Name: culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Vi er takknemlige til Dale Mertes fra University of Chicago for utarbeidelse av diagrammer, til Dr. Mehmet Serif Aydin for hans tekniske støtte ved Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies, og til Dr. Rana Kazemi fra Maltepe University for redigering av manuskriptet.

1. Dyrking av organoider og sfæroider
<ol><li>Legg hydrogelen på is over natten (i kjøleskap eller kjølerom) for å tine.</li>
	<li>Plasser det kommersielt tilgjengelige flerbruksutstyret (MD; se Materialfortegnelse) i inkubatoren 1 dag før eksperimentet (37 °C, 5 % CO2) for å varmes opp.</li>
	<li>Plasser sterile, brede pipettespisser i kjøleskapet ved 4 °C. MERK: Trinn 1.1-1.3 skal utføres på dag 0, og trinn 1.4-1.11 skal utføres på dag 1.</li>
	<li>Legg hy...

MD, som utfyller formuleringer og protokoller beskrevet her, letter rask og spontan 3D-vekst av organoider og sfæroider i et mer kontrollert miljø og fortsetter eksperimentet under de samme forholdene. Prøven forblir i samme miljø under hele prosessen, og nesten 100% av de 3D-voksende arkitekturene forblir intakte i beholderen. Dette forbedrer homogeniteten under sekvensielle eksperimenter og gir mulighet for en utvidet kulturperiode. I tillegg reduseres antall trinn under organoider og sfæroidbehandling drastisk sa...

Fremtiden for celleforskning og terapi ligger innenfor 3D-cellekulturer 1,2,3. Organoid- og sfæroidmodeller lukker gapet mellom in vitro-eksperimenter og dyremodeller ved å skape bedre modeller som etterligner menneskelig kroppsutvikling, fysiologi og sykdommer 4,5,6,7,8,9. Reproduserbarheten og repeterbarheten til disse modellene er imidlertid fortsatt utfordrende. Videre resulterer håndtering, høsting, overføring og sentrifugering av disse strukturene med dagens teknologi i tap eller skade på organoider og sfæroider under mange forhold, noe som påvirker resultatene betydelig.

Til tross for mange protokoller for histologisk farging, immunhistokjemisk farging, immunfluorescensmerking og kryopreservering, er det ingen universell tilnærming knyttet til standardisering av eksperimentelle forhold, håndtering og behandling av disse delikate strukturer uten å miste eller skade dem. Nåværende protokoller er også utrolig lange, vekslende fra noen dager til flere uker, og inkluderer komplekse prosedyrer med forskjellige reagenser 10,11,12,13,14. I tillegg forårsaker høsting, pipettering, sentrifugering og overføring av 3D-voksende strukturer mellom cellekulturbeholdere og kryovialer endringer i posisjoneringen av strukturer og mekaniske krefter, og til slutt påvirker differensiering og modning av organoider og sfæroider. Det har blitt rapportert at vevstopologi, posisjonering av cellene og mekaniske krefter betydelig påvirker celledifferensiering og modning 6,15,16,17.

Derfor er det ønskelig å forbedre dagens konvensjonelle teknologier for å generere organoider og sfæroider med stabil kvalitet. En metode / enhet som vil hoppe over sentrifugering og andre trinn beskrevet ovenfor og gi materialet i et enkelt trygt miljø fra begynnelsen til slutten av de mange prosessene, vil være gunstig for å nå de mest konsistente og pålitelige dataene. I tillegg vil dette redusere tids-, arbeids- og kostnadsbegrensninger.
Multifunksjonsenheten (MD) beskrevet her gir et enkelt trygt miljø for flere prosesser av organoider og sfæroider (supplerende figur 1). Denne enheten og komplementeringsprotokollene eliminerer høstings-, pipetterings-, overførings- og sentrifugeringstrinnene. Organoider og sfæroider forblir i deres in vitro-miljø under sekvensielle prosesser. Dette miljøet består hovedsakelig av naturlige eller syntetiske ekstracellulære matrikskomponenter, som kommersielt tilgjengelige hydrogeler. Med andre ord, metodene beskrevet her tillater en helmontert prøve av organoider / sfæroider som skal behandles, undersøkes og fryses mens de fortsatt er i en hydrogeldråpe.
Den biokompatible enheten er motstandsdyktig mot temperaturer mellom 60 ° C og -160 ° C, noe som gjør det mulig å gjenopprette organoider / steroider i en flytende nitrogentank ved -160 ° C eller å forberede harpiksblokker for elektronmikroskopi ved 60 ° C. Nisjen i enheten er designet for å definere en begrenset plass for 3D-voksende strukturer og stimulere dannelsen av sfæroider eller organoider basert på tidligere studier 18,19,20,21,22,23. Den delen av enheten er gjennomsiktig og inneholder en spesifikk plast som gir høy optisk kvalitet (brytningsindeks: 1,43; abbeverdi: 58; tykkelse: 7,8 mil [0,0078 tommer eller 198 μm]). Både nisje og den omkringliggende "side" -delen forårsaker autofluorescens. Den gjennomsiktige nisje i midten har et 80 mm 2 område, mens sidedelen er 600 mm2. Beholderens dybde er 15 mm, og tykkelsen er 1,5 mm. Disse funksjonene, i tillegg til størrelsen og utformingen av enheten, gjør det mulig å gjøre observasjoner under ulike typer høyteknologisk mikroskop og forberede prøvene for elektronmikroskopiske undersøkelser (figur 2). Lukkesystemet til enheten gir to posisjoner, en forseglet i fryseren og den andre tillater gasstrøm i inkubatoren. CCK8-proliferasjons- og cytotoksisitetsanalyser viser lignende effekter på celler sammenlignet med de tradisjonelle cellekulturrettene (supplerende figur 2). Trypan blå eksklusjonstest viser høy celle levedyktighet (94%) under cellekulturen i MD (figur 3).
Prosessene som kan utføres for en prøve i den enkelte enheten omfatter (1) dyrking, (2) histologisk farging, (3) immunostaining, inkludert immunhistokjemisk og immunfluorescensmerking, (4) frysing, (5) tining, (6) undersøkelse under optiske mikroskoper, for eksempel brightfield, darkfield, fluorescens, konfokale og superoppløsningsmikroskoper, (7) belegg og undersøkelse direkte under et skanningelektronmikroskop, eller (8) forberedelse til transmisjonselektronmikroskopi ( Figur 2).
Ulike metoder finnes for histologisk farging, immunhistokjemisk merking eller fluorescerende merking av organoider og sfæroider 10,11,12,13,14,24,25. Høsting av dem fra hydrogelen er det første og viktigste trinnet i dagens teknologi. Etter dette trinnet tillater noen metoder helmontert immunmerking. De høstede organoider er innebygd i paraffin, seksjonert og merket for farging og immunostaining i andre. Seksjonene kan imidlertid ikke presentere hele prøven og gir bare begrensede data relatert til 3D-arkitekturen til strukturen. Videre er skade på disse 3D-strukturene og tap av antigenisitet velkjente bivirkninger av disse teknologiene.
De komplementerende nye protokollene for mikroskopiske undersøkelser i denne artikkelen tillater en analyse av hele monteringsprøver som fortsatt er i en hydrogel. Protokollene som er beskrevet her inkluderer to nyutviklede formuleringer: løsning for immunhistokjemi (S-IHC) og løsning for immunfluorescensmerking (S-IF). Metodene med disse løsningene gjør det mulig for forskere å få mer nøyaktige data, siden det ikke er noen skadelige effekter av tradisjonelle arbeidsflyter, for eksempel sentrifugering, pipettering og overføring av de delikate strukturene. Protokollen beskrevet her eliminerer også behovet for høsting, blokkering, rydding og antigeninnhentingstrinn, og forkorter hele prosedyren til 6-8 timer. Videre tillater metodikken samtidig å legge til ett til tre antistoffer til samme S-IF. Derfor er det mulig å få resultatene samme dag selv etter de mange merkingseksperimentene, noe som er en annen fordel med protokollen beskrevet her; Tradisjonelle helmonterte immunfluorescensmerkingsprotokoller tar vanligvis mellom 3 dager og flere uker 10,11,12,13,14.
Parafininnbygging, et annet skadelig skritt som reduserer antigenitet, er også utelatt. 3D-strukturen forblir i sitt in vitro-miljø fra begynnelsen til slutten av den mikroskopiske undersøkelsen. Siden 3D-strukturen forblir i vekstforholdene, etterligner proteinuttrykks- og lokaliseringsdataene in vivo-forholdene bedre. Mer nøyaktige resultater forventes, siden metoden eliminerer trinnene som påvirker prøvens antigenuttrykk. Tabell 1 og tabell 2 viser hvordan disse nye protokollene eliminerer trinn, sparer tid og arbeidskraft i laboratoriet, og reduserer kostnader og avfallsprodukter sammenlignet med tradisjonelle arbeidsflyter.
I tillegg til de avgjørende trinnene som er beskrevet ovenfor, er et annet problem å gi et kryopreserveringsmedium og metode for å bevare 3D-strukturen til prøven med høyere celle levedyktighetshastigheter 26,27,28,29,30,31. Kryopreservering er avgjørende for å skape et stabilt modellsystem og muliggjøre biobanking av organoider og sfæroider32,33. Biobanking hele den opprinnelige 3D-strukturen vil muliggjøre en mer trofast rekapitulering av den naturlige tilstanden av helse eller sykdom. De viktigste hensynene er bekvemmeligheten og påliteligheten av kryopreservering og tining av organoider / sfæroider. Post-tine organoid utvinning er svært lav i de fleste nåværende teknologier, ofte mindre enn 50%. Nylige studier har imidlertid vist lovende resultater med forbedrede overlevelsesrater26,27,28,29. Lee og medarbeidere viste at 78% av sfæroidcellene overlevde etter kryopreservering når de brukte University of Wisconsin-løsningen som inneholdt 15% DMSO28. Celleoverlevelsesforholdet økte til 83% i studien av Arai et al.29. Resultatene etter kryopreservering påvirkes imidlertid betydelig siden 3D-strukturene ikke kan opprettholde de samme egenskapene og kvaliteten. I tillegg er serumfrie reagenser nødvendig for god produksjonspraksis i farmasøytiske og diagnostiske innstillinger. Tradisjonelle arbeidsflyter bruker et medium som inneholder føtalt bovint serum (FBS) og dimetylsulfoksid (DMSO) for langsom frysemetode, som begge er forbundet med handikap. FBS er et animalsk avledet produkt og kan ha batchvariasjoner. DMSO er et svært vellykket kryobeskyttende middel, men langvarig eksponering, spesielt under tining, kan forårsake cytotoksiske effekter30,31.
Denne artikkelen beskriver også fryse-/tinemetoden til hele organoider eller sfæroider mens de fortsatt er i en hydrogel. To formler for frysing av organoider og sfæroider brukes i studien: (1) 10 % DMSO som inneholder tradisjonell fryseløsning (FS) og (2) et serum- og DMSO-fritt kryopreserveringsmedium. Dette kryopreserveringsmediet inneholder ekstracellulære matrisekomponenter, som er forskjellige fra nåværende formler. Den ekstracellulære matrisen består av to hovedklasser av makromolekyler, proteoglykaner og fibrøse proteiner, som er essensielle for fysisk stillas for de cellulære bestanddelene, men også initierer prosesser som kreves for vevsmorfogenese, differensiering og homeostase 34,35,36,37,38,39,40 . Kollagener gir strekkfasthet, regulerer celleadhesjon, støtter kjemotaksis og migrasjon, og direkte vevsutvikling37. I tillegg gir elastinfibre rekyl til vev som gjennomgår gjentatt strekk38. Et tredje fibrøst protein, fibronektin, styrer organisasjonen av den interstitielle ekstracellulære matrisen og har en avgjørende rolle i å formidle cellefeste og fungerer som en ekstracellulær mekanoregulator39. Du og medarbeidere har vist den kryobeskyttende effekten av kyllingkollagenhydrolysat på det naturlige actomyosinmodellsystemet41. Resultatene deres tyder på at kollagenhydrolysat kan hemme iskrystallvekst, redusere proteinfrysedenaturering og oksidasjon på samme måte som kommersielle kryobeskyttende midler, og gi en bedre gelstruktur etter fryse-tine-sykluser. Derfor gir tilsetning av ekstracellulære matrikskomponenter til kryopreserveringsmediet et sikrere og beskyttende miljø for prøven og støtter de levende strukturene til å helbrede etter frysing-tining.
I tillegg beskriver denne studien en enkel protokoll for å merke cytoplasmatiske membraner og kjerner av levende organoider og sfæroider mens de fortsatt er i hydrogelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

Organoider og sfæroider, tredimensjonale voksende strukturer i cellekulturlaboratorier, blir stadig mer anerkjent som overlegne modeller sammenlignet med todimensjonale kulturmodeller, siden de etterligner menneskekroppen bedre og har fordeler i forhold til dyreforsøk. Imidlertid står disse studiene ofte overfor problemer med reproduserbarhet og konsistens. Under de lange eksperimentelle prosessene - med overføringer av organoider og sfæroider mellom forskjellige cellekulturbeholdere, pipettering og sentrifugering - blir disse følsomme og skjøre 3D-voksende strukturer ofte skadet eller tapt. Til syvende og sist påvirkes resultatene betydelig, siden 3D-strukturene ikke kan opprettholde de samme egenskapene og kvaliteten. Metodene beskrevet her minimerer disse stressende trinnene og sikrer et trygt og konsistent miljø for organoider og sfæroider gjennom hele behandlingssekvensen mens de fortsatt er i en hydrogel i en flerbruksenhet. Forskerne kan vokse, fryse, tine, behandle, flekke, merke og deretter undersøke strukturen til organoider eller sfæroider under ulike høyteknologiske instrumenter, fra konfokale til elektronmikroskoper, ved hjelp av en enkelt flerbruksenhet. Denne teknologien forbedrer studienes reproduserbarhet, pålitelighet og validitet, samtidig som den opprettholder et stabilt og beskyttende miljø for de 3D-voksende strukturene under prosessering. I tillegg minimerer eliminering av stressende tiltak håndteringsfeil, reduserer tiden som tas og reduserer risikoen for forurensning.

Denne artikkelen representerer en flerbruksenhet (MD) og komplementerende metoder for dyrking, frysing, tining, histologisk farging, immunhistokjemisk farging, immunfluorescensmerking, belegg og behandling av hele organoider eller sfæroider mens de fortsatt er i en hydrogel i et enkelt unikt designet miljø. Den nåværende studien ble designet for å forberede HepG2 leverkreft sfæroider i 35 hydrogeldråper i 35 MD. Eksperimenter ble utført i tre eksemplarer for å sikre nøyaktighet. I tillegg var lungeorganoider i ...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Denne studien beskriver metoder for dyrking, frysing, tining, prosessering, farging, merking og undersøkelse av hele sfæroider og organoider under forskjellige mikroskoper, mens de forblir intakte i en hydrogel i en flerbruksenhet.

Dyrking, frysing, prosessering og avbildning av hele organoider og sfæroider mens de fortsatt er i en hydrogel

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Organoider og sfæroider, som er svært skjøre, blir alvorlig skadet under håndtering. Protokollen vår sikrer at disse 3D-voksende strukturene forblir intakte under ulike prosesser, og øker dermed nøyaktigheten, reproduserbarheten, påliteligheten og repeterbarheten. Forskeren kan dyrke, fryse, tine, behandle, beise, merke og undersøke hele organoider og sfæroider under forskjellige mikroskoper mens de forblir intakte i en hydrogel i en enkelt flerbruksenhet.Det muliggjør opprettelse av en sykdomsmodell og sporing av sekvensielle trinn i en flerbruksenhet. Teknologien gir mer nøyaktighet når man undersøker biomarkører for diagnose og prognose av sykdommer. Denne metoden kan brukes på ethvert 3D-voksende system, inkludert organoider, sfæroider, individuelle celler eller levende organismer.For å starte organoid- eller sfæroidkulturen, plasser den riktig tinte hydrogelen på is inne i en laminær strømningshette i 15 minutter. Hold også røret som inneholder en pellet av hepatocellulært karsinom, eller HEPG2-celler, på is. Deretter plate 30 til 35 mikroliter 100% hydrogel innenfor nisjen til den forvarmede flerbruksenheten for å lage en geldråpe, plasser 10.000 HEPG2-celler i midten av toppen av hydrogeldråpen, og inkuberer oppsettet ved 37 grader Celsius i 15 minutter.Etter inkubering, dekk hydrogeldråpen med 200 mikroliter Dulbeccos modifiserte Eagle Medium, eller DMEM, som inneholder 10% føtalt bovint serum, eller FBS. Plasser lokket på enheten riktig, slik at gasstrømmen flyter, før du plasserer den i inkubatoren. Annenhver dag, mate cellene med 200 mikroliter DMEM som inneholder 10% FBS.Kontroller veksten av sfæroider under et omvendt mikroskop. Før du starter immunfluorescensmerking av organoider, varm opp de nødvendige mediene og løsningene til 37 grader Celsius. Aspirer cellekulturmediet som omgir hydrogeldråpen før du tilsetter 200 mikroliter 4% paraformaldehyd forvarmet til 37 grader Celsius og fikser det ved å plassere det i en inkubator ved 37 grader Celsius i 15 til 30 minutter.Deretter aspirerer fikseringsmiddelet og vasker løsningen for immunfluorescensmerking, eller SIF, forvarmet til 37 grader Celsius tre ganger i 10 minutter hver. Tilsett destillert vann til området rundt nisjen for å gi fuktighet før du fortsetter med de neste trinnene. Aspirer SIF-omgivelsen av hydrogeldråpen og tilsett 100 mikroliter av den forvarmede primære antistoffløsningen i SIF til hydrogelen før den inkuberes ved 37 grader Celsius i 30 til 60 minutter.Deretter aspirerer du den primære antistoffoppløsningen og vasker med SIF forvarmet til 37 grader Celsius tre ganger i 10 minutter hver. Etter vask, aspirer den gjenværende SIF og tilsett 100 mikroliter av den forvarmede sekundære antistoffoppløsningen i SIF til hydrogelen. Inkuber hydrogelen ved 37 grader Celsius i mørket i 30 til 60 minutter.Etter inkubasjonen, aspirer den sekundære antistoffoppløsningen og vask hydrogeldråpen med PBS ved 37 grader Celsius tre ganger i mørket i 10 minutter hver. Deretter aspirerer du gjenværende PBS og inkuberer hydrogelen med 100 mikroliter nukleær DNA-flekk som inneholder monteringsmedium eller glyserol ved 37 grader Celsius i mørket. Fyll nisje med glyserol for å unngå tørking før du lukker flerbruksanordningen som inneholder hydrogelen tett.For å undersøke organoider ved konfokal mikroskopi, still inn mikroskopparametrene etter instruksjonene gitt i manuskriptet. For å fryse organoider, aspirer cellekulturmediet, tilsett 200 mikroliter av den forvarmede fryseløsningen og inkuber prøven ved 37 grader Celsius i en time. Lukk lokket på enheten tett før du legger det i en skumboks.Legg denne skumboksen i en annen skumboks og lukk begge skumboksene tett. Hold boksen på minus 20 grader Celsius i to timer, og la den stå over natten i en minus 80 grader Celsius fryser. For å lagre organoider i mer enn seks måneder, fjern flerbruksanordningen som inneholder organoider fra boksene og overfør den til tanken med flytende nitrogen.For å tine organoider, ta ut flerbruksanordningen som inneholder prøven fra enten fryseren eller tanken med flytende nitrogen og legg den direkte inn i en inkubator ved 37 grader Celsius. Når den er tint, aspirer du forsiktig blandingen av medium og fryseløsning før du tilsetter friskt medium og fortsetter å avbilde hele organoidhydrogelen. I levende bilder ble de voksende organoider inne i hydrogelen synlige tre til fem dager etter innsetting av cellepelleten, spesielt i periferien av hydrogelkuppelen.Tidsserien av bilder på forskjellige nivåer av en hydrogel som inneholder sfæroider under et omvendt fasekontrastmikroskop er vist her. Konfokale mikroskopibilder av de helmonterte levende organoidene etter levende farging av cellemembranen og kjernen viste lignende merketetthet i periferien og midten. Videre kan immunfluorescensmerkingen av de helmonterte steroider utføres med ett antistoff, to antistoffer, samt tre antistoffer, og eliminerer behovet for ytterligere behandlingstrinn.Den representative analysen viser to immunfluorescerende merkede luftveisorganoider i en enhet. SEM-bilder av hele sfæroider i flerbruksenheten og 10 bilder av seksjonerte steroider indikerte godt bevart 3D-arkitektur av sfæroider, cytoplasmatiske organeller og andre ultrastrukturelle cellulære egenskaper, som demonstrerte effektiviteten av den beskrevne protokollen. Uregelmessigheter ved grensene til hydrogelkuppelen var tydelig etter frysing av prøvene.Imidlertid forblir størrelsen og rundheten til sfæroidene lik. Cellemigrasjon på kulturoverflaten ble observert etter tining av de frosne prøvene. Teknikken er veldig enkel.Forskeren bør imidlertid være veldig forsiktig mens han aspirerer eller tilsetter væsker rundt hydrogeldråpen for å forhindre skade på prøven. Forskeren kan se på den samme prøven i en enkelt enhet ved hjelp av et høyteknologisk mikroskop og gjennomføre en korrelativ studie.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Dyrking av menneskelig Nasal Epitelceller på Air Flytende Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Tissue Triage og Frysing av modeller av Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Høy gjennomstrømming Bildeanalyse av Tumor Spheroids: Et brukervennlig program for å måle størrelsen på Spheroids automatisk og nøyaktig

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Høytrykks Frysing og Quick Freeze Bytte av plantemateriale for transmisjonselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kvantifisering av protein uttrykk og samlokalisering Bruke multiplekset Immuno-histokjemisk Farging og multispektrale bildebehandling

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Encellede oppløsning tredimensjonal avbildning av intakte organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D Culturing av organoider fra Intestinal Villi Epithelium Gjennomgår Dedifferentiation

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En plattform med høy gjennomstrømning for kultur og 3D-avbildning av organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...