Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
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用于原发性肿瘤细胞培养的人类肿瘤样本的收集是根据机构审查委员会（IRB）批准的方案在拉宾医疗中心进行的，并得到了患者的书面知情同意。有资格参与该研究的患者包括患有非转移性乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、神经内分泌癌、卵巢癌或胰腺癌、任何儿科癌症或任何转移性癌症的男性和女性成人和儿科癌症患者。唯一的排除标准是缺乏提供知情同意的能力。
1. ?...

<ol>
	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. 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本协议描述了一种从人类肿瘤样品中提取3D原代细胞培养物（球状体）的简单方法。这些微球可用于各种分析，包括评估潜在的候选药物和药物组合，识别潜在的生物标志物或治疗靶点，以及研究反应和耐药的机制。该方案使用直接来自患者样本的原代肿瘤细胞或来自PDX模型的肿瘤细胞，可以使用患者样本建立。后一种方法允许对相同的原发肿瘤进行 体外 和 体内 实验。PDX模型和源?...

体外 和 体内 研究代表了开发癌症治疗方法的补充方法。 体外 模型允许控制大多数实验变量并促进定量分析。它们通常用作低成本的筛选平台，也可用于机理研究1。然而，它们的生物学相关性本质上是有限的，因为这样的模型只能部分反映肿瘤微环境1。相比之下， 体内 模型，如患者来源的异种移植物（PDX），捕获了肿瘤微环境的复杂性，更适合于患者的转化研究和个体化治疗（即，在源自个体患者的模型中研究对药物的反应）1。然而， 体内 模型不利于药物筛选的高通量方法，因为实验参数不能像 体外 模型那样严格控制，并且它们的开发耗时、劳动密集型且成本高昂1，2.
体外模型已经有100多年的历史，细胞系已经有70多年的历史3。然而，在过去的几十年中，实体瘤体外模型的复杂性急剧增加。这种复杂性的范围从肿瘤衍生的已建立细胞系或原代细胞系的二维（2D）培养模型（单层结构）到涉及三维（3D）模型的最新方法1。在2D模型中，一个关键的区别是已建立的细胞系和原代细胞系之间的区别4。已建立的细胞系永生化;因此，同一细胞系可以在全球范围内使用多年，从历史的角度来看，这促进了协作、数据的积累和许多治疗策略的开发。然而，这些细胞系中的遗传畸变随着每次传代而积累，从而损害了它们的生物学相关性。此外，可用细胞系的数量有限并不能反映患者肿瘤的异质性4，5。原代癌细胞系直接来源于通过活检、胸腔积液或切除获得的切除肿瘤样本。因此，原代癌细胞系更具生物学相关性，因为它们保留了肿瘤微环境和肿瘤特征的元素，例如细胞间行为（例如，健康和癌细胞之间的串扰）和癌细胞的干细胞样表型。然而，原代细胞系的复制能力有限，这导致培养时间较窄，并限制了可用于分析的肿瘤细胞数量4，5。
使用3D培养物的模型比2D培养模型更具生物学相关性，因为保留了体内条件。因此，3D培养模型保留了天然细胞的形状和生长，并复制了肿瘤环境的元素，例如缺氧，坏死和细胞粘附。癌症研究中最常用的3D模型包括多细胞球状体，基于支架的结构和基质嵌入的培养物4，6，7。
本协议从原发癌细胞生成3D肿瘤培养模型（多细胞球状体），并使用两种互补方法评估其对药物的敏感性：细胞活力测定（MTT）和显微镜检查。本文介绍的代表性结果来自乳腺癌和结肠癌;然而，该方案广泛适用于其他实体瘤类型（例如，胆管癌，胃癌，肺癌和胰腺癌），并且也具有成本效益，因为它可以在典型的癌症研究/细胞生物学实验室中完整进行，而无需依赖专用设备。使用这种方法生成的多细胞微球可用于评估潜在的候选药物，识别潜在的生物标志物或治疗靶点，并研究反应和耐药的机制。
该协议分为三个部分：（1）微球的生成，收集和计数，以准备将其用作测试药物疗效的模型;（2）MTT测定以评估药物对球状体的疗效;（3）用药物治疗微球后形态变化的显微镜评估，作为评估药物疗效的另一种方法（图1）。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

尽管在理解肿瘤生物学方面取得了显着进展，但绝大多数进入临床试验的肿瘤候选药物都失败了，通常是由于缺乏临床疗效。这种高失败率说明了目前的临床前模型无法预测临床疗效，主要是因为它们在反映肿瘤异质性和肿瘤微环境方面存在不足。这些限制可以通过从个体患者身上的人类肿瘤样本建立的三维（3D）培养模型（球状体）来解决。这些3D培养物比不反映肿瘤异质性的已建立细胞系更能代表现实世界的生物学。此外，3D培养优于二维（2D）培养模型（单层结构），因为它们复制肿瘤环境的元素，如缺氧，坏死和细胞粘附，并保持天然细胞形状和生长。在本研究中，开发了一种用于制备来自个体患者的癌细胞原代培养物的方法，这些患者是3D的并在多细胞球状体中生长。这些细胞可以直接来源于患者肿瘤或患者来源的异种移植物。该方法广泛适用于实体瘤（例如结肠、乳腺癌和肺癌），并且还具有成本效益，因为它可以在典型的癌症研究/细胞生物学实验室中完整地进行，而无需依赖专用设备。本文提出了一种协议，用于从原代癌细胞生成3D肿瘤培养模型（多细胞球状体），并使用两种互补方法评估其对药物的敏感性：细胞活力测定（MTT）和显微镜检查。这些多细胞球体可用于评估潜在的候选药物，识别潜在的生物标志物或治疗靶点，并研究反应和耐药的机制。

该协议提出了从原代肿瘤细胞生成球状体均质培养物的程序，定量评估球状体培养的药物功效（MTT测定），并确定研究药物对球状体形态的影响。介绍了来自结肠和乳腺癌细胞培养物产生的球状体的代表性实验数据。使用其他肿瘤类型进行了类似的实验，包括胆管癌，胃癌，肺癌和胰腺癌（数据未显示）。本文介绍的所有实验一式三份进行。
图2 显示了...

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Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

本协议描述了从原代癌细胞生成3D肿瘤培养模型，并使用细胞活力测定和显微镜检查评估其对药物的敏感性。

从患者来源的肿瘤样本中建立三维微球并评估其对药物的敏感性

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

我们的协议意义重大，因为它描述了来自原发癌细胞的一代3D肿瘤培养模型，并且该模型比细胞系更能代表现实世界的肿瘤生物学。这种方法适用于多种实体瘤。它也具有成本效益，因为它可以在典型的细胞生物学实验室中从头到尾进行。使用这种方法生成的3D肿瘤模型支持肿瘤对抗癌疗法或联合疗法的敏感性和耐药性的研究。这种方法从原代癌细胞生成3D模型。因此，它可以确定哪种疗法可能对特定患者有效，从而帮助个性化他或她的治疗。演示该程序的将是我实验室的博士生Ella Itzhaki。首先，取一个装有单细胞贴壁原代细胞培养物的小T25烧瓶并取出细胞培养基。用PBS洗涤细胞，并在37摄氏度下加入一毫升1x Accutase三分钟，以制备75%至100%汇合的贴壁原发性肿瘤细胞培养物的单细胞悬液。通过加入五毫升细胞培养基来中和Accutase溶液。用10毫升血清移液管吸出细胞，并将其沉积在15毫升锥形管中。在室温下以800g离心管5分钟。取出细胞培养基，在细胞沉淀顶部加入8毫升新鲜细胞培养基，然后轻轻混合。要用血细胞计数器计数活细胞，取50微升细胞悬液的等分试样，并将其与50微升台盼蓝混合。然后计数活细胞，并计算悬浮液中活细胞的总数。接下来，准备3D培养基。在计算测定所需的细胞数量和所需的总体积后，在200微升的3D培养基中制备具有所需细胞数的细胞悬液。与移液器轻轻混合，以确保均匀分布。将悬浮液转移到移液槽中，并用多通道移液器将200微升细胞悬液添加到超低附着96孔板的每个孔中。在室温下以300g离心板10分钟以加强细胞的聚集，从而改善细胞聚集，并将板在37摄氏度下在5%二氧化碳加湿的培养箱中孵育。室温下再次以300g离心10分钟后，轻轻除去并丢弃50%的培养基，并加入100微升新鲜的3D培养基以取代现有溶液。重复此步骤，并将板放回37摄氏度和5%二氧化碳加湿的培养箱中。每隔一到两天在显微镜下检查细胞以监测球体形成。使用成像软件中的缩放工具测量形成的微球的直径。一旦球体直径达到100至200微米，进行药物功效实验。对于球状体收集，请使用 1， 000 微升移液管从每个孔中收集球体，并将它们沉积到 15 毫升锥形管中。在室温下以300g离心锥形管五分钟，然后小心地吸出并使用移液管弃去上清液。加入0.5毫升细胞培养基，并轻轻地重悬沉淀。要进行球体计数，请使用 96 孔板并在孔的底部绘制加号，将孔分成象限。向孔中加入50微升悬浮液。使用10倍物镜，在显微镜下手动计数微球。计算每个象限中的微球，并计算孔中的微球总数。然后通过计数体积将球体计数加倍来计算球体浓度，并计算悬浮液中的微球总数。在新管中，制备浓度为每200微升细胞培养基200个球状体的球状体悬浮液。对于每种药物治疗，在不同的管中制备球状体储备。通过重复所需的孔数计算每种药物所需的总量，并将药物添加到管中以达到所需的最终浓度。将200微升球状悬浮液转移到超低附着96孔板的孔中，并将板在37摄氏度下在5%二氧化碳加湿培养箱中孵育。将球状体与研究药物孵育24至72小时后，在室温下以300g离心板5分钟，轻轻除去170微升细胞培养基，在孔底部留下30微升。准备MTT溶液，并向每个孔中加入70微升溶液，最终体积为每孔100微升。井中的最终MTT浓度为每100微升0.05毫克。此外，用不含细胞的MTT溶液制备空白孔。将板在37摄氏度的5%二氧化碳加湿培养箱中孵育三至四个小时，直到观察到孔中溶液颜色的变化。当观察到变化时，向每个孔中加入100微升Stop溶液，并轻轻混合孔的内容物而不会产生气泡。在参数ELISA读数器中读取波长为570纳米，背景波长为630至690纳米的板的吸光度。要计算细胞活力，请计算每个孔的特定信号。然后计算空白孔的平均值，并从每个孔中减去该值。计算包含未用研究药物治疗的细胞的对照孔中特定信号的平均值。最后，计算每个孔中细胞相对于未处理细胞的孔的活力。此处显示了原代结肠癌细胞培养物通过初始接种细胞的数量随时间形成的球状体。从该图中可以看出，生成的球状体数量取决于最初接种在每个孔中的细胞数量。此处显示了培养10天后来自原代结肠癌细胞的球状体，初始细胞接种为每孔2， 000个。在结肠癌球体的长期培养后，它们开始相互附着并形成球状体和葡萄状结构的簇，这阻止了均质培养，因此禁止在MTT测定中使用球状体。这里显示了palbociclib，sunitinib及其组合对原发性肿瘤细胞（包括结肠癌和乳腺癌）球状体的影响。对源自结肠和乳腺癌细胞的微球进行了MTT测定。将MTT信号标准化为来自DMSO处理的细胞的值。这些值表示从 4 到 8 个仿行的均值。在零天和治疗来自结肠癌和乳腺癌细胞的球状体三天后，还显微镜下评估了各种处理对细胞生长的影响。曲妥珠单抗加长春瑞滨和5氟尿嘧啶加顺铂随时间推移对乳腺癌球状体的影响如图所示。此处显示了球体直径相对于治疗持续时间与零天的变化。每个处理组包括四到六个孔，每个孔中有一个球体。此处显示了平均变化。球状体是许多研究的重要工具，超越了抗癌治疗的反应。例如，这些研究解决了药物递送甚至细胞间相互作用等基本生物学问题。使用单细胞悬液开始球状体生成过程至关重要。使用含有 5% 碱性膜指标的介质的超低附着板也很重要。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

可追踪记者乳腺癌患者来源的移植瘤贴标肿瘤生长和转移的研究

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

科研

癌症研究

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

来自沙柯玛患者衍生异种移植物的肿瘤启动细胞的分离和表征

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

淋巴结慢病毒北疆-转基因 Organoids 培养的大鼠结肠肿瘤的高灵敏度检测

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

三维细胞培养中胰腺肌囊内增生的模拟与操纵

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

患者衍生的人类泌尿细胞癌和结肠直肠癌肿瘤生长和自发转移的正交异种移植模型

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

生理患者衍生的3D类血球体用于抗肿瘤药物筛选,以靶向癌症干细胞

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

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从3维球体培养中分离出类似干细胞的细胞

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Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

斑马鱼原发性患者衍生肿瘤异种移植物的药物筛选

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

使用患者源性肿瘤类器官的高通量 体外 检测

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...