Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Indsamlingen af humane tumorprøver, der blev anvendt til de primære tumorcellekulturer, blev udført i henhold til IRB-godkendte protokoller (Institutional Review Board) på Rabin Medical Center med skriftligt informeret samtykke fra patienterne. Patienter, der var egnede til at deltage i undersøgelsen, omfattede mandlige og kvindelige voksne og pædiatriske kræftpatienter med ikke-metastatisk bryst-, tyktarms-, lever-, lunge-, neuroendokrine, ovarie- eller bugspytkirtelkræft, enhver pædiatrisk kræft eller metasta...

<ol>
	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

Denne protokol beskriver en simpel metode til generering af 3D primære cellekulturer (sfæroider) afledt af humane tumorprøver. Disse sfæroider kan bruges til forskellige analyser, herunder evaluering af potentielle lægemiddelkandidater og lægemiddelkombinationer, identifikation af potentielle biomarkører eller terapeutiske mål og undersøgelse af mekanismerne for respons og resistens. Protokollen bruger enten primære tumorceller afledt direkte fra patientprøver eller tumorceller fra PDX-modeller, som kan etable...

In vitro- og in vivo-undersøgelser repræsenterer komplementære tilgange til udvikling af kræftbehandlinger. In vitro-modeller giver mulighed for kontrol af de fleste eksperimentelle variabler og letter kvantitative analyser. De fungerer ofte som billige screeningsplatforme og kan også bruges til mekanistiske undersøgelser1. Imidlertid er deres biologiske relevans i sagens natur begrænset, da sådanne modeller kun delvist afspejler tumormikromiljøet1. I modsætning hertil fanger in vivo-modeller, såsom patientafledte xenotransplantater (PDX), kompleksiteten af tumormikromiljøet og er mere egnede til translationelle undersøgelser og individualisering af behandling hos patienter (dvs. undersøgelse af respons på lægemidler i en model afledt af en individuel patient)1. In vivo-modeller er imidlertid ikke befordrende for high-throughput-tilgange til lægemiddelscreening, da de eksperimentelle parametre ikke kan kontrolleres så tæt som in vitro-modeller, og fordi deres udvikling er tidskrævende, arbejdskrævende og dyr 1,2.
In vitro-modeller har været tilgængelige i over 100 år, og cellelinjer har været tilgængelige i over 70 år3. I løbet af de sidste årtier er kompleksiteten af de tilgængelige in vitro-modeller af solide tumorer imidlertid steget dramatisk. Denne kompleksitet spænder fra 2-dimensionelle (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer), der enten er tumorafledte etablerede cellelinjer eller primære cellelinjer til de nyere tilgange, der involverer 3-dimensionelle (3D) modeller1. Inden for 2D-modellerne er en nøgleforskel mellem de etablerede og primære cellelinjer4. Etablerede cellelinjer er udødeliggjort; Derfor kan den samme cellelinje bruges globalt over mange år, hvilket fra et historisk perspektiv letter samarbejde, akkumulering af data og udvikling af mange behandlingsstrategier. Imidlertid akkumuleres genetiske aberrationer i disse cellelinjer med hver passage, hvilket kompromitterer deres biologiske relevans. Desuden afspejler det begrænsede antal tilgængelige cellelinjer ikke heterogeniteten af tumorer hos patienter 4,5. Primære kræftcellelinjer stammer direkte fra resekterede tumorprøver opnået via biopsier, pleurale effusioner eller resektioner. Derfor er primære kræftcellelinjer mere biologisk relevante, da de bevarer elementer i tumormikromiljøet og tumoregenskaber, såsom intercellulær adfærd (fx krydstale mellem sunde og kræftceller) og de stammelignende fænotyper af kræftceller. Imidlertid er den replikative kapacitet af primære cellelinjer begrænset, hvilket fører til en smal dyrkningstid og begrænser antallet af tumorceller, der kan bruges til analyser 4,5.
Modeller, der bruger 3D-kulturer, er mere biologisk relevante end 2D-kulturmodeller, da in vivo-betingelserne bevares. Således bevarer 3D-kulturmodeller den naturlige celleform og vækst og replikerer elementer i tumormiljøet, såsom hypoxi, nekrose og celleadhæsion. De mest almindeligt anvendte 3D-modeller inden for kræftforskning omfatter multicellulære sfæroider, stilladsbaserede strukturer og matrixindlejrede kulturer 4,6,7.
Denne protokol genererer 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kræftceller og evaluerer deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af to komplementære tilgange: et cellelevedygtighedsassay (MTT) og mikroskopiske undersøgelser. De repræsentative resultater, der præsenteres heri, er fra bryst- og tyktarmskræft; Denne protokol er imidlertid bredt anvendelig til andre solide tumortyper (f.eks. Cholangiocarcinom, mave-, lunge- og bugspytkirtelkræft) og er også omkostningseffektiv, da den kan udføres i sin helhed i et typisk kræftforsknings- / cellebiologilaboratorium uden at stole på specialudstyr. De multicellulære sfæroider, der genereres ved hjælp af denne tilgang, kan bruges til at vurdere potentielle lægemiddelkandidater, identificere potentielle biomarkører eller terapeutiske mål og undersøge mekanismerne for respons og resistens.
Denne protokol er opdelt i tre sektioner: (1) generering, indsamling og tælling af sfæroiderne som forberedelse til deres anvendelse som model til test af lægemiddeleffektivitet; (2) MTT-assay til vurdering af lægemiddeleffektivitet på sfæroiderne; og (3) den mikroskopiske evaluering af morfologiske ændringer efter behandling af sfæroiderne med lægemidler som en anden tilgang til evaluering af lægemiddeleffektivitet (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

På trods af bemærkelsesværdige fremskridt i forståelsen af tumorbiologi mislykkes langt de fleste onkologiske lægemiddelkandidater, der går ind i kliniske forsøg, ofte på grund af manglende klinisk effekt. Denne høje fejlrate belyser de nuværende prækliniske modellers manglende evne til at forudsige klinisk effekt, hovedsageligt på grund af deres utilstrækkelighed i at afspejle tumorheterogenitet og tumormikromiljøet. Disse begrænsninger kan løses med 3-dimensionelle (3D) kulturmodeller (sfæroider) etableret fra humane tumorprøver afledt af individuelle patienter. Disse 3D-kulturer repræsenterer biologi i den virkelige verden bedre end etablerede cellelinjer, der ikke afspejler tumorheterogenitet. Desuden er 3D-kulturer bedre end 2-dimensionelle (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer), da de replikerer elementer i tumormiljøet, såsom hypoxi, nekrose og celleadhæsion, og bevarer den naturlige celleform og vækst. I denne undersøgelse blev der udviklet en metode til fremstilling af primære kulturer af kræftceller fra individuelle patienter, der er 3D og vokser i flercellede sfæroider. Cellerne kan udledes direkte fra patienttumorer eller patientafledte xenotransplantater. Metoden er bredt anvendelig til solide tumorer (fx tyktarm, bryst og lunge) og er også omkostningseffektiv, da den kan udføres i sin helhed i et typisk kræftforsknings- / cellebiologilaboratorium uden at stole på specialudstyr. Heri præsenteres en protokol til generering af 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kræftceller og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af to komplementære tilgange: et cellelevedygtighedsassay (MTT) og mikroskopiske undersøgelser. Disse multicellulære sfæroider kan bruges til at vurdere potentielle lægemiddelkandidater, identificere potentielle biomarkører eller terapeutiske mål og undersøge mekanismerne for respons og resistens.

Denne protokol præsenterer procedurer til generering af en homogen kultur af sfæroider fra primære tumorceller, kvantitativ evaluering af lægemiddeleffektivitet på sfærisk kultur (MTT-assay) og bestemmelse af effekten af studielægemidler på sfærisk morfologi. Data fra de repræsentative forsøg med sfæroider genereret fra tyktarms- og brystkræftcellekulturer præsenteres. Lignende forsøg blev udført under anvendelse af andre tumortyper, herunder cholangiocarcinom, mave-, lunge- og bugspytkirtelkræft (data i...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Denne protokol beskriver generering af 3D-tumorkulturmodeller fra primære kræftceller og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler ved hjælp af cellelevedygtighedsassays og mikroskopiske undersøgelser.

Etablering af 3-dimensionelle sfæroider fra patientafledte tumorprøver og evaluering af deres følsomhed over for lægemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Vores protokol er vigtig, fordi den beskriver en generation af 3D-tumorkulturmodeller fra primære kræftceller, og denne model repræsenterer tumorbiologi i den virkelige verden bedre end cellelinjer. Denne tilgang gælder for en række solide tumorer. Det er også omkostningseffektivt, da det kan udføres fra start til slut i et typisk cellebiologisk laboratorium.De 3D-tumormodeller, der genereres ved hjælp af denne tilgang, understøtter forskning i tumorers følsomhed og resistens over for kræftbehandlinger eller en kombination af terapier. Denne tilgang genererer 3D-modeller fra primære kræftceller. Derfor kunne det identificere, hvilken terapi der sandsynligvis vil være effektiv for en bestemt patient og dermed hjælpe med at personliggøre hans eller hendes behandling.Ella Itzhaki, ph.d.-studerende fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Til at begynde med skal du tage en lille T25-kolbe med en enkeltcelle vedhæftende primær cellekultur og fjerne cellekulturmediet. Vask cellerne med PBS, og tilsæt en milliliter 1x Accutase i tre minutter ved 37 grader Celsius for at forberede en enkeltcellesuspension af vedhængende primære tumorcellekulturer på 75 til 100% sammenløb.Neutraliser Accutase-opløsningen ved at tilsætte fem ml cellekulturmedium. Opsug cellerne med en 10 ml serologisk pipette, og deponer dem i et 15 ml konisk rør. Centrifuger røret ved 800 g i fem minutter ved stuetemperatur.Fjern cellekulturmediet, og tilsæt otte ml frisk cellekulturmedium oven på cellepelleten, bland derefter forsigtigt. For at tælle de levedygtige celler med et hæmocytometer skal du tage en prøve på 50 mikroliter cellesuspension og blande den med 50 mikroliter trypanblå. Tæl derefter de levende celler, og beregn det samlede antal levende celler i suspensionen.Forbered derefter 3D-kulturmedium. Og efter beregning af antallet af celler, der er nødvendige til analysen og det krævede samlede volumen, fremstilles cellesuspension med det ønskede antal celler i 200 mikroliter 3D-kulturmedium. Bland forsigtigt med pipetten for at sikre en homogen fordeling.Overfør suspensionen til et pipetteringsreservoir, og tilsæt 200 mikroliter cellesuspension til hvert hul i en 96-brønds plade med ultralav fastgørelse og en flerkanalpipette. Pladen centrifugeres ved 300 g i 10 minutter ved stuetemperatur for at gennemtvinge klyngen af cellerne og derved forbedre celleaggregeringen og inkubere pladen ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxidbefugtet inkubator. Efter centrifugering igen ved 300 g i 10 minutter ved stuetemperatur fjernes og kasseres forsigtigt 50 % af mediet, og der tilsættes 100 mikroliter frisk 3D-dyrkningsmedium som erstatning for den eksisterende opløsning.Gentag dette trin, og læg pladen tilbage i 37 grader Celsius og 5% kuldioxid befugtet inkubator. Undersøg cellerne under et mikroskop hver anden til to dage for at overvåge sfærisk dannelse. Mål diameteren af de sfæroider, der dannes ved hjælp af skalaværktøjet i billedbehandlingssoftwaren.Og når sfæroidediameteren når 100 til 200 mikrometer, skal du udføre lægemiddeleffektivitetseksperimenterne. Til sfærisk samling skal du bruge en 1.000 mikroliter pipette til at samle sfæroiderne fra hver brønd og deponere dem i et 15 ml konisk rør. Det koniske rør centrifugeres ved 300 g i fem minutter ved stuetemperatur, og supernatanten suges forsigtigt og kasseres med en pipette.Tilsæt 0,5 ml af cellekulturmediet, og resuspender pelleten godt, men forsigtigt. For at udføre sfærisk tælling skal du bruge en 96-brøndplade og tegne et plustegn på undersiden af en brønd for at opdele brønden i kvadranter. Tilsæt 50 mikroliter af suspensionen til brønden.Og med en 10x objektiv linse tæller du sfæroiderne manuelt under mikroskopet. Tæl sfæroiderne i hver kvadrant, og beregn det samlede antal sfæroider i brønden. Beregn derefter sfæroidkoncentrationen ved at fordoble sfæroidtællingen ved at tælle volumen, og beregn det samlede antal sfæroider i suspensionen.I et nyt rør fremstilles sfærisk suspension i en koncentration på 200 sfæroider pr. 200 mikroliter cellekulturmedium. For hver lægemiddelbehandling skal du forberede bestanden af sfæroider i et andet rør. Beregn det samlede beløb, der er nødvendigt for hvert lægemiddel med antallet af brønde, der er nødvendige for gentagelser, og tilsæt lægemidlet til røret til den endelige koncentration, der er nødvendig.Overfør 200 mikroliter af den sfæroidopslæmmede suspension til brøndene på en 96-brøndplade med ultralav fastgørelse, og inkuber pladen ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxidbefugtet inkubator. Efter inkubation af sfæroiderne med forsøgslægemidlet i 24 til 72 timer, centrifugeres pladen ved 300 g i fem minutter ved stuetemperatur og fjernes forsigtigt 170 mikroliter af cellekulturmediet, hvilket efterlader 30 mikroliter i bunden af brønden. Forbered MTT-opløsningen, og tilsæt 70 mikroliter af opløsningen til hvert hul til et slutvolumen på 100 mikroliter pr. Brønd.Den endelige MTT-koncentration i brønden vil være 0,05 milligram pr. 100 mikroliter. Derudover skal du forberede tomme brønde med MTT-opløsning uden celler. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxidbefugtet inkubator i tre til fire timer, indtil der observeres en ændring i opløsningens farve i brøndene.Når der observeres en ændring, tilsættes 100 mikroliter Stop-opløsning til hver brønd, og bland forsigtigt indholdet af brøndene uden at skabe bobler. Pladens absorbans aflæses i en parameter ELISA-læser ved en bølgelængde på 570 nanometer og en baggrundsbølgelængde på 630 til 690 nanometer. For at beregne cellelevedygtigheden skal du beregne det specifikke signal for hver brønd.Beregn derefter gennemsnitsværdien af de tomme brønde, og træk denne værdi fra hver brønd. Beregn gennemsnittet af de specifikke signaler i kontrolhullerne, der indeholder celler, der ikke blev behandlet med forsøgslægemidlet. Endelig beregnes levedygtigheden af celler i hver brønd i forhold til brøndene med ubehandlede celler.Dannelsen af sfæroider fra en primær tyktarmskræftcellekultur over tid ved antallet af oprindeligt podede celler er vist her. Fra denne figur kan det ses, at antallet af genererede sfæroider afhænger af antallet af celler, der oprindeligt blev podet i hver brønd. Sfæroider fra de primære tyktarmskræftceller efter 10 dage i kultur med indledende cellesåning på 2.000 pr. Brønd er vist her.Efter langvarig dyrkning af tyktarmskræftsfæroider begyndte de at binde sig til hinanden og dannede klynger af sfæroider og druelignende strukturer, som forhindrede en homogen kultur og dermed forbød brugen af sfæroider i MTT-assays. Virkningerne af palbociclib, sunitinib og deres kombination på sfæroider fra primære tumorceller, herunder tyktarms- og brystkræft, er vist her. Et MTT-assay blev udført på sfæroider afledt af tyktarms- og brystkræftceller.MTT-signalerne blev normaliseret til værdier fra DMSO-behandlede celler. Værdierne repræsenterer middelværdierne fra fire til otte replikater. Virkningerne af de forskellige behandlinger på cellevækst blev også evalueret mikroskopisk på dag nul og efter tre dages behandling af sfæroider afledt af tyktarmskræft og brystkræftceller.Virkningerne af trastuzumab plus vinorelbin og 5 fluorouracil plus cisplatin på sfæroider afledt af brystkræft over tid er præsenteret i denne figur. Ændringen i diameteren af sfæroiderne i forhold til dag nul ved behandlingsvarigheden er vist her. Hver behandlingsgruppe omfattede fire til seks brønde med en sfærisk i hver brønd.Den gennemsnitlige ændring præsenteres her. Sfæroider er vigtige værktøjer til mange undersøgelser ud over respons på kræftbehandling. Disse undersøgelser omhandler for eksempel lægemiddelafgivelse og endda grundlæggende biologiske spørgsmål såsom celle-celle-interaktioner.Det er afgørende at starte en sfærisk genereringsproces med en enkeltcellesuspension. Det er også vigtigt at bruge ultralave fastgørelsesplader med et medium, der indeholder en 5% grundlæggende membranmåling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Mærkning af Breast Cancer Patient-afledte Xenografter med Sporbare Journalister for tumorvækst og Metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Høj-følsomhed påvisning af Micrometastases genereret af normal god landbrugspraksis Lentivirus-transduced Organoids kulturperler fra en Patient-afledte tyktarmen tumoren

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Efterligne og manipulere med pancreas Acinar til duktalt metaplasi i 3-dimensionelle cellekultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patient afledte Ortotopiske xenograft-modeller til humant Urothelialt celle karcinom og kolorektal cancer tumor vækst og spontan metastase

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient afledte 3D Sfæroider til anti-neoplastisk Drug screening for at målrette kræft stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering af små tarm neuroendokrine tumor Sfæroider

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering af Stem-lignende celler fra 3-dimensionelle sfæriske kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening af primære patient afledt tumor xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay ved hjælp af patient-afledte tumor organoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...