Name: culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Wir danken Dale Mertes von der University of Chicago für die Erstellung der Diagramme, Dr. Mehmet Serif Aydin für seine technische Unterstützung am Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies und Dr. Rana Kazemi von der Maltepe University für die Bearbeitung des Manuskripts.

1. Kultivierung von Organoiden und Sphäroiden
<ol><li>Legen Sie das Hydrogel über Nacht auf Eis (in einem Kühlschrank oder einem Kühlraum), um aufzutauen.</li>
	<li>Das handelsübliche Mehrzweckgerät (MD; siehe Materialtabelle) 1 Tag vor dem Versuch (37 °C, 5% CO2) zum Erwärmen in den Inkubator stellen.</li>
	<li>Sterile Pipettenspitzen mit breitem Ende bei 4 °C in den Kühlschrank stellen. HINWEIS: Die Schritte 1.1-1.3 sind an Tag 0 und die Schritte 1.4-1.11 an T...

Der MD, der die hier beschriebenen Formulierungen und Protokolle ergänzt, ermöglicht ein schnelles und spontanes 3D-Wachstum von Organoiden und Sphäroiden in einer kontrollierteren Umgebung und setzt das Experiment unter den gleichen Bedingungen fort. Die Probe bleibt während des gesamten Prozesses in der gleichen Umgebung, und fast 100% der 3D-Wachstumsarchitekturen bleiben im Container intakt. Dies verbessert die Homogenität während der sequentiellen Experimente und ermöglicht eine verlängerte Kulturperiode. Da...

Die Zukunft der Zellforschung und -therapie liegt in 3D-Zellkulturen 1,2,3. Organoid- und Sphäroidmodelle schließen die Lücke zwischen In-vitro-Experimenten und Tiermodellen, indem sie bessere Modelle schaffen, die die Entwicklung, Physiologie und Krankheiten des menschlichen Körpers nachahmen 4,5,6,7,8,9. Die Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit dieser Modelle bleibt jedoch eine Herausforderung. Darüber hinaus führt die Handhabung, Ernte, Übertragung und Zentrifugierung dieser Strukturen mit aktuellen Technologien unter vielen Bedingungen zu Verlust oder Beschädigung der Organoide und Sphäroide, was die Ergebnisse erheblich beeinflusst.

Trotz vieler Protokolle für histologische Färbung, immunhistochemische Färbung, Immunfluoreszenzmarkierung und Kryokonservierung gibt es keinen universellen Ansatz zur Standardisierung experimenteller Bedingungen, zur Handhabung und Verarbeitung dieser empfindlichen Strukturen, ohne sie zu verlieren oder zu beschädigen. Aktuelle Protokolle sind auch unglaublich lang, wechseln sich von wenigen Tagen bis zu mehreren Wochen ab und beinhalten komplexe Verfahren mit verschiedenen Reagenzien 10,11,12,13,14. Darüber hinaus verursachen das Ernten, Pipettieren, Zentrifugieren und Übertragen von 3D-Wachstumsstrukturen zwischen Zellkulturgefäßen und Kryozellen Veränderungen in der Positionierung der Strukturen und mechanischen Kräfte und beeinflussen letztendlich die Differenzierung und Reifung der Organoide und Sphäroide. Es wurde berichtet, dass die Gewebetopologie, die Positionierung der Zellen und mechanische Kräfte die Zelldifferenzierung und -reifung signifikant beeinflussen 6,15,16,17.

Daher ist es wünschenswert, die derzeitigen konventionellen Technologien zur Erzeugung von Organoiden und Sphäroiden mit stabiler Qualität zu verbessern. Eine Methode/Vorrichtung, die die Zentrifugation und andere oben beschriebene Schritte überspringt und das Material von Anfang bis Ende der verschiedenen Prozesse in einer einzigen sicheren Umgebung bereitstellt, wäre von Vorteil, um die konsistentesten und zuverlässigsten Daten zu erhalten. Darüber hinaus reduziert dies Zeit-, Arbeits- und Kostenbeschränkungen.
Das hier beschriebene Mehrzweckgerät (MD) bietet eine einzige sichere Umgebung für mehrere Prozesse von Organoiden und Sphäroiden (ergänzende Abbildung 1). Dieses Gerät und ergänzende Protokolle eliminieren die Schritte Ernten, Pipettieren, Übertragen und Zentrifugieren. Die Organoide und Sphäroide bleiben während der sequentiellen Prozesse in ihrer in vitro Umgebung. Diese Umgebung besteht hauptsächlich aus natürlichen oder synthetischen extrazellulären Matrixkomponenten, wie handelsübliche Hydrogele. Mit anderen Worten, die hier beschriebenen Methoden ermöglichen es, eine ganze Probe von Organoiden / Sphäroiden zu verarbeiten, zu untersuchen und einzufrieren, während sie sich noch in einem Hydrogeltropfen befindet.
Das biokompatible Gerät ist beständig gegen Temperaturen zwischen 60 °C und -160 °C, wodurch es möglich ist, die Organoide/Steroide in einem Flüssigstickstofftank bei -160 °C wiederherzustellen oder Harzblöcke für die Elektronenmikroskopie bei 60 °C vorzubereiten. Die Nische im Gerät wurde entwickelt, um einen begrenzten Raum für 3D-Wachstumsstrukturen zu definieren und die Bildung von Sphäroiden oder Organoiden basierend auf den vorherigen Studien 18,19,20,21,22,23 zu stimulieren. Dieser Teil des Geräts ist transparent und enthält einen spezifischen Kunststoff, der eine hohe optische Qualität bietet (Brechungsindex: 1,43; Abbe-Wert: 58; Dicke: 7,8 mil [0,0078 Zoll oder 198 μm]). Sowohl die Nische als auch der umgebende "Seitenteil" verursachen Autofluoreszenz. Die transparente Nische in der Mitte hat eine Fläche von 80 mm 2, während der Seitenteil 600 mm2 beträgt. Die Tiefe des Behälters beträgt 15 mm und die Dicke 1,5 mm. Diese Merkmale sowie die Größe und das Design des Geräts ermöglichen es, Beobachtungen unter verschiedenen Arten von High-Tech-Mikroskopen durchzuführen und die Proben für elektronenmikroskopische Untersuchungen vorzubereiten (Abbildung 2). Das Schließsystem des Geräts bietet zwei Positionen, eine im Gefrierschrank und die andere für den Gasfluss im Inkubator. CCK8-Proliferations- und Zytotoxizitätstests zeigen ähnliche Wirkungen auf Zellen im Vergleich zu den traditionellen Zellkulturschalen (ergänzende Abbildung 2). Der Trypanblau-Exschlusstest zeigt eine hohe Zelllebensfähigkeit (94%) während der Zellkultur in der MD (Abbildung 3).
Die Prozesse, die für eine Probe in der einzelnen Vorrichtung durchgeführt werden können, umfassen (1) Kultivierung, (2) histologische Färbung, (3) Immunfärbung, einschließlich immunhistochemischer und Immunfluoreszenzmarkierung, (4) Einfrieren, (5) Auftauen, (6) Untersuchung unter optischen Mikroskopen wie Hellfeld-, Dunkelfeld-, Fluoreszenz-, Konfokal- und hochauflösenden Mikroskopen, (7) Beschichtung und Untersuchung direkt unter einem Rasterelektronenmikroskop oder (8) Vorbereitung auf die Transmissionselektronenmikroskopie ( Abbildung 2).
Es gibt verschiedene Methoden für histologische Färbung, immunhistochemische Markierung oder fluoreszierende Markierung von Organoiden und Sphäroiden 10,11,12,13,14,24,25. Die Ernte aus dem Hydrogel ist der erste und wichtigste Schritt der aktuellen Technologie. Nach diesem Schritt ermöglichen einige Methoden eine Whole-Mount-Immunmarkierung. Die geernteten Organoide werden in Paraffin eingebettet, geschnitten und für die Färbung und Immunfärbung in anderen markiert. Die Abschnitte stellen jedoch möglicherweise nicht die gesamte Stichprobe dar und liefern nur begrenzte Daten zur 3D-Architektur der Struktur. Darüber hinaus sind Schäden an diesen 3D-Strukturen und der Verlust der Antigenität bekannte Nebenwirkungen dieser Technologien.
Die ergänzenden neuen Protokolle für mikroskopische Untersuchungen in diesem Artikel ermöglichen eine Analyse ganzer Proben, die sich noch in einem Hydrogel befinden. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen zwei neu entwickelte Formulierungen: Lösung für Immunhistochemie (S-IHC) und Lösung für Immunfluoreszenzmarkierung (S-IF). Die Methoden mit diesen Lösungen ermöglichen es den Forschern, genauere Daten zu gewinnen, da traditionelle Arbeitsabläufe wie Zentrifugieren, Pipettieren und Übertragen der empfindlichen Strukturen keine schädlichen Auswirkungen haben. Das hier beschriebene Protokoll eliminiert auch die Notwendigkeit von Ernte-, Blockierungs-, Clearing- und Antigen-Retrieval-Schritten und verkürzt den gesamten Vorgang auf 6-8 h. Darüber hinaus ermöglicht die Methodik die gleichzeitige Zugabe von ein bis drei Antikörpern zu demselben S-IF. Daher ist es möglich, die Ergebnisse auch nach den mehrfachen Markierungsexperimenten noch am selben Tag zu erhalten, was ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen Protokolls ist; Herkömmliche Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Markierungsprotokolle dauern typischerweise zwischen 3 Tagen und mehreren Wochen 10,11,12,13,14.
Paraffineinbettung, ein weiterer schädlicher Schritt, der die Antigenität reduziert, wird ebenfalls weggelassen. Die 3D-Struktur bleibt von Anfang bis Ende der mikroskopischen Untersuchung in ihrer In-vitro-Umgebung . Da die 3D-Struktur in ihren Wachstumsbedingungen bleibt, ahmen die Proteinexpressions- und Lokalisierungsdaten die In-vivo-Bedingungen besser nach. Es werden genauere Ergebnisse erwartet, da die Methodik die Schritte eliminiert, die die Antigenexpression der Probe beeinflussen. Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen, wie diese neuen Protokolle Schritte eliminieren, Zeit und Arbeit im Labor sparen und Kosten und Abfallprodukte im Vergleich zu herkömmlichen Arbeitsabläufen reduzieren.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen entscheidenden Schritten besteht ein weiteres Problem darin, ein Kryokonservierungsmedium und eine Methode zur Erhaltung der 3D-Struktur der Probe mit höheren Zelllebensfähigkeitsratenbereitzustellen 26,27,28,29,30,31. Kryokonservierung ist unerlässlich, um ein stabiles Modellsystem zu schaffen und das Biobanking von Organoiden und Sphäroiden zu ermöglichen32,33. Biobanking der gesamten ursprünglichen 3D-Struktur ermöglicht eine getreuere Rekapitulation des natürlichen Gesundheits- oder Krankheitszustands. Die wichtigsten Überlegungen sind die Bequemlichkeit und Zuverlässigkeit der Kryokonservierung und das Auftauen von Organoiden / Sphäroide. Die Organoidrückgewinnung nach dem Auftauen ist in den meisten aktuellen Technologien sehr gering, oft weniger als 50%. Neuere Studien haben jedoch vielversprechende Ergebnisse mit verbesserten Überlebensratengezeigt 26,27,28,29. Lee et al. zeigten, dass 78% der Sphäroidzellen nach der Kryokonservierung überlebten, wenn sie die Lösung der University of Wisconsin verwendeten, die 15% DMSO28 enthielt. Die Zellüberlebensrate stieg in der Studie von Arai et al.29 auf 83%. Die Ergebnisse nach der Kryokonservierung werden jedoch erheblich beeinflusst, da die 3D-Strukturen nicht die gleichen Eigenschaften und Qualitäten beibehalten können. Darüber hinaus sind serumfreie Reagenzien für die gute Herstellungspraxis in pharmazeutischen und diagnostischen Umgebungen erforderlich. Traditionelle Arbeitsabläufe verwenden ein Medium, das fetales Rinderserum (FBS) und Dimethylsulfoxid (DMSO) für die langsame Gefriermethode enthält, die beide mit Behinderungen verbunden sind. FBS ist ein tierisches Produkt und kann Chargenvariationen aufweisen. DMSO ist ein sehr erfolgreiches Kryoprotektivum, aber eine langfristige Exposition, insbesondere während des Auftauens, kann zytotoxische Wirkungen verursachen30,31.
Dieser Artikel beschreibt auch die Gefrier-/Auftaumethode ganzer Organoide oder Sphäroide noch in einem Hydrogel. In der Studie werden zwei Formeln zum Einfrieren von Organoiden und Sphäroiden verwendet: (1) 10% DMSO mit herkömmlicher Gefrierlösung (FS) und (2) ein serum- und DMSO-freies Kryokonservierungsmedium. Dieses Kryokonservierungsmedium enthält extrazelluläre Matrixkomponenten, die sich von aktuellen Formeln unterscheiden. Die extrazelluläre Matrix umfasst zwei Hauptklassen von Makromolekülen, Proteoglykanen und faserigen Proteinen, die für das physikalische Gerüst der zellulären Bestandteile unerlässlich sind, aber auch Prozesse initiieren, die für die Morphogenese, Differenzierung und Homöostase des Gewebes erforderlich sind 34,35,36,37,38,39,40 . Kollagene sorgen für Zugfestigkeit, regulieren die Zelladhäsion, unterstützen Chemotaxis und Migration und steuern die Gewebeentwicklung37. Darüber hinaus bieten Elastinfasern Rückstoß für Gewebe, die wiederholt gedehnt werden38. Ein drittes faseriges Protein, Fibronektin, steuert die Organisation der interstitiellen extrazellulären Matrix und spielt eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Zellbindung und fungiert als extrazellulärer Mechanoregulator39. Du et al. haben die kryoprotektive Wirkung von Hühnerkollagenhydrolysat auf das natürliche Actomyosin-Modellsystem41 nachgewiesen. Ihre Ergebnisse deuten darauf hin, dass Kollagenhydrolysat das Wachstum von Eiskristallen hemmen, die Proteingefrierdenaturierung und -oxidation ähnlich wie kommerzielle Kryoprotektiva reduzieren und nach Gefrier-Tau-Zyklen eine bessere Gelstruktur bieten kann. Daher bietet die Zugabe extrazellulärer Matrixkomponenten zu den Kryokonservierungsmedien eine sicherere und schützendere Umgebung für die Probe und unterstützt die Heilung der lebenden Strukturen nach dem Einfrieren und Auftauen.
Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Studie ein einfaches Protokoll zur Markierung von zytoplasmatischen Membranen und Kernen lebender Organoide und Sphäroide, während sie sich noch im Hydrogel befinden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

Organoide und Sphäroide, dreidimensionale Wachstumsstrukturen in Zellkulturlaboren, werden zunehmend als überlegene Modelle im Vergleich zu zweidimensionalen Kulturmodellen anerkannt, da sie den menschlichen Körper besser nachahmen und Vorteile gegenüber Tierversuchen haben. Diese Studien haben jedoch häufig Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Konsistenz. Während der langen experimentellen Prozesse - mit Transfers von Organoiden und Sphäroiden zwischen verschiedenen Zellkulturgefäßen, Pipettieren und Zentrifugieren - werden diese anfälligen und fragilen 3D-Wachstumsstrukturen oft beschädigt oder gehen verloren. Letztendlich werden die Ergebnisse erheblich beeinflusst, da die 3D-Strukturen nicht die gleichen Eigenschaften und Qualitäten beibehalten können. Die hier beschriebenen Methoden minimieren diese stressigen Schritte und gewährleisten eine sichere und konsistente Umgebung für Organoide und Sphäroide während des gesamten Verarbeitungsablaufs, während sie sich noch in einem Hydrogel in einem Mehrzweckgerät befinden. Die Forscher können die Struktur von Organoiden oder Sphäroiden unter verschiedenen High-Tech-Instrumenten, vom Konfokal- bis zum Elektronenmikroskop, mit einem einzigen Mehrzweckgerät züchten, einfrieren, auftauen, verarbeiten, färben, markieren und dann untersuchen. Diese Technologie verbessert die Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Gültigkeit der Studien und sorgt gleichzeitig für eine stabile und schützende Umgebung für die 3D-Wachstumsstrukturen während der Verarbeitung. Darüber hinaus minimiert die Eliminierung stressiger Schritte Handhabungsfehler, reduziert den Zeitaufwand und verringert das Kontaminationsrisiko.

Der vorliegende Artikel stellt ein Mehrzweckgerät (MD) dar und ergänzt Methoden zum Kultivieren, Einfrieren, Auftauen, histologischen Färben, immunhistochemischen Färben, Immunfluoreszenzmarkierung, Beschichten und Verarbeiten ganzer Organoide oder Sphäroide, während sie sich noch in einem Hydrogel in einer einzigen, einzigartig gestalteten Umgebung befinden. Die aktuelle Studie wurde entwickelt, um HepG2-Leberkrebs-Sphäroide in 35 Hydrogel-Tropfen in 35 MDs herzustellen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfe...

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Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zum Kultivieren, Einfrieren, Auftauen, Verarbeiten, Färben, Markieren und Untersuchen ganzer Sphäroide und Organoide unter verschiedenen Mikroskopen, während sie in einem Hydrogel in einem Mehrzweckgerät intakt bleiben.

Kultivierung, Einfrieren, Verarbeitung und Bildgebung ganzer Organoide und Sphäroide noch in einem Hydrogel

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Organoide und Sphäroide, die sehr zerbrechlich sind, werden bei der Handhabung ernsthaft beschädigt. Unser Protokoll stellt sicher, dass diese 3D-Wachstumsstrukturen während verschiedener Prozesse intakt bleiben, wodurch die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit erhöht wird. Der Forscher kann ganze Organoide und Sphäroide unter verschiedenen Mikroskopen kultivieren, einfrieren, auftauen, verarbeiten, färben, markieren und untersuchen, während sie in einem Hydrogel in einem einzigen Mehrzweckgerät intakt bleiben.Es ermöglicht die Erstellung eines Krankheitsmodells und die Verfolgung sequenzieller Schritte in einem Mehrzweckgerät. Die Technologie bringt mehr Genauigkeit bei der Untersuchung von Biomarkern für die Diagnose und Prognose von Krankheiten. Diese Methode kann auf jedes 3D-Wachstumssystem angewendet werden, einschließlich Organoide, Sphäroide, einzelne Zellen oder lebende Organismen.Um die Organoid- oder Sphäroidkultur zu beginnen, legen Sie das ordnungsgemäß aufgetaute Hydrogel für 15 Minuten auf Eis in eine Laminar-Flow-Haube. Bewahren Sie auch das Röhrchen mit einem Pellet des hepatozellulären Karzinoms oder HEPG2-Zellen auf Eis auf. Als nächstes Platte 30 bis 35 Mikroliter 100% Hydrogel in der Nische des vorgewärmten Mehrzweckgeräts, um einen Geltropfen zu erzeugen, platzieren Sie 10.000 HEPG2-Zellen in der Mitte der Oberseite des Hydrogeltropfens und inkubieren Sie das Setup bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten.Nach der Inkubation den Hydrogeltropfen mit 200 Mikrolitern Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) abdecken, das 10% fötales Rinderserum oder FBS enthält. Setzen Sie den Deckel ordnungsgemäß auf das Gerät, damit Gas fließen kann, bevor Sie es in den Inkubator legen. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag mit 200 Mikrolitern DMEM mit 10% FBS.Überprüfen Sie das Wachstum der Sphäroide unter einem inversen Mikroskop. Bevor Sie mit der Immunfluoreszenzmarkierung der Organoide beginnen, erwärmen Sie die erforderlichen Medien und Lösungen auf 37 Grad Celsius. Saugen Sie das Zellkulturmedium, das den Hydrogeltropfen umgibt, ab, bevor Sie 200 Mikroliter 4% Paraformaldehyd hinzufügen, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist, und fixieren Sie es, indem Sie es für 15 bis 30 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius legen.Dann saugen Sie das Fixiermittel ab und waschen Sie die Lösung für die Immunfluoreszenzmarkierung oder SIF, die dreimal für jeweils 10 Minuten auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Fügen Sie destilliertes Wasser in den Bereich um die Nische hinzu, um Feuchtigkeit bereitzustellen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. Saugen Sie das SIF, das den Hydrogeltropfen umgibt, ab und fügen Sie dem Hydrogel 100 Mikroliter der vorgewärmten primären Antikörperlösung in SIF hinzu, bevor Sie es bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten inkubieren.Dann saugen Sie die primäre Antikörperlösung ab und waschen Sie mit SIF, das dreimal für jeweils 10 Minuten auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist. Nach dem Waschen das restliche SIF aspirieren und 100 Mikroliter der vorgewärmten sekundären Antikörperlösung in SIF zum Hydrogel geben. Inkubieren Sie das Hydrogel bei 37 Grad Celsius im Dunkeln für 30 bis 60 Minuten.Nach der Inkubation saugen Sie die sekundäre Antikörperlösung ab und waschen Sie den Hydrogeltropfen mit PBS bei 37 Grad Celsius dreimal im Dunkeln für jeweils 10 Minuten. Als nächstes saugen Sie das restliche PBS ab und inkubieren Sie das Hydrogel mit 100 Mikrolitern Kern-DNA-Färbung, der Montagemedium oder Glycerin enthält, bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Füllen Sie die Nische mit Glycerin, um ein Austrocknen zu vermeiden, bevor Sie das Mehrzweckgerät, das das Hydrogel enthält, fest schließen.Um die Organoide durch konfokale Mikroskopie zu untersuchen, stellen Sie die Mikroskopparameter gemäß den Anweisungen im Manuskript ein. Um die Organoide einzufrieren, saugen Sie die Zellkulturmedien ab, fügen Sie 200 Mikroliter der vorgewärmten Gefrierlösung hinzu und inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Schließen Sie den Deckel des Geräts fest, bevor Sie es in eine Schaumstoffbox legen.Legen Sie diese Schaumstoffbox in eine andere Schaumstoffbox und verschließen Sie beide Schaumstoffboxen fest. Bewahren Sie die Box zwei Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius auf und lassen Sie sie dann über Nacht in einem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank. Um die Organoide länger als sechs Monate zu lagern, nehmen Sie das Mehrzweckgerät mit den Organoiden aus den Boxen und füllen Sie es in den Flüssigstickstofftank.Um die Organoide aufzutauen, nehmen Sie das Mehrzweckgerät, das die Probe enthält, entweder aus dem Gefrierschrank oder dem Flüssigstickstofftank heraus und legen Sie es bei 37 Grad Celsius direkt in einen Inkubator. Nach dem Auftauen saugen Sie das Medium und die Gefrierlösungsmischung vorsichtig ab, bevor Sie frisches Medium hinzufügen und das gesamte organoide Hydrogel abbilden. In der Live-Bildgebung wurden die wachsenden Organoide im Hydrogel drei bis fünf Tage nach dem Einsetzen des Zellpellets sichtbar, insbesondere an der Peripherie der Hydrogelkuppel.Die Zeitreihe von Bildern auf verschiedenen Ebenen eines sphäroidhaltigen Hydrogels unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop ist hier dargestellt. Konfokalmikroskopische Bilder der ganzen lebenden Organoide nach Lebendfärbung der Zellmembran und des Zellkerns zeigten eine ähnliche Markierungsdichte in der Peripherie und im Zentrum. Darüber hinaus konnte die Immunfluoreszenzmarkierung der Whole-Mount-Steroide mit einem Antikörper, zwei Antikörpern sowie drei Antikörpern erfolgreich durchgeführt werden, wodurch zusätzliche Behandlungsschritte überflüssig wurden.Die repräsentative Analyse zeigt zwei immunfluoreszenzmarkierte Atemwegsorganoide in einem Gerät. REM-Bilder der gesamten Sphäroide im Mehrzweckgerät und 10 Bilder von geschnittenen Steroiden zeigten eine gut erhaltene 3D-Architektur von Sphäroide, zytoplasmatischen Organellen und anderen ultrastrukturellen zellulären Merkmalen, was die Wirksamkeit des beschriebenen Protokolls demonstriert. Unregelmäßigkeiten an den Grenzen der Hydrogelkuppel waren nach dem Einfrieren der Proben offensichtlich.Die Größe und Rundheit der Sphäroide blieb jedoch ähnlich. Nach dem Auftauen der gefrorenen Proben wurde eine Zellmigration auf der Kulturoberfläche beobachtet. Die Technik ist sehr einfach.Der Forscher sollte jedoch sehr vorsichtig sein, wenn er den Hydrogeltropfen ansaugt oder Flüssigkeiten hinzufügt, um eine Beschädigung der Probe zu verhindern. Der Forscher kann die gleiche Probe in einem einzigen Gerät mit einem High-Tech-Mikroskop betrachten und eine korrelative Studie durchführen.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Einfrieren menschlicher ES-Zellen

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Forschung

Biologie

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Flash-Freezing und Kryoschneiden E12.5 Gehirn der Maus

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage und Einfrieren der Modelle von Skelettmuskelerkrankungen

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Hochdurchsatz-Analyse von Bild Tumorsphäroide: Eine benutzerfreundliche Software-Anwendung, um die Größe der Sphäroide automatisch und präzise messen

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem-Hochdruck-Schnell Einfrieren und Gefriersubstitution von Pflanzengeweben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-Kultivierung von Organoiden aus dem intestinalen Zottenepithel, das einer Dedifferenzierung unterzogen wird

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...