Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

تم جمع عينات الورم البشري المستخدمة في مزارع الخلايا السرطانية الأولية وفقا للبروتوكولات المعتمدة من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في مركز رابين الطبي بموافقة خطية مستنيرة من المرضى. شمل المرضى المؤهلون للمشاركة في الدراسة مرضى سرطان البالغين والأطفال من الذكور والإناث المصابين بسرطان ال?...

<ol>
	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

يصف البروتوكول الحالي طريقة بسيطة لتوليد ثقافات الخلايا الأولية 3D (كروية) المستمدة من عينات الورم البشري. يمكن استخدام هذه الأجسام الكروية في تحليلات مختلفة ، بما في ذلك تقييم الأدوية المرشحة المحتملة ومجموعات الأدوية ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ، والتحقيق في ...

تمثل الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي مناهج تكميلية لتطوير علاجات السرطان. تسمح النماذج في المختبر بالتحكم في معظم المتغيرات التجريبية وتسهيل التحليلات الكمية. غالبا ما تكون بمثابة منصات فحص منخفضة التكلفة ويمكن استخدامها أيضا للدراسات الميكانيكية1. ومع ذلك ، فإن أهميتها البيولوجية محدودة بطبيعتها ، لأن هذه النماذج تعكس جزئيا فقط البيئة المكروية للورم1. في المقابل ، في النماذج في الجسم الحي ، مثل الطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) ، تلتقط تعقيد البيئة المكروية للورم وهي أكثر ملاءمة للدراسات الانتقالية والعلاج الفردي في المرضى (أي التحقيق في الاستجابة للأدوية في نموذج مشتق من مريض فردي)1. ومع ذلك ، فإن النماذج في الجسم الحي لا تفضي إلى مناهج عالية الإنتاجية لفحص الأدوية ، حيث لا يمكن التحكم في المعلمات التجريبية بإحكام كما هو الحال في النماذج المختبرية ولأن تطويرها يستغرق وقتا طويلا وكثيف العمالة ومكلفا 1,2.
تتوفر النماذج في المختبر منذ أكثر من 100 عام ، وكانت خطوط الخلايا متاحة لأكثر من 70 عاما3. ومع ذلك ، خلال العقود العديدة الماضية ، زاد تعقيد النماذج المتاحة في المختبر للأورام الصلبة بشكل كبير. يتراوح هذا التعقيد من نماذج الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) (الهياكل أحادية الطبقة) التي هي إما خطوط خلايا ثابتة مشتقة من الورم أو خطوط خلايا أولية إلى الأساليب الأحدث التي تتضمن نماذج ثلاثية الأبعاد (3D)1. ضمن نماذج 2D ، هناك تمييز رئيسي بين خطوط الخلايا الثابتة والأولية4. يتم تخليد خطوط الخلايا المنشأة. لذلك ، يمكن استخدام نفس خط الخلية على مستوى العالم على مدار سنوات عديدة ، مما يسهل التعاون وتراكم البيانات وتطوير العديد من استراتيجيات العلاج من منظور تاريخي. ومع ذلك ، تتراكم الانحرافات الجينية في خطوط الخلايا هذه مع كل مرور ، مما يضر بأهميتها البيولوجية. علاوة على ذلك ، فإن العدد المحدود من خطوط الخلايا المتاحة لا يعكس عدم تجانس الأورام في المرضى 4,5. يتم اشتقاق خطوط الخلايا السرطانية الأولية مباشرة من عينات الورم المقطوعة التي تم الحصول عليها عن طريق الخزعات أو الانصباب الجنبي أو الاستئصال. لذلك ، فإن خطوط الخلايا السرطانية الأولية أكثر أهمية من الناحية البيولوجية لأنها تحافظ على عناصر البيئة المكروية للورم وخصائص الورم ، مثل السلوكيات بين الخلايا (على سبيل المثال ، الحديث المتبادل بين الخلايا السليمة والسرطانية) والأنماط الظاهرية الشبيهة بالجذع للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، فإن القدرة المتماثلة لخطوط الخلايا الأولية محدودة ، مما يؤدي إلى ضيق وقت الثقافة ويحد من عدد الخلايا السرطانية التي يمكن استخدامها للتحليلات 4,5.
النماذج التي تستخدم ثقافات 3D أكثر صلة بيولوجيا من نماذج ثقافة 2D حيث يتم الاحتفاظ بالظروف في الجسم الحي. وبالتالي ، تحافظ نماذج ثقافة 3D على شكل الخلية الطبيعية ونموها وتكرار عناصر بيئة الورم ، مثل نقص الأكسجة والنخر والتصاق الخلايا. تشمل نماذج 3D الأكثر استخداما في أبحاث السرطان كرويات متعددة الخلايا ، وهياكل قائمة على السقالات ، وثقافات مدمجة في المصفوفة4،6،7.
يولد البروتوكول الحالي نماذج زراعة الورم 3D (كرويات متعددة الخلايا) من الخلايا السرطانية الأولية ويقيم حساسيتها للأدوية باستخدام نهجين متكاملين: مقايسة صلاحية الخلية (MTT) والفحوصات المجهرية. النتائج التمثيلية المعروضة هنا هي من سرطان الثدي والقولون. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع على أنواع الأورام الصلبة الأخرى (على سبيل المثال ، سرطان القنوات الصفراوية وسرطان المعدة والرئة والبنكرياس) وهو أيضا فعال من حيث التكلفة ، حيث يمكن إجراؤه بالكامل في مختبر نموذجي لأبحاث السرطان / بيولوجيا الخلية دون الاعتماد على معدات متخصصة. يمكن استخدام الأجسام الكروية متعددة الخلايا المتولدة باستخدام هذا النهج لتقييم الأدوية المرشحة المحتملة ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ، والتحقيق في آليات الاستجابة والمقاومة.
ينقسم هذا البروتوكول إلى ثلاثة أقسام: (1) توليد وجمع وعد الأجسام الكروية استعدادا لاستخدامها كنموذج لاختبار فعالية الدواء. (2) مقايسة MTT لتقييم فعالية الدواء على الأجسام الكروية ؛ و (3) التقييم المجهري للتغيرات المورفولوجية بعد علاج الأجسام الكروية بالأدوية كنهج آخر لتقييم فعالية الدواء (الشكل 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

على الرغم من التقدم الملحوظ في فهم بيولوجيا الورم ، فإن الغالبية العظمى من أدوية الأورام المرشحة التي تدخل التجارب السريرية تفشل ، غالبا بسبب نقص الفعالية السريرية. يسلط معدل الفشل المرتفع هذا الضوء على عدم قدرة النماذج قبل السريرية الحالية على التنبؤ بالفعالية السريرية ، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم كفايتها في عكس عدم تجانس الورم والبيئة المكروية للورم. يمكن معالجة هذه القيود من خلال نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) (كروية) التي تم إنشاؤها من عينات الورم البشري المشتقة من المرضى الفرديين. تمثل ثقافات 3D هذه بيولوجيا في العالم الحقيقي أفضل من خطوط الخلايا الراسخة التي لا تعكس عدم تجانس الورم. علاوة على ذلك ، تعد الثقافات ثلاثية الأبعاد أفضل من نماذج الثقافة ثنائية الأبعاد (2D) (هياكل أحادية الطبقة) لأنها تكرر عناصر بيئة الورم ، مثل نقص الأكسجة والنخر والتصاق الخلايا ، وتحافظ على شكل الخلية الطبيعية ونموها. في الدراسة الحالية ، تم تطوير طريقة لإعداد الثقافات الأولية للخلايا السرطانية من المرضى الفرديين الذين هم 3D وتنمو في كرويات متعددة الخلايا. يمكن اشتقاق الخلايا مباشرة من أورام المريض أو الطعوم الخارجية المشتقة من المريض. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الأورام الصلبة (مثل القولون والثدي والرئة) وهي أيضا فعالة من حيث التكلفة ، حيث يمكن إجراؤها بالكامل في مختبر نموذجي لأبحاث السرطان / بيولوجيا الخلية دون الاعتماد على معدات متخصصة. هنا ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد نماذج ثقافة الورم 3D (كرويات متعددة الخلايا) من الخلايا السرطانية الأولية وتقييم حساسيتها للأدوية باستخدام نهجين متكاملين: فحص صلاحية الخلية (MTT) والفحوصات المجهرية. يمكن استخدام هذه الكرويات متعددة الخلايا لتقييم الأدوية المرشحة المحتملة ، وتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ، والتحقيق في آليات الاستجابة والمقاومة.

يقدم هذا البروتوكول إجراءات لتوليد ثقافة متجانسة من الكائنات الكروية من الخلايا السرطانية الأولية ، وتقييم فعالية الدواء كميا على الثقافة الكروية (مقايسة MTT) ، وتحديد تأثير أدوية الدراسة على مورفولوجيا كروية. يتم تقديم بيانات من التجارب التمثيلية في الأجسام الكروية الناتجة عن مزارع خلاي...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

يصف البروتوكول الحالي توليد نماذج زراعة الورم 3D من الخلايا السرطانية الأولية وتقييم حساسيتها للأدوية باستخدام مقايسات صلاحية الخلية والفحوصات المجهرية.

إنشاء كرويات 3 الأبعاد من عينات الورم المشتقة من المريض وتقييم حساسيتها للأدوية

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

بروتوكولنا مهم لأنه يصف جيلا من نماذج زراعة الورم 3D من الخلايا السرطانية الأولية ، وهذا النموذج يمثل بيولوجيا الورم في العالم الحقيقي بشكل أفضل من خطوط الخلايا. هذا النهج ينطبق على مجموعة متنوعة من الأورام الصلبة. كما أنها فعالة من حيث التكلفة حيث يمكن إجراؤها من البداية إلى النهاية في مختبر بيولوجيا الخلية النموذجي.تدعم نماذج الورم 3D التي تم إنشاؤها باستخدام هذا النهج الأبحاث حول حساسية ومقاومة الأورام للعلاجات المضادة للسرطان أو مجموعة من العلاجات. هذا النهج يولد نماذج 3D من الخلايا السرطانية الأولية. لذلك ، يمكن أن يحدد العلاج الذي من المحتمل أن يكون فعالا لمريض معين وبالتالي يساعد في تخصيص علاجه.ستوضح العملية إيلا إسحاقي ، طالبة دكتوراه من مختبري. للبدء ، خذ دورق T25 صغير مع مزرعة خلية أولية ملتصقة بخلية واحدة وقم بإزالة وسائط زراعة الخلايا. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ، وأضف ملليلتر واحد من 1x Accutase لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية لإعداد تعليق خلية واحدة لمزارع الخلايا السرطانية الأولية الملتصقة من التقاء 75 إلى 100٪.تحييد محلول Accutase بإضافة خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا. نضح الخلايا مع ماصة مصلية 10 ملليلتر ، وإيداعها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 800 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.قم بإزالة وسط زراعة الخلايا ، وأضف ثمانية ملليلتر من وسط زراعة الخلايا الطازجة فوق حبيبات الخلية ، ثم اخلطها برفق. لحساب الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الدم ، خذ حصة من 50 ميكرولتر من تعليق الخلية واخلطها مع 50 ميكرولتر من تريبان الأزرق. ثم عد الخلايا الحية ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا الحية في التعليق.بعد ذلك ، قم بإعداد وسط ثقافة 3D. وبعد حساب عدد الخلايا اللازمة للفحص والحجم الكلي المطلوب ، قم بإعداد تعليق الخلية بالعدد المطلوب من الخلايا في 200 ميكرولتر من وسط الثقافة ثلاثي الأبعاد. امزج بلطف مع الماصة لضمان التوزيع المتجانس.انقل التعليق إلى خزان ماصة ، وأضف 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 96 بئرا منخفضة للغاية مع ماصة متعددة القنوات. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفرض تجمع الخلايا ، وبالتالي تحسين تجميع الخلايا ، واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون المرطب. بعد الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة 50٪ من الوسط برفق والتخلص منه ، وأضف 100 ميكرولتر من وسط الثقافة ثلاثي الأبعاد الطازج لاستبدال المحلول الحالي.كرر هذه الخطوة ، وضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة المرطبة بثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5٪. افحص الخلايا تحت المجهر كل يوم إلى يومين لمراقبة تكوين الكرة الأرضية. قم بقياس قطر الأجسام الكروية المتكونة باستخدام أداة المقياس في برنامج التصوير.وبمجرد أن يصل قطر الكرة إلى 100 إلى 200 ميكرومتر ، قم بإجراء تجارب فعالية الدواء. لجمع الكروية ، استخدم ماصة 1،000 ميكرولتر لجمع الأجسام الكروية من كل بئر ، وإيداعها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. قم بطرد الأنبوب المخروطي عند 300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بشفط المادة الطافية بعناية والتخلص منها باستخدام ماصة.أضف 0.5 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا ، وأعد تعليق الحبيبات جيدا ولكن برفق. لإجراء عد كروي ، استخدم لوحة 96 بئرا وارسم علامة زائد على الجانب السفلي من البئر لتقسيم البئر إلى أرباع. أضف 50 ميكرولترا من التعليق إلى البئر.وباستخدام عدسة موضوعية 10x ، عد الكرويات يدويا تحت المجهر. عد الكرويات في كل ربع ، واحسب العدد الإجمالي للكرويات في البئر. ثم احسب تركيز الكرة عن طريق مضاعفة عدد الكرويات عن طريق حساب الحجم ، وحساب العدد الإجمالي للكرويات في التعليق.في أنبوب جديد ، تحضير تعليق كروي بتركيز 200 كروي لكل 200 ميكرولتر من وسط زراعة الخلية. لكل علاج دوائي ، قم بإعداد مخزون الأجسام الكروية في أنبوب مختلف. احسب الكمية الإجمالية اللازمة لكل دواء بعدد الآبار اللازمة للتكرار ، وأضف الدواء إلى الأنبوب إلى التركيز النهائي المطلوب.انقل 200 ميكرولتر من التعليق الكروي إلى آبار صفيحة 96 بئرا منخفضة للغاية ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. بعد احتضان الأجسام الكروية بعقار الدراسة لمدة 24 إلى 72 ساعة ، قم بطرد اللوحة عند 300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة 170 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا برفق ، تاركا 30 ميكرولترا في قاع البئر. قم بإعداد محلول MTT ، وأضف 70 ميكرولترا من المحلول إلى كل بئر إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل بئر.سيكون تركيز MTT النهائي في البئر 0.05 ملليغرام لكل 100 ميكرولتر. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد الآبار الفارغة بمحلول MTT بدون خلايا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة ثلاث إلى أربع ساعات حتى يلاحظ تغير في لون المحلول في الآبار.عند ملاحظة تغيير ، أضف 100 ميكرولتر من محلول Stop إلى كل بئر ، وامزج محتوى الآبار برفق دون إنشاء فقاعات. اقرأ امتصاص اللوحة في قارئ ELISA المعلمة بطول موجي يبلغ 570 نانومتر وطول موجة خلفية من 630 إلى 690 نانومتر. لحساب صلاحية الخلية ، احسب الإشارة المحددة لكل بئر.ثم احسب متوسط قيمة الآبار الفارغة ، واطرح هذه القيمة من كل بئر. احسب متوسط الإشارات المحددة في آبار التحكم التي تحتوي على خلايا لم تتم معالجتها بعقار الدراسة. أخيرا ، احسب صلاحية الخلايا في كل بئر بالنسبة للآبار ذات الخلايا غير المعالجة.يظهر هنا تكوين كرويات من مزرعة خلايا سرطان القولون الأولية بمرور الوقت من خلال عدد الخلايا المصنفة في البداية. من هذا الشكل ، يمكن ملاحظة أن عدد الأجسام الكروية المتولدة يعتمد على عدد الخلايا التي تم زرعها في البداية في كل بئر. تظهر هنا كرويات من خلايا سرطان القولون الأولية بعد 10 أيام في الثقافة مع بذر أولي للخلايا يبلغ 2000 لكل بئر.عند الاستزراع المطول للكرويات السرطانية للقولون ، بدأوا في الالتصاق ببعضهم البعض وشكلوا مجموعات من الكرات والهياكل الشبيهة بالعنب التي منعت ثقافة متجانسة وبالتالي حظرت استخدام الكرويات في فحوصات MTT. تظهر هنا آثار palbociclib و sunitinib ومزيجهما على الأجسام الكروية من الخلايا السرطانية الأولية ، بما في ذلك سرطان القولون والثدي. تم إجراء اختبار MTT على كرويات مشتقة من خلايا سرطان القولون والثدي.تم تطبيع إشارات MTT إلى قيم من الخلايا المعالجة DMSO. تمثل القيم الوسائل من أربعة إلى ثمانية مكررات. كما تم تقييم آثار العلاجات المختلفة على نمو الخلايا مجهريا في اليوم صفر وبعد ثلاثة أيام من علاج الكرويات المشتقة من سرطان القولون وخلايا سرطان الثدي.يتم عرض آثار تراستوزوماب بالإضافة إلى فينوريلبين و 5 فلورويوراسيل بالإضافة إلى سيسبلاتين على كرويات مشتقة من سرطان الثدي بمرور الوقت في هذا الشكل. يظهر هنا التغير في قطر الأجسام الكروية بالنسبة لليوم صفر حسب مدة العلاج. تضمنت كل مجموعة معالجة أربعة إلى ستة آبار مع كروي واحد في كل بئر.يتم عرض متوسط التغيير هنا. تعتبر الأجسام الكروية أدوات مهمة للعديد من الدراسات التي تتجاوز الاستجابة للعلاج المضاد للسرطان. تتناول هذه الدراسات ، على سبيل المثال ، توصيل الأدوية وحتى أسئلة البيولوجيا الأساسية مثل تفاعلات الخلايا والخلايا.من الأهمية بمكان بدء عملية توليد كروية مع تعليق خلية واحدة. من المهم أيضا استخدام ألواح تثبيت منخفضة للغاية مع وسيط يحتوي على مقاييس غشاء أساسية بنسبة 5٪.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

وضع العلامات لسرطان الثدي Xenografts المستمدة من المريض مع يمكن عزوها مراسلون لنمو الأورام والدراسات الانبثاث

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

الكشف عن حساسية عالية من ميكروميتاستاسيس المتولدة عن التجارة والنقل ترانسدوسيد لينتيفيروس أورجانويدس مثقف من ورم القولون المستمدة من المريض

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

محاكاة والتلاعب في البنكرياس حؤول Acinar للأقنية في ثقافة الخلية 3 الأبعاد

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

نماذج Xenograft المتوارثية المستمدة من المريض لسرطان الخلايا البولية البشرية ونمو ورم سرطان القولون والمستقيم وورم الانبثاث العفوي

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

إنشاء وتوصيف الأمعاء العصبية الصغيرة ورم الغدد الصماء خزان

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

عالية الإنتاجية في المختبر المقايسة باستخدام الجهازيات الورم المستمدة من المريض

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...