Name: culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

図の作成にはシカゴ大学のデール・メルテス氏、イスタンブール・メディポール大学健康科学技術研究所での技術支援にはメフメット・セリフ・アイディン博士、原稿の編集にはマルテペ大学のラナ・カゼミ博士に感謝しています。

1. オルガノイドとスフェロイドの培養
<ol><li>ヒドロゲルを氷の上に一晩(冷蔵庫または冷蔵室で)置き、解凍します。</li>
	<li>市販の多目的装置(MD; 材料表参照)を実験の1日前のインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れて加温する。</li>
	<li>滅菌済みのワイドエンドピペットチップを4°Cの冷蔵庫に入れます。 注意: 手順1.1〜1.3は0日目に実行され、手順1.4〜1.11は1日...

MDは、ここで説明する製剤とプロトコルを補完し、より制御された環境でオルガノイドとスフェロイドの迅速かつ自発的な3D成長を促進し、同じ条件で実験を継続します。試験片はプロセス全体を通して同じ環境にとどまり、3D成長アーキテクチャのほぼ100%がコンテナ内にそのまま残ります。これにより、連続実験中の均質性が向上し、培養期間を延長することができます。さらに、オルガノ...

細胞研究と治療の未来は、3D細胞培養にあります1,2,3。オルガノイドモデルとスフェロイドモデルは、人体の発達、生理学、および疾患を模倣するより良いモデルを作成することにより、in vitro実験と動物モデルの間のギャップを埋めます4,5,6,7,8,9。ただし、これらのモデルの再現性と再現性は依然として困難です。さらに、現在の技術でこれらの構造を取り扱い、収穫、移送、および遠心分離すると、多くの条件でオルガノイドとスフェロイドが失われたり損傷したりし、結果に大きな影響を与えます。

組織学的染色、免疫組織化学染色、免疫蛍光標識、および凍結保存のための多くのプロトコルにもかかわらず、実験条件の標準化、取り扱い、およびこれらの繊細な構造を紛失または損傷することなく処理することに関連する普遍的なアプローチはありません。現在のプロトコルはまた、信じられないほど長く、数日から数週間に交互に、様々な試薬10、11、12、13、14を用いた複雑な手順を含む。さらに、細胞培養容器とクライオバイアルの間で3D成長構造を採取、ピペッティング、遠心分離、および移すと、構造の位置と機械的な力が変化し、最終的にはオルガノイドとスフェロイドの分化と成熟に影響を与えます。組織トポロジー、細胞の位置、および機械的な力が細胞の分化と成熟に大きな影響を与えることが報告されています6、15、16、17。

そのため、現在の従来技術を改良して、安定した品質のオルガノイドやスフェロイドを作製することが望ましい。遠心分離および上記の他のステップをスキップし、複数のプロセスの最初から最後まで単一の安全な環境で材料を提供する方法/デバイスは、最も一貫性のある信頼性の高いデータに到達するために有益です。さらに、これにより、時間、労力、およびコストの制約が軽減されます。
ここで説明する多目的デバイス(MD)は、オルガノイドとスフェロイドの複数のプロセスに対して単一の安全な環境を提供します(補足図 1)。このデバイスと補完プロトコルにより、収穫、ピペッティング、移送、遠心分離のステップが不要になります。オルガノイドとスフェロイドは、連続プロセスの間、 in vitro 環境にとどまります。この環境は、主に、市販のヒドロゲルのような天然または合成の細胞外マトリックス成分を含む。言い換えれば、ここで説明する方法では、オルガノイド/スフェロイドのホールマウントサンプルを、ヒドロゲルドロップ中に処理、検査、および凍結することができます。
この生体適合性デバイスは、60°Cから-160°Cの温度に耐性があるため、-160°Cの液体窒素タンクでオルガノイド/ステロイドを復元したり、60°Cで電子顕微鏡用の樹脂ブロックを調製したりすることができます。 デバイスのニッチは、以前の研究に基づいて、3D成長構造のための限られたスペースを定義し、スフェロイドまたはオルガノイドの形成を刺激するように設計されています18、19、20、21、22、23。デバイスのその部分は透明で、高い光学品質を提供する特定のプラスチックが含まれています(屈折率:1.43、アッベ値:58、厚さ:7.8ミル[0.0078インチまたは198μm])。ニッチと周囲の「側面」部分の両方が自家蛍光を引き起こします。中央の透明なニッチは80 mm 2の面積を持ち、側面部分は600 mm2です。容器の深さは15 mm、厚さは1.5 mmです。これらの特長に加え、装置の大きさやデザイン性などにより、各種ハイテク顕微鏡での観察や電子顕微鏡検査用の試料作製が可能です(図2)。装置の閉鎖システムは2つの位置を提供し、1つは冷凍庫に密封され、もう1つはインキュベーター内のガスの流れを可能にする。CCK8増殖および細胞毒性アッセイは、従来の細胞培養皿と比較して細胞に対して同様の効果を示します(補足図2)。トリパンブルー排除試験は、MDでの細胞培養中に高い細胞生存率(94%)を示します(図3)。
単一の装置で1つのサンプルに対して行うことができるプロセスは、(1)培養、(2)組織学的染色、(3)免疫組織化学的および免疫蛍光標識を含む免疫染色、(4)凍結、(5)融解、(6)明視野、暗視野、蛍光、共焦点、および超解像顕微鏡などの光学顕微鏡下での検査、(7)コーティングおよび走査型電子顕微鏡下での直接検査、または(8)透過型電子顕微鏡の準備(図2)。
組織学的染色、免疫組織化学的標識、または蛍光標識オルガノイドおよびスフェロイドには異なる方法論が存在する10、11、12、13、14、24、25。ヒドロゲルからそれらを収穫することは、現在の技術の最初のそして主要なステップです。このステップの後、いくつかの方法では、ホールマウント免疫標識が可能になります。採取されたオルガノイドはパラフィンに包埋され、切片化され、他のオルガノイドの染色および免疫染色のために標識されます。ただし、セクションはサンプル全体を提示せず、構造の3Dアーキテクチャに関連する限られたデータのみを提供する場合があります。さらに、これらの3D構造の損傷と抗原性の喪失は、これらの技術のよく知られた副作用です。
この記事の顕微鏡検査のための補完的な新しいプロトコルにより、まだヒドロゲル中のマウントサンプル全体の分析が可能になります。ここで説明するプロトコルには、免疫組織化学用溶液(S-IHC)と免疫蛍光標識用溶液(S-IF)の2つの新しく開発された製剤が含まれています。これらのソリューションを使用した方法により、遠心分離、ピペッティング、繊細な構造の移送などの従来のワークフローの有害な影響がないため、研究者はより正確なデータを得ることができます。ここで説明するプロトコルはまた、採取、ブロッキング、クリアリング、および抗原賦活化のステップの必要性を排除し、手順全体を6〜8時間に短縮します。さらに、この方法論では、同じS-IFに1〜3個の抗体を同時に追加することができます。したがって、複数の標識実験の後でも同じ日に結果を得ることが可能であり、これはここで説明するプロトコルの別の利点です。従来のホールマウント免疫蛍光標識プロトコルは、通常、3日から数週間かかります10、11、12、13、14。
抗原性を低下させる別の有害なステップであるパラフィン包埋も省略されています。3D構造は、顕微鏡検査の最初から最後までin vitro環境にとどまります。3D構造は成長条件のままであるため、タンパク質の発現および局在データはin vivo条件をよりよく模倣します。この方法論は、サンプルの抗原発現に影響を与えるステップを排除するため、より正確な結果が期待されます。表1と表2は、これらの新しいプロトコルが、従来のワークフローと比較して、ステップを排除し、ラボでの時間と労力を節約し、コストと廃棄物を削減する方法を示しています。 
上記の重要なステップに加えて、別の問題は、より高い細胞生存率でサンプルの3D構造を保存するための凍結保存培地および方法を提供することである26、27、28、29、30、31。凍結保存は、安定したモデルシステムを作成し、オルガノイドとスフェロイドのバイオバンキングを可能にするために不可欠です32,33。元の3D構造全体をバイオバンキングすることで、健康状態や病気の自然な状態をより忠実に再現できます。重要な考慮事項は、凍結保存とオルガノイド/スフェロイドの解凍の利便性と信頼性です。 融解後のオルガノイド回収率は、現在のほとんどの技術では非常に低く、多くの場合50%未満です。しかし、最近の研究では、生存率が改善された有望な結果が示されています26,27,28,29。Leeらは、15%DMSO 28を含むウィスコンシン大学の溶液を使用した場合、スフェロイド細胞の78%が凍結保存後に生存することを実証した。細胞生存率は、新井らの研究で83%に増加した29。ただし、3D構造は同じ特性と品質を維持できないため、凍結保存後の結果は大きく影響を受けます。さらに、無血清試薬は、製薬および診断現場での適正製造基準に必要です。 従来のワークフローでは、ウシ胎児血清(FBS)とジメチルスルホキシド(DMSO)を含む培地を緩慢凍結法に使用していましたが、どちらもハンディキャップに関連しています。FBSは動物由来の製品であり、バッチバリエーションがあります。DMSOは非常に成功した凍結保護剤ですが、特に解凍中の長期暴露は細胞毒性作用を引き起こす可能性があります30,31。
この記事では、ヒドロゲル中のオルガノイド全体またはスフェロイド全体の凍結/解凍方法についても説明します。この研究では、オルガノイドとスフェロイドを凍結するための2つの処方が使用されます:(1)従来の凍結溶液(FS)を含む10%DMSOと、(2)血清およびDMSOを含まない凍結保存培地。この凍結保存培地には、現在の処方とは異なる細胞外マトリックス成分が含まれています。細胞外マトリックスは、プロテオグリカンと繊維状タンパク質の2つの主要なクラスの高分子で構成されており、これらは細胞構成成分の物理的な足場に不可欠ですが、組織の形態形成、分化、および恒常性に必要なプロセスも開始します34,35,36,37,38,39,40.コラーゲンは引張強度を提供し、細胞接着を調節し、走化性と遊走性をサポートし、組織発達を直接します37。さらに、エラスチン繊維は、繰り返し伸張を受ける組織に反跳を与える38。第3の繊維状タンパク質であるフィブロネクチンは、間質性細胞外マトリックスの組織化を指示し、細胞接着を媒介する上で重要な役割を果たし、細胞外メカノレギュレーター39として機能する。Duらは、天然アクトミオシンモデル系41に対するニワトリコラーゲン加水分解物の凍結保護効果を実証した。彼らの結果は、コラーゲン加水分解物が氷結晶成長を阻害し、市販の凍結保護剤と同様にタンパク質の凍結変性と酸化を減らし、凍結融解サイクル後により良いゲル構造を提供できることを示唆しています。 したがって、凍結保存培地に細胞外マトリックス成分を添加すると、サンプルにとってより安全で保護的な環境が提供され、凍結融解後に生体構造が治癒するのをサポートします。
さらに、本研究では、生きたオルガノイドとスフェロイドの細胞質膜と核を、それらがまだヒドロゲル内にある間に標識するための簡単なプロトコルについて説明します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

細胞培養ラボで3次元成長構造であるオルガノイドとスフェロイドは、人体をよりよく模倣し、動物実験よりも優れているため、2次元培養モデルと比較して優れたモデルとしてますます認識されるようになっています。ただし、これらの研究は一般的に再現性と一貫性の問題に直面しています。異なる細胞培養容器間でのオルガノイドとスフェロイドの移動、ピペッティング、遠心分離など、長い実験プロセスでは、これらの影響を受けやすく壊れやすい3D成長構造が損傷または失われることがよくあります。最終的には、3D構造が同じ特性と品質を維持できないため、結果に大きな影響があります。ここで説明する方法は、これらのストレスの多いステップを最小限に抑え、オルガノイドとスフェロイドが多目的デバイスのヒドロゲル中に残っている間、処理シーケンス全体を通して安全で一貫した環境を保証します。研究者は、単一の多目的デバイスを使用して、共焦点顕微鏡から電子顕微鏡まで、さまざまなハイテク機器の下でオルガノイドまたはスフェロイドの構造を成長、凍結、解凍、処理、染色、ラベル付け、および検査することができます。この技術は、処理中に3D成長構造のための安定した保護環境を維持しながら、研究の再現性、信頼性、および妥当性を向上させます。さらに、ストレスの多いステップを排除することで、取り扱いエラーを最小限に抑え、所要時間を短縮し、汚染のリスクを低減します。

本稿は、単一の独自に設計された環境でヒドロゲル中にオルガノイドまたはスフェロイド全体を培養、凍結、解凍、組織学的染色、免疫組織化学染色、免疫蛍光標識、コーティング、および処理するための多目的デバイス(MD)および補完的な方法論を表しています。現在の研究は、35 MDの35ヒドロゲルドロップでHepG2肝がんスフェロイドを調製するように設計されました。さらに、MDの肺オルガ?...

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Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

本研究では、スフェロイドおよびオルガノイド全体を多目的デバイス内のヒドロゲルにそのまま残したまま、さまざまな顕微鏡で培養、凍結、解凍、処理、染色、標識、および検査するための方法論について説明します。

ヒドロゲル中でのオルガノイドおよびスフェロイド全体の培養、凍結、加工、イメージング

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

オルガノイドとスフェロイドは非常に壊れやすいため、取り扱い中に深刻な損傷を受けます。当社のプロトコルは、これらの3D成長構造がさまざまなプロセスで無傷のままであることを保証するため、精度、再現性、信頼性、再現性が向上します。研究者は、オルガノイドとスフェロイド全体をさまざまな顕微鏡で培養、凍結、解凍、処理、染色、標識、および検査することができますが、それらは単一の多目的デバイス内のヒドロゲルにそのまま残ります。これにより、疾患モデルの作成と1つの多目的デバイスでの連続ステップの追跡が可能になります。この技術は、病気の診断と予後のためのバイオマーカーを調べる際に、より精度を高めます。この方法は、オルガノイド、スフェロイド、個々の細胞、または生物を含む任意の3D成長システムに適用できます。オルガノイドまたはスフェロイド培養を開始するには、適切に解凍したヒドロゲルを層流フード内の氷上に15分間置きます。また、肝細胞癌またはHEPG2細胞のペレットを含むチューブを氷上に保管してください。次に、予め温めた多目的装置のニッチ内に30〜35マイクロリットルの100%ヒドロゲルをプレートしてゲルドロップを作成し、ヒドロゲルドロップの上部の中央に10, 000個のHEPG2セルを配置し、セットアップを摂氏37度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、ヒドロゲルドロップを10%ウシ胎児血清(FBS)を含む200マイクロリットルのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で覆います。インキュベーターに入れる前に、ガスの流れを許して、装置に蓋を適切に置きます。一日おきに、10%FBSを含む200マイクロリットルのDMEMを細胞に与えます。倒立顕微鏡でスフェロイドの成長を確認します。オルガノイドの免疫蛍光標識を開始する前に、必要な培地と溶液を摂氏37度に温めます。ヒドロゲルドロップを囲む細胞培養培地を吸引してから、摂氏37度に予熱した4%パラホルムアルデヒド200マイクロリットルを加え、摂氏37度のインキュベーターに15〜30分間入れて固定します。次に、固定液を吸引し、免疫蛍光標識(SIF)用の溶液を、摂氏37度に予め加温した溶液をそれぞれ10分間3回洗浄します。次の手順に進む前に、ニッチの周囲の領域に蒸留水を追加して湿度を提供します。ヒドロゲルドロップを囲むSIFを吸引し、SIF中の100マイクロリットルの予備加熱一次抗体溶液をヒドロゲルに加えてから、摂氏37度で30〜60分間インキュベートします。その後、一次抗体溶液を吸引し、摂氏37度に予め加温したSIFでそれぞれ10分間3回洗浄する。洗浄後、残りのSIFを吸引し、SIF中の予め温めた二次抗体溶液100マイクロリットルをヒドロゲルに加える。ヒドロゲルを摂氏37度で暗所で30〜60分間インキュベートします。インキュベーション後、二次抗体溶液を吸引し、ヒドロゲルドロップを摂氏37度のPBSで3回暗所でそれぞれ10分間洗浄します。次に、残留PBSを吸引し、含入媒体またはグリセロールを含む100マイクロリットルの核DNA染色剤とともにヒドロゲルを摂氏37度の暗所でインキュベートします。ヒドロゲルを含む多目的デバイスをしっかりと閉じる前に、乾燥を避けるためにニッチをグリセロールで満たします。共焦点顕微鏡でオルガノイドを調べるには、原稿の指示に従って顕微鏡パラメータを設定します。オルガノイドを凍結するには、細胞培養培地を吸引し、予め温めた凍結溶液を200マイクロリットル加え、サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。フォームボックスに入れる前に、デバイスの蓋をしっかりと閉めてください。このフォームボックスを別のフォームボックスに入れ、両方のフォームボックスをしっかりと閉じます。箱を摂氏マイナス20度で2時間保ち、マイナス80°Cの冷凍庫に一晩置きます。オルガノイドを6ヶ月以上保管するには、オルガノイドが入っている多目的装置を箱から取り出し、液体窒素タンクに移します。オルガノイドを解凍するには、冷凍庫または液体窒素タンクからサンプルを含む多目的デバイスを取り出し、摂氏37度のインキュベーターに直接入れます。解凍したら、培地と凍結溶液の混合物を穏やかに吸引してから、新しい培地を添加し、ホールマウントオルガノイドヒドロゲルのイメージングに進みます。ライブイメージングでは、ヒドロゲル内の成長しているオルガノイドは、細胞ペレットを挿入してから3〜5日後に、特にヒドロゲルドームの周辺で見えるようになりました。倒立位相差顕微鏡下でのスフェロイドを含むヒドロゲルのさまざまなレベルでの時系列画像がここに示されています。細胞膜と核を生染色した後のホールマウントリビングオルガノイドの共焦点顕微鏡画像は、周辺と中央で同様の標識密度を示しました。さらに、ホールマウントステロイドの免疫蛍光標識は、1つの抗体、2つの抗体、および3つの抗体で正常に実行でき、追加の治療ステップが不要になりました。代表的な分析は、デバイス内の2つの免疫蛍光標識気道オルガノイドを示しています。多目的デバイスにおけるスフェロイド全体のSEM画像および切片化されたステロイドの10枚の画像は、スフェロイド、細胞質オルガネラ、および他の超構造細胞の特徴のよく保存された3D構造を示し、記載されたプロトコルの有効性を実証した。ヒドロゲルドームの境界における不規則性は、サンプルを凍結した後に明らかであった。しかしながら、回転楕円体のサイズおよび真円度は類似したままであった。凍結試料を解凍した後に培養表面上の細胞移動を観察した。テクニックはとても簡単です。ただし、研究者は、サンプルの損傷を防ぐために、ヒドロゲルドロップの周囲の液体を吸引または追加するときは、非常に穏やかである必要があります。研究者は、ハイテク顕微鏡を使用して単一のデバイスで同じサンプルを見て、相関研究を行うことができます。

Research

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