Name: culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Diyagramların hazırlanması için Chicago Üniversitesi'nden Dale Mertes'e, İstanbul Medipol Üniversitesi Sağlık Bilimleri ve Teknolojileri Araştırma Enstitüsü'ndeki teknik desteği için Dr. Mehmet Serif Aydın'a ve makalenin editörlüğünü yaptığı için Maltepe Üniversitesi'nden Dr. Rana Kazemi'ye minnettarız.

1. Organoidlerin ve sferoidlerin kültürlenmesi
<ol><li>Çözülmesi için hidrojeli gece boyunca (buzdolabında veya soğuk bir odada) buzun üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Ticari olarak temin edilebilen çok amaçlı cihazı (MD; bakınız Malzeme Tablosu) deneyden 1 gün önce (37 °C, %5 CO2) inkübatöre ısıtın.</li>
	<li>Steril geniş uçlu pipet uçlarını buzdolabına 4 °C'de yerleştirin. NOT: Adım 1.1-1.3 0. Günde, 1.4-1.11 adımları ise 1. Gün gerçe...

Burada açıklanan formülasyonları ve protokolleri tamamlayan MD, organoidlerin ve sferoidlerin daha kontrollü bir ortamda hızlı ve spontan 3D büyümesini kolaylaştırır ve deneyi aynı koşullarda sürdürür. Numune tüm süreç boyunca aynı ortamda kalır ve 3B büyüyen mimarilerin yaklaşık %100'ü konteynerde bozulmadan kalır. Bu, sıralı deneyler sırasında homojenliği arttırır ve uzun bir kültür periyoduna izin verir. Ek olarak, organoidler ve küresel işleme sırasındaki adımların sayısı,...

Hücre araştırması ve tedavisinin geleceği, 3D hücre kültürleri 1,2,3'te yatmaktadır. Organoid ve sferoid modeller, insan vücudu gelişimini, fizyolojisini ve hastalıklarını taklit eden daha iyi modeller oluşturarak in vitro deneyler ve hayvan modelleri arasındaki boşluğu kapatır 4,5,6,7,8,9. Bununla birlikte, bu modellerin tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği zorlu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, bu yapıların mevcut teknolojilerle taşınması, toplanması, aktarılması ve santrifüjlenmesi, organoidlerin ve sferoidlerin birçok koşulda kaybolmasına veya hasar görmesine neden olur ve sonuçları önemli ölçüde etkiler.

Histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme ve kriyoprezervasyon için birçok protokole rağmen, deneysel koşulların standartlaştırılması, bu hassas yapıların kaybedilmeden veya zarar görmeden ele alınması ve işlenmesi ile ilgili evrensel bir yaklaşım yoktur. Mevcut protokoller de inanılmaz derecede uzundur, birkaç günden birkaç haftaya kadar değişmektedir ve çeşitli reaktiflerle karmaşık prosedürler içermektedir10,11,12,13,14. Ek olarak, hücre kültürü damarları ve kriyovyaller arasında 3D büyüyen yapıların toplanması, pipetlenmesi, santrifüjlenmesi ve aktarılması, yapıların ve mekanik kuvvetlerin konumlandırılmasında değişikliklere neden olur ve sonuçta organoidlerin ve sferoidlerin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkiler. Doku topolojisinin, hücrelerin konumlandırılmasının ve mekanik kuvvetlerin hücre farklılaşmasını ve olgunlaşmasını önemli ölçüde etkilediği bildirilmiştir 6,15,16,17.

Bu nedenle, istikrarlı kalitede organoidler ve sferoidler üretmek için mevcut geleneksel teknolojilerin geliştirilmesi arzu edilir. Santrifüjleme ve yukarıda açıklanan diğer adımları atlayacak ve çoklu proseslerin başından sonuna kadar malzemeyi tek bir güvenli ortamda sağlayacak bir yöntem/cihaz, en tutarlı ve güvenilir verilere ulaşmak için faydalı olacaktır. Ek olarak, bu zaman, işçilik ve maliyet kısıtlamalarını azaltacaktır.
Burada açıklanan çok amaçlı cihaz (MD), organoidlerin ve sferoidlerin çoklu işlemleri için tek bir güvenli ortam sağlar (Ek Şekil 1). Bu cihaz ve tamamlayıcı protokoller hasat, pipetleme, aktarma ve santrifüj adımlarını ortadan kaldırır. Organoidler ve sferoidler, sıralı süreçler sırasında in vitro ortamlarında kalırlar. Bu ortam esas olarak ticari olarak temin edilebilen hidrojeller gibi doğal veya sentetik hücre dışı matris bileşenlerini içerir. Başka bir deyişle, burada açıklanan yöntemler, bir hidrojel damlası halindeyken bütün monte edilmiş bir organoid / sferoid örneğinin işlenmesine, incelenmesine ve dondurulmasına izin verir.
Biyouyumlu cihaz, 60 °C ile -160 °C arasındaki sıcaklıklara dayanıklıdır, bu da organoidlerin / steroidlerin -160 ° C'de bir sıvı azot tankına geri yüklenmesini veya 60 ° C'de elektron mikroskobu için reçine bloklarının hazırlanmasını mümkün kılar. Cihazdaki niş, 3D büyüyen yapılar için sınırlı bir alan tanımlamak ve önceki çalışmalara dayanarak sferoidlerin veya organoidlerin oluşumunu teşvik etmek için tasarlanmıştır 18,19,20,21,22,23. Cihazın bu kısmı şeffaftır ve yüksek optik kalite sağlayan belirli bir plastik içerir (kırılma indisi: 1.43; abbe değeri: 58; kalınlık: 7.8 mil [0.0078 in veya 198 μm]). Hem niş hem de çevresindeki 'yan' kısım otofloresana neden olur. Merkezdeki şeffaf niş 80 mm 2 alana sahipken, yan kısım 600 mm2'dir. Kabın derinliği 15 mm'dir ve kalınlığı 1,5 mm'dir. Bu özellikler, cihazın büyüklüğüne ve tasarımına ek olarak, farklı tipte yüksek teknolojili mikroskoplar altında gözlemler yapmayı ve numunelerin elektron mikroskobik incelemeleri için hazırlanmasını mümkün kılmaktadır (Şekil 2). Cihazın kapatma sistemi, biri dondurucuda kapatılmış, diğeri inkübatörde gaz akışına izin veren iki konum sağlar. CCK8 proliferasyonu ve sitotoksisite testleri, geleneksel hücre kültürü yemeklerine kıyasla hücreler üzerinde benzer etkiler göstermektedir (Ek Şekil 2). Tripan mavisi dışlama testi, MD'deki hücre kültürü sırasında yüksek hücre canlılığını (% 94) göstermektedir (Şekil 3).
Tek bir cihazda bir numune için gerçekleştirilebilecek işlemler arasında (1) kültürleme, (2) histolojik boyama, (3) immünohistokimyasal ve immünofloresan etiketleme dahil immünoboyama, (4) dondurma, (5) çözülme, (6) parlak alan, karanlık alan, floresan, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskoplar gibi optik mikroskoplar altında inceleme, (7) doğrudan taramalı elektron mikroskobu altında kaplama ve inceleme veya (8) iletim elektron mikroskobu için hazırlık ( Şekil 2).
Histolojik boyama, immünohistokimyasal etiketleme veya organoidleri ve sferoidleri floresan olarak etiketlemek için farklı metodolojiler mevcuttur 10,11,12,13,14,24,25. Onları hidrojelden toplamak, mevcut teknolojinin ilk ve ana adımıdır. Bu adımdan sonra, bazı yöntemler bütüne monte immüno-etiketlemeye izin verir. Hasat edilen organoidler parafine gömülür, bölümlere ayrılır ve diğerlerinde boyama ve immün boyama için etiketlenir. Ancak, bölümler tüm örneği sunmayabilir ve yapının 3B mimarisiyle ilgili yalnızca sınırlı veriler sağlayabilir. Ayrıca, bu 3D yapılara verilen hasar ve antijenite kaybı, bu teknolojilerin iyi bilinen yan etkileridir.
Bu makaledeki mikroskobik incelemeler için tamamlayıcı yeni protokoller, hala bir hidrojel içinde bulunan bütün montajlı numunelerin analizine izin vermektedir. Burada açıklanan protokoller yeni geliştirilen iki formülasyonu içermektedir: immünohistokimya çözeltisi (S-IHC) ve immünofloresan etiketleme için çözelti (S-IF). Bu çözümlere sahip yöntemler, araştırmacıların daha doğru veriler elde etmelerini sağlar, çünkü santrifüjleme, pipetleme ve hassas yapıların aktarılması gibi geleneksel iş akışlarının zararlı etkileri yoktur. Burada açıklanan protokol ayrıca hasat, blokaj, temizleme ve antijen alma adımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve tüm prosedürü 6-8 saate kısaltır. Ayrıca, metodoloji aynı S-IF'ye aynı anda bir ila üç antikor eklenmesine izin verir. Bu nedenle, burada açıklanan protokolün bir başka avantajı olan çoklu etiketleme deneylerinden sonra bile sonuçları aynı gün içinde elde etmek mümkündür; Geleneksel tam montajlı immünofloresan etiketleme protokolleri tipik olarak 3 gün ile birkaç hafta arasında sürer 10,11,12,13,14.
Antijeniteyi azaltan bir başka zararlı adım olan parafin gömme de ihmal edilir. 3D yapı, mikroskobik incelemenin başından sonuna kadar in vitro ortamında kalır. 3D yapı büyüme koşullarında kaldığından, protein ekspresyonu ve lokalizasyon verileri in vivo koşulları daha iyi taklit eder. Metodoloji, numunenin antijen ekspresyonunu etkileyen adımları ortadan kaldırdığı için daha doğru sonuçlar beklenmektedir. Tablo 1 ve Tablo 2, bu yeni protokollerin geleneksel iş akışlarına kıyasla adımları nasıl ortadan kaldırdığını, laboratuvarda zamandan ve iş gücünden nasıl tasarruf ettiğini ve maliyetleri ve atık ürünleri nasıl azalttığını göstermektedir. 
Yukarıda açıklanan önemli adımlara ek olarak, başka bir sorun, numunenin 3D yapısını daha yüksek hücre canlılık oranları 26,27,28,29,30,31 ile korumak için bir kriyoprezervasyon ortamı ve yöntemi sağlamaktır. Kriyoprezervasyon, stabil bir model sistemi oluşturmak ve organoidlerin ve sferoidlerin biyobankacılığını sağlamak için gereklidir32,33. Biyobankacılığın tüm orijinal 3D yapısı, doğal sağlık veya hastalık durumunun daha sadık bir şekilde özetlenmesine izin verecektir. Kriyoprezervasyonun kolaylığı ve güvenilirliği ve organoidlerin/sferoidlerin çözülmesi en önemli hususlardır. Çözülme sonrası organoid iyileşmesi çoğu güncel teknolojide çok düşüktür, genellikle% 50'den azdır. Bununla birlikte, son çalışmalar26,27,28,29 sağkalım oranlarının artmasıyla umut verici sonuçlar göstermiştir. Lee ve ark., % 15 DMSO 28 içeren Wisconsin Üniversitesi solüsyonunu kullandıklarında sferoid hücrelerin%78'inin kriyoprezervasyondan sonra hayatta kaldığını göstermiştir. Arai ve ark.29'un çalışmasında hücre sağkalım oranı% 83'e yükselmiştir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyon sonrası sonuçlar, 3D yapılar aynı özellikleri ve kaliteyi koruyamadığından önemli ölçüde etkilenir. Ek olarak, farmasötik ve teşhis ortamlarında iyi üretim uygulamaları için serumsuz reaktifler gereklidir. Geleneksel iş akışları, yavaş dondurma yöntemi için fetal sığır serumu (FBS) ve dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir ortam kullanır ve her ikisi de handikaplarla ilişkilidir. FBS, hayvansal kaynaklı bir üründür ve parti varyasyonlarına sahip olabilir. DMSO çok başarılı bir kriyoprotektandır, ancak özellikle çözülme sırasında uzun süreli maruz kalma sitotoksik etkilere neden olabilir30,31.
Bu makalede ayrıca, hala bir hidrojel halindeyken tüm organoidlerin veya sferoidlerin donma / çözülme metodolojisi açıklanmaktadır. Çalışmada organoidlerin ve sferoidlerin dondurulması için iki formül kullanılmıştır: (1) geleneksel dondurma çözeltisi (FS) içeren% 10 DMSO ve (2) serum ve DMSO içermeyen bir kriyoprezervasyon ortamı. Bu kriyoprezervasyon ortamı, mevcut formüllerden farklı olan hücre dışı matris bileşenleri içerir. Hücre dışı matris, hücresel bileşenler için fiziksel iskele için gerekli olan iki ana makromolekül sınıfı, proteoglikanlar ve lifli proteinlerden oluşur, ancak aynı zamanda doku morfogenezi, farklılaşma ve homeostaz için gerekli süreçleri başlatır 34,35,36,37,38,39,40 . Kollajenler gerilme mukavemeti sağlar, hücre yapışmasını düzenler, kemotaksisi ve migrasyonu destekler ve doku gelişimini yönlendirir37. Ek olarak, elastin lifleri, tekrarlanan gerilme38'e maruz kalan dokulara geri tepme sağlar. Üçüncü bir fibröz protein olan fibronektin, interstisyel hücre dışı matriksin organizasyonunu yönlendirir ve hücre bağlanmasına aracılık etmede çok önemli bir role sahiptir ve hücre dışı bir mekano-düzenleyici olarak işlev görür39. Du ve ark. tavuk kollajen hidrolizatının doğal aktomiyozin model sistemi41 üzerindeki kriyoprotektif etkisini göstermiştir. Sonuçları, kollajen hidrolizatının buz kristali büyümesini inhibe edebileceğini, ticari kriyoprotektanlara benzer şekilde protein dondurucu-denatürasyonunu ve oksidasyonunu azaltabileceğini ve donma-çözülme döngülerinden sonra daha iyi bir jel yapısı sağlayabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, kriyoprezervasyon ortamına hücre dışı matriks bileşenlerinin eklenmesi, numune için daha güvenli ve koruyucu bir ortam sağlar ve donma-çözülme sonrası canlı yapıların iyileşmesini destekler.
Ek olarak, bu çalışma, canlı organoidlerin ve sferoidlerin sitoplazmik membranlarını ve çekirdeklerini hala hidrojel içindeyken etiketlemek için basit bir protokol tanımlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8187602500</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>8222512500</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst&#160; in Hank&#39;s balanced salt solution (HBSS) &#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I34406</td>
			<td>Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CP 028 A</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-albumin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>EPR20195</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>134435</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>53121</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>ACI 3058 A, B</td>
			<td>Store at +4 &#176;C, Dilution: 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>Dissolve in Karnovsky&#39;s fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab228554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 15 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>601051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 50 mL&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>EN12469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>KM-CC17RU2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper Grids</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>G100-Cu</td>
			<td>Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical Point Dryer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM CPD300</td>
			<td>For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB/AEC chromogen solution mixture &#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AEC101</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond knife</td>
			<td>Diatome</td>
			<td>Ultra 45&#176;, 40-US</td>
			<td>Use for ultra-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide for molecular biology</td>
			<td>Biofroxx</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Plastic Pasteur Pippettes</td>
			<td>Nest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Solution Alcoholic</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-105-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epon resin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>45359-1EA-F</td>
			<td>Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier</td>
			<td>Pan Biotech</td>
			<td>P30-3304</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing Solution (FS)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-F</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife maker</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM KMR3</td>
			<td>For make glass knives in 8 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>7890-08</td>
			<td>Use for ultra- or semi-thin sections for TEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16210</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Store at -20 C, Dilution :1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32933</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35502</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84540</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35552</td>
			<td>Store at +4 &#176;C,&#160; Dilution :1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>84541</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin Harris&#160;</td>
			<td>Bright Slide</td>
			<td>2.BS01-104-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-8065</td>
			<td>Store in nitrogen tank</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>A1413201</td>
			<td>Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogel</td>
			<td>Biotechne, R&#38;D Systems</td>
			<td>BME001-01</td>
			<td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Karnovsky&#39;s fixative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM &#38; SEM samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Aspartic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11189-100G</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead aspartate solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 &#176;C and adjust pH to 5; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17900</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Confocal Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Biotek Synergy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multipurpose Device (MD)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3569</td>
			<td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear-DNA stain</td>
			<td>ThermoFischer Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>DAPI solution, Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide (OsO4) ,4%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19190</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 &#176;C and in airtight container; protect light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ov6 antibody</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>MAB2020</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td>Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>2810305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post-fixative solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>%2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>26603-01</td>
			<td>Store at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Item no.: 491206-0001-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Nest</td>
			<td>620611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning Electron Microscopy with STEM attachment</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>GeminiSEM 500</td>
			<td>We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td>
			<td>ScyTek Laboratories</td>
			<td>SHP125</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11655</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9]</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX22871</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-IF</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution for Immunohistochemistry (S-IHC)</td>
			<td>Cellorama</td>
			<td>CellO-P</td>
			<td>Store at +4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen trimming device</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM TRIM2</td>
			<td>For prepare epon sample block to ultramicrotome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputter coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM ACE200</td>
			<td>Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide (TCH)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223220-5G</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; store at RT; prepare fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra gel super glue</td>
			<td>Pattex</td>
			<td>PSG2C</td>
			<td>For glue polymerized epon block with sample to holder epon block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td>For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 10 &#181;L</td>
			<td>Nest</td>
			<td>171215-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 1000 &#181;L</td>
			<td>Isolab</td>
			<td>L-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Pipette Tips, 200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Nest</td>
			<td>110919HA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400</td>
			<td>Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 &#181;m membrane filter; keep tightly closed container store at RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing, freezing, processing, and imaging of entire organoids and spheroids while still in a hydrogel

Hücre kültürü laboratuvarlarında üç boyutlu büyüyen yapılar olan organoidler ve sferoidler, insan vücudunu daha iyi taklit ettikleri ve hayvan çalışmalarına göre avantajlara sahip oldukları için iki boyutlu kültür modellerine kıyasla daha üstün modeller olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar genellikle tekrarlanabilirlik ve tutarlılık ile ilgili sorunlarla karşı karşıyadır. Uzun deneysel süreçler sırasında - organoidlerin ve sferoidlerin farklı hücre kültürü damarları arasında transferi, pipetleme ve santrifüjleme ile - bu hassas ve kırılgan 3D büyüyen yapılar genellikle hasar görür veya kaybolur. Sonuçta, sonuçlar önemli ölçüde etkilenir, çünkü 3D yapılar aynı özellikleri ve kaliteyi koruyamaz. Burada açıklanan yöntemler, bu stresli adımları en aza indirir ve çok amaçlı bir cihazda hala bir hidrojel içindeyken, işleme dizisi boyunca organoidler ve sferoidler için güvenli ve tutarlı bir ortam sağlar. Araştırmacılar, tek bir çok amaçlı cihaz kullanarak organoidlerin veya sferoidlerin yapısını konfokalden elektron mikroskoplarına kadar çeşitli yüksek teknoloji ürünü aletler altında büyütebilir, dondurabilir, çözebilir, işleyebilir, lekeleyebilir, etiketleyebilir ve daha sonra inceleyebilirler. Bu teknoloji, çalışmaların tekrarlanabilirliğini, güvenilirliğini ve geçerliliğini geliştirirken, işleme sırasında 3D büyüyen yapılar için istikrarlı ve koruyucu bir ortam sağlar. Ek olarak, stresli adımları ortadan kaldırmak taşıma hatalarını en aza indirir, alınan süreyi azaltır ve kontaminasyon riskini azaltır.

Bu makale, çok amaçlı bir cihazı (MD) ve kültürleme, dondurma, çözme, histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme, kaplama ve tüm organoidlerin veya sferoidlerin işlenmesi için metodolojileri tamamlayan metodolojileri benzersiz bir şekilde tasarlanmış tek bir ortamda bir hidrojel içinde temsil etmektedir. Mevcut çalışma, 35 MD'de 35 hidrojel damlasında HepG2 karaciğer kanseri sferoidlerini hazırlamak için tasarlanmıştır. Ek olarak, MD'lerdeki akciğer organoidleri, ...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel at JoVE.com

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Bu çalışma, çok amaçlı bir cihaz içindeki bir hidrojelde bozulmadan kalırken, tüm sferoidlerin ve organoidlerin çeşitli mikroskoplar altında kültürlenmesi, dondurulması, çözülmesi, işlenmesi, boyanması, etiketlenmesi ve incelenmesi için metodolojileri açıklamaktadır.

Tüm Organoidlerin ve Sferoidlerin Hala Bir Hidrojel İçinde Kültürlenmesi, Dondurulması, İşlenmesi ve Görüntülenmesi

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Çok kırılgan olan organoidler ve sferoidler, kullanım sırasında ciddi şekilde hasar görürler. Protokolümüz, bu 3B büyüyen yapıların çeşitli süreçler sırasında bozulmadan kalmasını sağlar, böylece doğruluğu, tekrarlanabilirliği, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği artırır. Araştırmacı, tek bir çok amaçlı cihaz içinde bir hidrojelde bozulmadan kalırken, tüm organoidleri ve sferoidleri çeşitli mikroskoplar altında kültürleyebilir, dondurabilir, çözebilir, işleyebilir, boyayabilir ve inceleyebilir.Bir hastalık modelinin oluşturulmasını ve sıralı adımların çok amaçlı tek bir cihazda izlenmesini sağlar. Teknoloji, hastalıkların teşhisi ve prognozu için biyobelirteçleri incelerken daha fazla doğruluk sağlar. Bu yöntem, organoidler, sferoidler, bireysel hücreler veya canlı organizmalar dahil olmak üzere herhangi bir 3D yetiştirme sistemine uygulanabilir.Organoid veya küresel kültüre başlamak için, düzgün çözülmüş hidrojeli 15 dakika boyunca laminer bir akış başlığı içindeki buz üzerine yerleştirin. Ayrıca, hepatosellüler karsinomun veya HEPG2 hücrelerinin bir peletini içeren tüpü buz üzerinde tutun. Daha sonra, bir jel damlası oluşturmak için önceden ısıtılmış çok amaçlı cihazın nişi içinde 30 ila 35 mikrolitre% 100 hidrojel plakası, hidrojel damlasının tepesinin ortasına 10.000 HEPG2 hücresi yerleştirin ve kurulumu 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, hidrojel damlasını% 10 fetal sığır serumu veya FBS içeren 200 mikrolitre Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı veya DMEM ile örtün. Kapağı, inkübatöre yerleştirmeden önce gaz akışına izin vererek cihaza düzgün bir şekilde yerleştirin. Her gün, hücreleri% 10 FBS içeren 200 mikrolitre DMEM ile besleyin.Sferoidlerin büyümesini ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin. Organoidlerin immünofloresan etiketlemesine başlamadan önce, gerekli ortamı ve çözeltileri 37 santigrat dereceye ısıtın. 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit eklemeden önce hidrojel damlasını çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin ve 15 ila 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirerek sabitleyin.Daha sonra, fiksatifi aspire edin ve immünofloresan etiketleme veya SIF, her biri 10 dakika boyunca üç kez 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış çözeltiyi yıkayın. Sonraki adımlara geçmeden önce nem sağlamak için nişi çevreleyen alana damıtılmış su ekleyin. Hidrojel damlasını çevreleyen SIF'yi aspire edin ve 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce SIF'deki önceden ısıtılmış birincil antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini hidrojele ekleyin.Daha sonra, birincil antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 10 dakika boyunca üç kez 37 santigrat dereceye ısıtılmış SIF ile yıkayın. Yıkamayı takiben, kalan SIF'yi aspire edin ve SIF'deki önceden ısıtılmış sekonder antikor çözeltisinin 100 mikrolitresini hidrojele ekleyin. Hidrojeli karanlıkta 30 ila 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra, ikincil antikor çözeltisini aspire edin ve hidrojel damlasını PBS ile karanlıkta her biri 10 dakika boyunca üç kez 37 santigrat derecede yıkayın. Daha sonra, artık PBS'yi aspire edin ve hidrojeli, karanlıkta 37 santigrat derecede montaj ortamı veya gliserol içeren 100 mikrolitre nükleer DNA boyası ile inkübe edin. Hidrojeli içeren çok amaçlı cihazı sıkıca kapatmadan önce kurumasını önlemek için nişi gliserol ile doldurun.Organoidleri konfokal mikroskopi ile incelemek için, makalede verilen talimatları izleyerek mikroskop parametrelerini ayarlayın. Organoidleri dondurmak için, hücre kültürü ortamını aspire edin, önceden ısıtılmış dondurma çözeltisinden 200 mikrolitre ekleyin ve numuneyi bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir köpük kutunun içine yerleştirmeden önce cihazın kapağını sıkıca kapatın.Bu köpük kutusunu başka bir köpük kutuya yerleştirin ve her iki köpük kutusunu da sıkıca kapatın. Kutuyu iki saat boyunca eksi 20 santigrat derecede tutun, ardından gece boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucuda bırakın. Organoidleri altı aydan daha uzun süre saklamak için, organoidleri içeren çok amaçlı cihazı kutulardan çıkarın ve sıvı azot tankına aktarın.Organoidleri çözmek için, numuneyi içeren çok amaçlı cihazı dondurucudan veya sıvı azot tankından çıkarın ve doğrudan 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Çözüldükten sonra, taze ortam eklemeden ve tüm montajlı organoid hidrojeli görüntülemeye devam etmeden önce ortamı ve dondurucu çözelti karışımını nazikçe aspire edin. Canlı görüntülemede, hidrojel içindeki büyüyen organoidler, hücre peletinin yerleştirilmesinden üç ila beş gün sonra, özellikle hidrojel kubbesinin çevresinde, görünür hale geldi.Ters faz kontrast mikroskobu altında sferoidler içeren bir hidrojelin farklı seviyelerindeki görüntülerin zaman serisi burada gösterilmiştir. Hücre zarını ve çekirdeği canlı boyadıktan sonra tüm montajlı canlı organoidlerin konfokal mikroskopi görüntüleri, çevre ve merkezde benzer etiketleme yoğunluğu göstermiştir. Ayrıca, tüm monte steroidlerin immünofloresan etiketlemesi, bir antikor, iki antikor ve üç antikor ile başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir ve ek tedavi adımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır.Temsili analiz, bir cihazdaki iki immünofloresan etiketli hava yolu organoidini göstermektedir. Çok amaçlı cihazdaki tüm sferoidlerin SEM görüntüleri ve kesitli steroidlerin 10 görüntüsü, açıklanan protokolün etkinliğini gösteren, sferoidlerin, sitoplazmik organellerin ve diğer ultra-yapısal hücresel özelliklerin iyi korunmuş 3D mimarisini göstermiştir. Hidrojel kubbenin sınırlarındaki düzensizlik, numunelerin dondurulmasından sonra belirgindi.Bununla birlikte, sferoidlerin büyüklüğü ve yuvarlaklığı benzer kalmıştır. Dondurulmuş örnekler çözüldükten sonra kültür yüzeyinde hücre göçü gözlendi. Teknik çok basittir.Bununla birlikte, araştırmacı, numunenin zarar görmesini önlemek için hidrojel damlasını çevreleyen sıvıları aspire ederken veya eklerken çok nazik olmalıdır. Araştırmacı, yüksek teknolojili bir mikroskop kullanarak aynı örneğe tek bir cihazda bakabilir ve bağıntılı bir çalışma yürütebilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Freezing Human ES Cells

Donma İnsan ES Hücreler

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Biyoloji

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

Flaş Dondurma ve E12.5 Fare Beyin Cryosectioning

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Doku Triyaj ve İskelet Kası Hastalıkları Modeller için Donma

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

Organoidlerin Bağırsak Villi Epitelinden 3D Kültasyonu Adanmışlık Geçiriyor

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Organoidlerin kültürü ve 3D görüntülenmesi için yüksek verimli bir platform

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...