Name: culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Vi är tacksamma mot Dale Mertes från University of Chicago för utarbetandet av diagram, till Dr. Mehmet Serif Aydin för hans tekniska support vid Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies och till Dr. Rana Kazemi från Maltepe University för redigering av manuskriptet.

1. Odla organoider och sfäroider
<ol><li>Placera hydrogelen på is över natten (i kylskåp eller kylrum) för att tina.</li>
	<li>Placera den kommersiellt tillgängliga multifunktionella enheten (MD; se materialtabell) i inkubatorn 1 dag före experimentet (37 ° C, 5% CO2) för att värma.</li>
	<li>Placera sterila breda pipettspetsar i kylen vid 4 °C. OBS: Steg 1.1-1.3 ska utföras på dag 0 och steg 1.4-1.11 ska utföras på dag 1.</li>
	<li>Lägg hydrogelen på is ...

MD, som kompletterar formuleringar och protokoll som beskrivs här, underlättar snabb och spontan 3D-tillväxt av organoider och sfäroider i en mer kontrollerad miljö och fortsätter experimentet under samma förhållanden. Provet stannar i samma miljö under hela processen, och nästan 100% av de 3D-växande arkitekturerna förblir intakta i behållaren. Detta förbättrar homogeniteten under de sekventiella experimenten och möjliggör en längre odlingsperiod. Dessutom minskar antalet steg under organoider och sfä...

Framtiden för cellforskning och terapi ligger inom 3D-cellkulturerna 1,2,3. Organoid- och sfäroidmodeller stänger klyftan mellan in vitro-experiment och djurmodeller genom att skapa bättre modeller som efterliknar människokroppens utveckling, fysiologi och sjukdomar 4,5,6,7,8,9. Reproducerbarheten och repeterbarheten hos dessa modeller är dock fortfarande utmanande. Dessutom resulterar hantering, skörd, överföring och centrifugering av dessa strukturer med nuvarande teknik i förlust eller skada på organoider och sfäroider under många förhållanden, vilket väsentligt påverkar resultaten.

Trots många protokoll för histologisk färgning, immunohistokemisk färgning, immunofluorescensmärkning och kryokonservering finns det inget universellt tillvägagångssätt relaterat till standardisering av experimentella förhållanden, hantering och bearbetning av dessa känsliga strukturer utan att förlora eller skada dem. Nuvarande protokoll är också otroligt långa, alternerande från några dagar till flera veckor, och inkluderar komplexa procedurer med olika reagenser 10,11,12,13,14. Dessutom orsakar skörd, pipettering, centrifugering och överföring av 3D-växande strukturer mellan cellodlingskärl och kryovialer förändringar i placeringen av strukturerna och mekaniska krafter och påverkar i slutändan differentieringen och mognaden av organoiderna och sfäroiderna. Det har rapporterats att vävnadstopologi, positionering av cellerna och mekaniska krafter signifikant påverkar celldifferentiering och mognad 6,15,16,17.

Därför är det önskvärt att förbättra den nuvarande konventionella tekniken för att generera organoider och sfäroider med stabil kvalitet. En metod / enhet som hoppar över centrifugeringen och andra steg som beskrivs ovan och tillhandahåller materialet i en enda säker miljö från början till slutet av de flera processerna skulle vara fördelaktigt för att nå de mest konsekventa och tillförlitliga uppgifterna. Dessutom kommer detta att minska tids-, arbets- och kostnadsbegränsningarna.
Den multifunktionella enheten (MD) som beskrivs här ger en enda säker miljö för flera processer av organoider och sfäroider (kompletterande figur 1). Denna enhet och kompletterande protokoll eliminerar skörde-, pipettering-, överförings- och centrifugeringsstegen. Organoiderna och sfäroiderna förblir i sin in vitro-miljö under sekventiella processer. Denna miljö består huvudsakligen av naturliga eller syntetiska extracellulära matriskomponenter, som kommersiellt tillgängliga hydrogeler. Med andra ord tillåter de metoder som beskrivs här att ett helmonterat prov av organoider / sfäroider bearbetas, undersöks och fryses medan det fortfarande är i en hydrogeldroppe.
Den biokompatibla enheten är resistent mot temperaturer mellan 60 °C och -160 °C, vilket gör det möjligt att återställa organoiderna/steroiderna i en behållare för flytande kväve vid -160 °C eller att förbereda hartsblock för elektronmikroskopi vid 60 °C. Nischen i enheten har utformats för att definiera ett begränsat utrymme för 3D-växande strukturer och stimulera bildandet av sfäroider eller organoider baserat på tidigare studier 18,19,20,21,22,23. Den delen av enheten är transparent och innehåller en specifik plast som ger hög optisk kvalitet (brytningsindex: 1,43; abbe-värde: 58; tjocklek: 7,8 mil [0,0078 tum eller 198 μm]). Både nischen och den omgivande "sidodelen" orsakar autofluorescens. Den transparenta nischen i mitten har ett område på 80 mm 2, medan sidodelen är 600 mm2. Behållarens djup är 15 mm och tjockleken är 1,5 mm. Dessa funktioner, förutom enhetens storlek och design, gör det möjligt att göra observationer under olika typer av högteknologiska mikroskop och förbereda proverna för elektronmikroskopiska undersökningar (Figur 2). Anordningens stängningssystem ger två lägen, en förseglad i frysen och den andra tillåter gasflöde i inkubatorn. CCK8-proliferations- och cytotoxicitetsanalyser visar liknande effekter på celler jämfört med de traditionella cellodlingsskålarna (kompletterande figur 2). Trypan blå uteslutningstest visar hög cellviabilitet (94%) under cellodlingen i MD (Figur 3).
De processer som kan utföras för ett prov i den enda anordningen innefattar (1) odling, (2) histologisk färgning, (3) immunfärgning, inklusive immunohistokemisk och immunofluorescensmärkning, (4) frysning, (5) upptining, (6) undersökning under optiska mikroskop, såsom ljusfält, mörkfält, fluorescens, konfokala och superupplösta mikroskop, (7) beläggning och undersökning direkt under ett svepelektronmikroskop, eller (8) förberedelse för transmissionselektronmikroskopi ( Figur 2).
Olika metoder finns för histologisk färgning, immunohistokemisk märkning eller fluorescerande märkning av organoider och sfäroider 10,11,12,13,14,24,25. Att skörda dem från hydrogelen är det första och viktigaste steget i den nuvarande tekniken. Efter detta steg tillåter vissa metoder helmonterad immunmärkning. De skördade organoiderna är inbäddade i paraffin, sektionerade och märkta för färgning och immunfärgning i andra. Avsnitten kanske dock inte presenterar hela urvalet och ger endast begränsade data relaterade till strukturens 3D-arkitektur. Dessutom är skador på dessa 3D-strukturer och förlust av antigenicitet välkända biverkningar av dessa tekniker.
De kompletterande nya protokollen för mikroskopiska undersökningar i denna artikel möjliggör en analys av helmonterade prover som fortfarande finns i en hydrogel. Protokollen som beskrivs här inkluderar två nyutvecklade formuleringar: lösning för immunhistokemi (S-IHC) och lösning för immunofluorescensmärkning (S-IF). Metoderna med dessa lösningar gör det möjligt för forskare att få mer exakta data, eftersom det inte finns några skadliga effekter av traditionella arbetsflöden, såsom centrifugering, pipettering och överföring av de känsliga strukturerna. Protokollet som beskrivs här eliminerar också behovet av skörd, blockering, röjning och antigenhämtningssteg och förkortar hela proceduren till 6-8 timmar. Dessutom tillåter metoden att samtidigt lägga till en till tre antikroppar till samma S-IF. Därför är det möjligt att få resultaten samma dag även efter de flera märkningsexperimenten, vilket är en annan fördel med protokollet som beskrivs här; Traditionella helmonterade immunofluorescensmärkningsprotokoll tar vanligtvis mellan 3 dagar och flera veckor 10,11,12,13,14.
Paraffinbäddning, ett annat skadligt steg som minskar antigeniciteten, utelämnas också. 3D-strukturen förblir i sin in vitro-miljö från början till slutet av den mikroskopiska undersökningen. Eftersom 3D-strukturen förblir i sina odlingsförhållanden efterliknar proteinuttrycks- och lokaliseringsdata in vivo-förhållanden bättre. Mer exakta resultat förväntas, eftersom metoden eliminerar stegen som påverkar provets antigenuttryck. Tabell 1 och tabell 2 visar hur dessa nya protokoll eliminerar steg, sparar tid och arbete i labbet och minskar kostnader och avfallsprodukter jämfört med traditionella arbetsflöden.
Förutom de avgörande stegen som beskrivs ovan är ett annat problem att tillhandahålla ett kryokonserveringsmedium och metod för att bevara provets 3D-struktur med högre cellviabilitetshastigheter 26,27,28,29,30,31. Kryokonservering är avgörande för att skapa ett stabilt modellsystem och möjliggöra biobankning av organoider och sfäroider32,33. Biobanking hela den ursprungliga 3D-strukturen möjliggör en mer trogen rekapitulation av det naturliga hälsotillståndet eller sjukdomen. De viktigaste övervägandena är bekvämligheten och tillförlitligheten hos kryokonservering och upptining av organoider / sfäroider. Organisk oidåtervinning efter upptining är mycket låg i de flesta nuvarande tekniker, ofta mindre än 50%. Nya studier har dock visat lovande resultat med förbättrad överlevnad26,27,28,29. visade att 78% av sfäroidcellerna överlevde efter kryokonservering när de använde University of Wisconsin-lösningen innehållande 15% DMSO28. Cellöverlevnadsförhållandet ökade till 83% i studien av Arai et al.29. Resultaten efter kryokonservering påverkas dock avsevärt eftersom 3D-strukturerna inte kan bibehålla samma egenskaper och kvalitet. Dessutom krävs serumfria reagenser för god tillverkningssed i farmaceutiska och diagnostiska miljöer. Traditionella arbetsflöden använder ett medium som innehåller fetalt bovint serum (FBS) och dimetylsulfoxid (DMSO) för långsam frysningsmetod, som båda är förknippade med handikapp. FBS är en animalisk produkt och kan ha batchvariationer. DMSO är ett mycket framgångsrikt kryoskyddande medel, men långvarig exponering, särskilt under upptining, kan orsaka cytotoxiska effekter30,31.
Denna artikel beskriver också frysnings- / upptiningsmetoden för hela organoider eller sfäroider medan de fortfarande är i en hydrogel. Två formler för frysning av organoider och sfäroider används i studien: (1) 10% DMSO innehållande traditionell fryslösning (FS) och (2) ett serum- och DMSO-fritt kryokonserveringsmedium. Detta kryokonserveringsmedium innehåller extracellulära matriskomponenter, som skiljer sig från nuvarande formler. Den extracellulära matrisen består av två huvudklasser av makromolekyler, proteoglykaner och fibrösa proteiner, som är väsentliga för fysisk byggnadsställning för de cellulära beståndsdelarna, men initierar också processer som krävs för vävnadsmorfogenes, differentiering och homeostas 34,35,36,37,38,39,40 . Kollagener ger draghållfasthet, reglerar celladhesion, stöder kemotaxi och migration och direkt vävnadsutveckling37. Dessutom ger elastinfibrer rekyl till vävnader som genomgår upprepad stretch38. Ett tredje fibröst protein, fibronektin, styr organisationen av den interstitiella extracellulära matrisen och har en avgörande roll för att förmedla cellfästning och fungerar som en extracellulär mekanoregulator39. har visat den kryoskyddande effekten av kycklingkollagenhydrolysat på det naturliga aktomyosinmodellsystemet41. Deras resultat tyder på att kollagenhydrolysat kan hämma iskristalltillväxt, minska proteinfrysning-denaturering och oxidation på samma sätt som kommersiella kryoskyddande medel och ge en bättre gelstruktur efter frys-tina cykler. Att lägga till extracellulära matriskomponenter till kryokonserveringsmediet ger därför en säkrare och skyddande miljö för provet och stöder de levande strukturerna att läka efter frysning-upptining.
Dessutom beskriver den aktuella studien ett enkelt protokoll för att märka cytoplasmatiska membran och kärnor av levande organoider och sfäroider medan de fortfarande finns i hydrogelen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

Organoider och sfäroider, tredimensionella odlingsstrukturer i cellodlingslaboratorier, blir alltmer erkända som överlägsna modeller jämfört med tvådimensionella odlingsmodeller, eftersom de efterliknar människokroppen bättre och har fördelar jämfört med djurstudier. Dessa studier står dock ofta inför problem med reproducerbarhet och konsistens. Under de långa experimentella processerna - med överföringar av organoider och sfäroider mellan olika cellodlingskärl, pipettering och centrifugering - skadas eller förloras ofta dessa mottagliga och ömtåliga 3D-växande strukturer. I slutändan påverkas resultaten avsevärt, eftersom 3D-strukturerna inte kan bibehålla samma egenskaper och kvalitet. Metoderna som beskrivs här minimerar dessa stressiga steg och säkerställer en säker och konsekvent miljö för organoider och sfäroider under hela bearbetningssekvensen medan de fortfarande befinner sig i en hydrogel i en mångsidig enhet. Forskarna kan växa, frysa, tina, bearbeta, fläcka, märka och sedan undersöka strukturen hos organoider eller sfäroider under olika högteknologiska instrument, från konfokala till elektronmikroskop, med hjälp av en enda mångsidig enhet. Denna teknik förbättrar studiernas reproducerbarhet, tillförlitlighet och validitet, samtidigt som en stabil och skyddande miljö för 3D-odlingsstrukturerna under bearbetningen upprätthålls. Dessutom minimerar eliminering av stressiga steg hanteringsfel, minskar tidsåtgången och minskar risken för kontaminering.

Denna artikel representerar en mångsidig enhet (MD) och kompletterar metoder för odling, frysning, upptining, histologisk färgning, immunohistokemisk färgning, immunofluorescensmärkning, beläggning och bearbetning av hela organoider eller sfäroider medan de fortfarande är i en hydrogel i en enda unikt utformad miljö. Den aktuella studien var utformad för att förbereda HepG2 levercancersfäroider i 35 hydrogeldroppar i 35 MD. Experiment utfördes i tre exemplar för att säkerställa noggrannhet. Dessutom var l...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Den aktuella studien beskriver metoder för odling, frysning, upptining, bearbetning, färgning, märkning och undersökning av hela sfäroider och organoider under olika mikroskop, medan de förblir intakta i en hydrogel i en mångsidig enhet.

Odling, frysning, bearbetning och avbildning av hela organoider och sfäroider medan de fortfarande är i en hydrogel

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Organoider och sfäroider, som är mycket bräckliga, skadas allvarligt under hantering. Vårt protokoll säkerställer att dessa 3D-odlingsstrukturer förblir intakta under olika processer, vilket ökar noggrannheten, reproducerbarheten, tillförlitligheten och repeterbarheten. Forskaren kan odla, frysa, tina, bearbeta, fläcka, märka och undersöka hela organoider och sfäroider under olika mikroskop medan de förblir intakta i en hydrogel inom en enda multifunktionsenhet.Det gör det möjligt att skapa en sjukdomsmodell och spåra sekventiella steg i en multifunktionsenhet. Tekniken ger mer noggrannhet vid undersökning av biomarkörer för diagnos och prognos av sjukdomar. Denna metod kan tillämpas på alla 3D-odlingssystem, inklusive organoider, sfäroider, enskilda celler eller levande organismer.För att börja organoid- eller sfäroidkulturen, placera den ordentligt tinade hydrogelen på is inuti en laminär flödeshuv i 15 minuter. Håll också röret som innehåller en pellet av hepatocellulärt karcinom, eller HEPG2-celler, på is. Därefter platta 30 till 35 mikroliter 100% hydrogel inom nischen hos den förvärmda mångsidiga anordningen för att skapa en geldroppe, placera 10 000 HEPG2-celler i mitten av toppen av hydrogeldroppen och inkubera installationen vid 37 grader Celsius i 15 minuter.Efter inkubation, täck hydrogeldroppen med 200 mikroliter Dulbeccos modifierade Eagle Medium, eller DMEM, innehållande 10% fetalt bovint serum eller FBS. Placera locket på enheten ordentligt, så att gasflödet kan flöda, innan du placerar det i inkubatorn. Varannan dag, mata cellerna med 200 mikroliter DMEM som innehåller 10% FBS.Kontrollera tillväxten av sfäroiderna under ett inverterat mikroskop. Innan du börjar immunofluorescensmärkning av organoiderna, värm upp det önskade mediet och lösningarna till 37 grader Celsius. Aspirera cellodlingsmediet som omger hydrogeldroppen innan du tillsätter 200 mikroliter 4% paraformaldehyd förvärmd till 37 grader Celsius och fixa den genom att placera den i en inkubator vid 37 grader Celsius i 15 till 30 minuter.Aspirera sedan fixeringsmedlet och tvätta lösningen för immunofluorescensmärkning, eller SIF, förvärmd till 37 grader Celsius tre gånger i 10 minuter vardera. Tillsätt destillerat vatten till området kring nischen för att ge fuktighet innan du fortsätter med nästa steg. Aspirera SIF som omger hydrogeldroppen och tillsätt 100 mikroliter av den förvärmda primära antikroppslösningen i SIF till hydrogelen innan den inkuberas vid 37 grader Celsius i 30 till 60 minuter.Aspirera sedan den primära antikroppslösningen och tvätta med SIF förvärmd till 37 grader Celsius tre gånger i 10 minuter vardera. Efter tvätten, aspirera den återstående SIF och tillsätt 100 mikroliter av den förvärmda sekundära antikroppslösningen i SIF till hydrogelen. Inkubera hydrogelen vid 37 grader Celsius i mörkret i 30 till 60 minuter.Efter inkubationen, aspirera den sekundära antikroppslösningen och tvätta hydrogeldroppen med PBS vid 37 grader Celsius tre gånger i mörkret i 10 minuter vardera. Därefter aspirera den återstående PBS och inkubera hydrogelen med 100 mikroliter kärn-DNA-fläck innehållande monteringsmedium eller glycerol vid 37 grader Celsius i mörkret. Fyll nischen med glycerol för att undvika torkning innan du stänger multifunktionsanordningen som innehåller hydrogelen ordentligt.För att undersöka organoiderna med konfokalmikroskopi, ställ in mikroskopparametrarna enligt instruktionerna i manuskriptet. För att frysa organoiderna, aspirera cellodlingsmediet, tillsätt 200 mikroliter av den förvärmda fryslösningen och inkubera provet vid 37 grader Celsius i en timme. Stäng locket på enheten ordentligt innan du placerar det i en skumlåda.Placera denna skumlåda i en annan skumlåda och stäng båda skumlådorna tätt. Håll lådan vid minus 20 grader Celsius i två timmar och lämna den sedan över natten i en frys på minus 80 grader Celsius. För att lagra organoiderna längre än sex månader, ta bort multifunktionsanordningen som innehåller organoiderna från lådorna och överför den till tanken på flytande kväve.För att tina organoiderna, ta ut multifunktionsanordningen som innehåller provet från antingen frysen eller tanken på flytande kväve och placera den direkt i en inkubator vid 37 grader Celsius. När du har tinat, aspirera försiktigt medie- och fryslösningsblandningen innan du tillsätter nytt medium och fortsätter att avbilda den helmonterade organoidhydrogelen. Vid levande avbildning blev de växande organoiderna inuti hydrogelen synliga tre till fem dagar efter att cellpelleten sattes in, särskilt i periferin av hydrogelkupolen.Tidsserien av bilder på olika nivåer av en hydrogel innehållande sfäroider under ett inverterat faskontrastmikroskop visas här. Konfokalmikroskopibilder av de helmonterade levande organoiderna efter levande färgning av cellmembranet och kärnan visade liknande märkningstäthet i periferin och mitten. Vidare kan immunofluorescensmärkningen av de helmonterade steroiderna framgångsrikt utföras med en antikropp, två antikroppar samt tre antikroppar, vilket eliminerar behovet av ytterligare behandlingssteg.Den representativa analysen visar två immunofluorescerande märkta luftvägsorganoider i en enhet. SEM-bilder av hela sfäroiderna i multifunktionsanordningen och 10 bilder av sektionerade steroider indikerade välbevarad 3D-arkitektur av sfäroider, cytoplasmatiska organeller och andra ultrastrukturella cellulära egenskaper, vilket visar effektiviteten hos det beskrivna protokollet. Oregelbundenhet vid gränserna för hydrogelkupolen var uppenbar efter frysning av proverna.Sfäroidernas storlek och rundhet förblev emellertid liknande. Cellmigration på odlingsytan observerades efter upptining av de frusna proverna. Tekniken är väldigt enkel.Forskaren bör dock vara mycket försiktig när han aspirerar eller tillsätter vätskor som omger hydrogeldroppen för att förhindra att provet skadas. Forskaren kan titta på samma prov i en enda enhet med hjälp av ett högteknologiskt mikroskop och genomföra en korrelativ studie.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Frysning Mänskliga ES-celler

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Flash Frysning och Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Odling av Human Nasal epitelceller på Air Liquid Interface

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Vävnads Triage och frysning efter Modeller av skelettmuskulatur Sjukdom

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Hög kapacitet bildanalys av tumör spheroids: Ett användarvänligt program för att mäta storleken på sfäroider automatiskt och korrekt

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Högtrycks Frysning och Quick Freeze Substitution av växtvävnad för transmissionselektronmikroskopi

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kvantifiering av proteinuttryck och samlokalisering Använda Multiplex Immuno-histokemisk färgning och multispektrala

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Single-Cell Resolution Tredimensionell avbildning av intakta organoider

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D-odling av organoider från intestinala Villi Epitel som genomgår dedifferentiering

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En plattform med hög kapacitet för odling och 3D-avbildning av organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...