedurende 10 minuten elk. Na de wasbeurt zuigt u de resterende SIF aan en voegt u 100 microliter van de voorverwarmde secundaire antilichaamoplossing in SIF toe aan de hydrogel. Incubeer de hydrogel bij 37 graden Celsius in het donker gedurende 30 tot 60 minuten.Na de incubatie aspirateer de secundaire antilichaamoplossing en was de hydrogeldruppel met PBS op 37 graden Celsius drie keer in het donker gedurende 10 minuten elk. Zuig vervolgens de resterende PBS op en incubeer de hydrogel met 100 microliter nucleaire DNA-vlek met montagemedium of glycerol bij 37 graden Celsius in het donker. Vul de nis met glycerol om drogen te voorkomen voordat u het multifunctionele apparaat met de hydrogel goed sluit.Om de organoïden te onderzoeken door middel van confocale microscopie, stelt u de microscoopparameters in volgens de instructies in het manuscript. Om de organoïden te bevriezen, aspirateert u de celkweekmedia, voegt u 200 microliter van de voorverwarmde vriesoplossing toe en incubeert u het monster gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Sluit het deksel van het apparaat goed voordat u het in een schuimdoos plaatst.Plaats deze schuimdoos in een andere schuimdoos en sluit beide schuimdozen goed af. Bewaar de doos twee uur op min 20 graden Celsius en laat hem dan een nacht in een vriezer van min 80 graden Celsius staan. Om de organoïden langer dan zes maanden te bewaren, verwijdert u het multifunctionele apparaat met de organoïden uit de dozen en brengt u het over naar de tank met vloeibare stikstof.Om de organoïden te ontdooien, haalt u het multifunctionele apparaat met het monster uit de vriezer of de tank met vloeibare stikstof en plaatst u het rechtstreeks in een incubator bij 37 graden Celsius. Eenmaal ontdooid, zuigt u voorzichtig het medium- en vriesoplossingmengsel op voordat u vers medium toevoegt en verder gaat met het in beeld brengen van de organoïde hydrogel met hele montage. In live beeldvorming werden de groeiende organoïden in de hydrogel drie tot vijf dagen na het inbrengen van de celpellet zichtbaar, vooral aan de rand van de hydrogelkoepel.De tijdreeks van beelden op verschillende niveaus van een hydrogel met sferoïden onder een omgekeerde fasecontrastmicroscoop wordt hier weergegeven. Confocale microscopiebeelden van de levende organoïden met hele mount na live-kleuring van het celmembraan en de kern vertoonden een vergelijkbare labelingsdichtheid in de periferie en het centrum. Verder kan de immunofluorescentie-etikettering van de steroïden met hele mount met succes worden uitgevoerd met één antilichaam, twee antilichamen en drie antilichamen, waardoor er geen extra behandelingsstappen nodig zijn.De representatieve analyse toont twee immunofluorescent-gelabelde luchtwegorganoïden in een apparaat. SEM-afbeeldingen van de volledige sferoïden in het multifunctionele apparaat en 10 afbeeldingen van gesegmenteerde steroïden duidden op een goed bewaard gebleven 3D-architectuur van sferoïden, cytoplasmatische organellen en andere ultrastructurele cellulaire kenmerken, wat de effectiviteit van het beschreven protocol aantoont. Onregelmatigheid aan de grenzen van de hydrogelkoepel was duidelijk na het invriezen van de monsters.De grootte en rondheid van de sferoïden bleven echter vergelijkbaar. Celmigratie op het kweekoppervlak werd waargenomen na het ontdooien van de bevroren monsters. De techniek is heel eenvoudig.De onderzoeker moet echter zeer voorzichtig zijn tijdens het aspirateren of toevoegen van vloeistoffen rond de hydrogeldruppel om te voorkomen dat het monster wordt beschadigd. De onderzoeker kan hetzelfde monster in een enkel apparaat bekijken met behulp van een hightech microscoop en een correlatieve studie uitvoeren.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Invriezen menselijke embryonale stamcellen

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Flash Invriezen en Cryosectioning E12.5 hersenen van muizen

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Kweken van Menselijke neus epitheelcellen op de Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage en Invriezen Modellen van Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

High-throughput beeldanalyse van bolvormige tumoren: Een gebruiksvriendelijke software Toepassing op de Grootte van Sferoïden Meet automatisch en nauwkeurig

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-kweek van organoïden uit het intestinale villi-epitheel dat dedifferentiatie ondergaat

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...