Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

De verzameling van menselijke tumormonsters die werden gebruikt voor de primaire tumorcelculturen werd uitgevoerd volgens de door de institutionele beoordelingsraad (IRB) goedgekeurde protocollen in het Rabin Medical Center met schriftelijke geïnformeerde toestemming van de patiënten. Patiënten die in aanmerking kwamen voor deelname aan de studie waren mannelijke en vrouwelijke volwassen en pediatrische kankerpatiënten met niet-gemetastaseerde borst-, darm-, lever-, long-, neuro-endocriene, eierstok- of pancreaskanke...

<ol>
	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

Het huidige protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het genereren van 3D primaire celculturen (sferoïden) afgeleid van menselijke tumormonsters. Deze sferoïden kunnen worden gebruikt voor verschillende analyses, waaronder het evalueren van potentiële kandidaat-geneesmiddelen en medicijncombinaties, het identificeren van potentiële biomarkers of therapeutische doelen en het onderzoeken van de mechanismen van respons en resistentie. Het protocol maakt gebruik van primaire tumorcellen die rechtstreeks zijn afgel...

In vitro en in vivo studies vertegenwoordigen complementaire benaderingen voor het ontwikkelen van kankerbehandelingen. In vitro modellen maken de controle van de meeste experimentele variabelen mogelijk en vergemakkelijken kwantitatieve analyses. Ze dienen vaak als goedkope screeningplatforms en kunnen ook worden gebruikt voor mechanistische studies1. Hun biologische relevantie is echter inherent beperkt, omdat dergelijke modellen slechts gedeeltelijk de micro-omgeving van de tumor weerspiegelen1. In vivo modellen, zoals patiënt-afgeleide xenografts (PDX), vangen daarentegen de complexiteit van de tumormicro-omgeving en zijn meer geschikt voor translationele studies en individualisering van de behandeling bij patiënten (d.w.z. het onderzoeken van de respons op geneesmiddelen in een model afgeleid van een individuele patiënt)1. In vivo modellen zijn echter niet bevorderlijk voor high-throughput benaderingen voor geneesmiddelenscreening, omdat de experimentele parameters niet zo strak kunnen worden gecontroleerd als in in vitro modellen en omdat hun ontwikkeling tijdrovend, arbeidsintensief en kostbaar is 1,2.
In vitro modellen zijn al meer dan 100 jaar beschikbaar en cellijnen zijn al meer dan 70 jaar beschikbaar3. In de afgelopen decennia is de complexiteit van de beschikbare in vitro modellen van solide tumoren echter dramatisch toegenomen. Deze complexiteit varieert van 2-dimensionale (2D) cultuurmodellen (monolaagstructuren) die ofwel tumor-afgeleide gevestigde cellijnen of primaire cellijnen zijn tot de meer recente benaderingen met 3-dimensionale (3D) modellen1. Binnen de 2D-modellen is een belangrijk onderscheid tussen de gevestigde en primaire cellijnen4. Gevestigde cellijnen worden vereeuwigd; Daarom kan dezelfde cellijn wereldwijd gedurende vele jaren worden gebruikt, wat vanuit een historisch perspectief samenwerking, de accumulatie van gegevens en de ontwikkeling van vele behandelingsstrategieën vergemakkelijkt. Genetische afwijkingen in deze cellijnen hopen zich echter op met elke passage, waardoor hun biologische relevantie in gevaar komt. Bovendien weerspiegelt het beperkte aantal beschikbare cellijnen niet de heterogeniteit van tumoren bij patiënten 4,5. Primaire kankercellijnen zijn rechtstreeks afgeleid van gereseceerde tumormonsters verkregen via biopsieën, pleurale effusies of resecties. Daarom zijn primaire kankercellijnen biologisch relevanter omdat ze elementen van de micro-omgeving van de tumor en tumorkenmerken behouden, zoals intercellulair gedrag (bijv. Cross-talk tussen gezonde en kankercellen) en de stamachtige fenotypen van kankercellen. De replicerende capaciteit van primaire cellijnen is echter beperkt, wat leidt tot een smalle kweektijd en het aantal tumorcellen beperkt dat kan worden gebruikt voor analyses 4,5.
Modellen met 3D-culturen zijn biologisch relevanter dan 2D-cultuurmodellen, omdat de in vivo omstandigheden behouden blijven. Zo behouden 3D-cultuurmodellen de natuurlijke celvorm en -groei en repliceren ze elementen van de tumoromgeving, zoals hypoxie, necrose en celadhesie. De meest gebruikte 3D-modellen in kankeronderzoek omvatten meercellige sferoïden, op steigers gebaseerde structuren en matrix-ingebedde culturen 4,6,7.
Het huidige protocol genereert 3D-tumorcultuurmodellen (meercellige sferoïden) uit primaire kankercellen en evalueert hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van twee complementaire benaderingen: een cel-levensvatbaarheidstest (MTT) en microscopisch onderzoek. De representatieve resultaten die hierin worden gepresenteerd, zijn van borst- en darmkanker; Dit protocol is echter breed toepasbaar op andere solide tumortypen (bijv. Cholangiocarcinoom, maag-, long- en alvleesklierkanker) en is ook kosteneffectief, omdat het in zijn geheel kan worden uitgevoerd in een typisch kankeronderzoek / celbiologisch laboratorium zonder te vertrouwen op gespecialiseerde apparatuur. De meercellige sferoïden die met behulp van deze aanpak worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om potentiële kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen, potentiële biomarkers of therapeutische doelen te identificeren en de mechanismen van respons en resistentie te onderzoeken.
Dit protocol is verdeeld in drie secties: (1) het genereren, verzamelen en tellen van de sferoïden ter voorbereiding op hun gebruik als model voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen; (2) MTT-test om de werkzaamheid van het geneesmiddel op de sferoïden te beoordelen; en (3) de microscopische evaluatie van morfologische veranderingen na de behandeling van de sferoïden met geneesmiddelen als een andere benadering voor het evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen (figuur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

Ondanks opmerkelijke vooruitgang in het begrijpen van tumorbiologie, faalt de overgrote meerderheid van de kandidaat-oncologische geneesmiddelen die deelnemen aan klinische onderzoeken, vaak als gevolg van een gebrek aan klinische werkzaamheid. Dit hoge faalpercentage verlicht het onvermogen van de huidige preklinische modellen om de klinische werkzaamheid te voorspellen, voornamelijk vanwege hun ontoereikendheid in het weerspiegelen van tumorheterogeniteit en de micro-omgeving van de tumor. Deze beperkingen kunnen worden aangepakt met 3-dimensionale (3D) cultuurmodellen (sferoïden) die zijn vastgesteld op basis van menselijke tumormonsters die zijn afgeleid van individuele patiënten. Deze 3D-culturen vertegenwoordigen de biologie van de echte wereld beter dan gevestigde cellijnen die de heterogeniteit van de tumor niet weerspiegelen. Bovendien zijn 3D-culturen beter dan 2-dimensionale (2D) cultuurmodellen (monolaagstructuren) omdat ze elementen van de tumoromgeving repliceren, zoals hypoxie, necrose en celadhesie, en de natuurlijke celvorm en -groei behouden. In de huidige studie werd een methode ontwikkeld voor het bereiden van primaire culturen van kankercellen van individuele patiënten die 3D zijn en groeien in meercellige sferoïden. De cellen kunnen rechtstreeks worden afgeleid van patiënttumoren of van de patiënt afgeleide xenografts. De methode is breed toepasbaar op solide tumoren (bijv. Dikke darm, borst en long) en is ook kosteneffectief, omdat het in zijn geheel kan worden uitgevoerd in een typisch kankeronderzoek / celbiologisch laboratorium zonder afhankelijk te zijn van gespecialiseerde apparatuur. Hierin wordt een protocol gepresenteerd voor het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen (meercellige sferoïden) uit primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van twee complementaire benaderingen: een cel-levensvatbaarheidstest (MTT) en microscopisch onderzoek. Deze meercellige sferoïden kunnen worden gebruikt om potentiële kandidaat-geneesmiddelen te beoordelen, potentiële biomarkers of therapeutische doelen te identificeren en de mechanismen van respons en resistentie te onderzoeken.

Dit protocol presenteert procedures voor het genereren van een homogene cultuur van sferoïden uit primaire tumorcellen, het kwantitatief evalueren van de werkzaamheid van geneesmiddelen op sferoïdecultuur (MTT-test) en het bepalen van het effect van studiegeneesmiddelen op sferoïde morfologie. Gegevens van de representatieve experimenten in sferoïden gegenereerd uit colon- en borstkankercelculturen worden gepresenteerd. Vergelijkbare experimenten werden uitgevoerd met behulp van andere tumortypen, waaronder cholangio...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Het huidige protocol beschrijft het genereren van 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen met behulp van cel-levensvatbaarheidstests en microscopische onderzoeken.

Het vaststellen van 3-dimensionale sferoïden uit van de patiënt afgeleide tumormonsters en het evalueren van hun gevoeligheid voor geneesmiddelen

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Ons protocol is belangrijk omdat het een generatie 3D-tumorcultuurmodellen van primaire kankercellen beschrijft, en dit model vertegenwoordigt de echte tumorbiologie beter dan cellijnen. Deze aanpak is van toepassing op een verscheidenheid aan solide tumoren. Het is ook kosteneffectief omdat het van begin tot eind kan worden uitgevoerd in een typisch celbiologisch laboratorium.De 3D-tumormodellen die met deze aanpak worden gegenereerd, ondersteunen onderzoek naar de gevoeligheid en resistentie van tumoren tegen kankertherapieën of een combinatie van therapieën. Deze aanpak genereert 3D-modellen van primaire kankercellen. Daarom kan het identificeren welke therapie waarschijnlijk effectief is voor een bepaalde patiënt en zo helpen zijn of haar behandeling te personaliseren.De procedure wordt gedemonstreerd door Ella Itzhaki, een promovenda uit mijn laboratorium. Neem om te beginnen een kleine T25-kolf met een eencellige aanhangende primaire celcultuur en verwijder de celkweekmedia. Was de cellen met PBS en voeg een milliliter 1x Accutase toe gedurende drie minuten bij 37 graden Celsius om een eencellige suspensie van aanhangende primaire tumorcelculturen van 75 tot 100% samenvloeiing te bereiden.Neutraliseer de Accutase-oplossing door vijf milliliter celkweekmedium toe te voegen. Zuig de cellen op met een serologische pipet van 10 milliliter en deponeer ze in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de buis op 800g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Verwijder het celkweekmedium en voeg acht milliliter vers celkweekmedium toe aan de celkorrel en meng voorzichtig. Om de levensvatbare cellen met een hemocytometer te tellen, neemt u een aliquot van 50 microliter van de celsuspensie en mengt u deze met 50 microliter trypanblauw. Tel vervolgens de levende cellen en bereken het totale aantal levende cellen in de suspensie.Bereid vervolgens het 3D-cultuurmedium voor. En na het berekenen van het aantal cellen dat nodig is voor de test en het totale benodigde volume, bereidt u celsuspensie voor met het gewenste aantal cellen in 200 microliter van het 3D-kweekmedium. Meng voorzichtig met de pipet om een homogene verdeling te garanderen.Breng de suspensie over naar een pipetteerreservoir en voeg 200 microliter van de celsuspensie toe aan elke put van een ultralage 96-putplaat met een meerkanaals pipet. Centrifugeer de plaat op 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de clustering van de cellen af te dwingen, waardoor de celaggregatie wordt verbeterd, en incuber de plaat bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator. Na het centrifugeren opnieuw op 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, verwijdert u voorzichtig 50% van het medium en gooit u het weg en voegt u 100 microliter vers 3D-kweekmedium toe om de bestaande oplossing te vervangen.Herhaal deze stap en plaats de plaat terug in de 37 graden Celsius en 5% kooldioxide bevochtigde incubator. Inspecteer de cellen om de één tot twee dagen onder een microscoop om de vorming van sferoïden te controleren. Meet de diameter van de gevormde sferoïden met behulp van het schaalgereedschap in de beeldvormingssoftware.En zodra de sferoïde diameter 100 tot 200 micrometer bereikt, voert u de experimenten met de werkzaamheid van het geneesmiddel uit. Gebruik voor het verzamelen van sferoïden een pipet van 1.000 microliter om de sferoïden uit elke put te verzamelen en deponeer ze in een conische buis van 15 milliliter. Centrifugeer de conische buis gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 300 g en zuig het supernatant voorzichtig op en gooi het weg met behulp van een pipet.Voeg 0,5 milliliter van het celkweekmedium toe en resuspensie de pellet goed maar voorzichtig. Om sferoïde tellen uit te voeren, gebruikt u een 96-putplaat en tekent u een plusteken aan de onderkant van een put om de put in kwadranten te verdelen. Voeg 50 microliter van de suspensie toe aan de put.En met een 10x objectieflens tel je de sferoïden handmatig onder de microscoop. Tel de sferoïden in elk kwadrant en bereken het totale aantal sferoïden in de put. Bereken vervolgens de sferoïdeconcentratie door het aantal sferoïden te verdubbelen door het volume te tellen en bereken het totale aantal sferoïden in de suspensie.Bereid in een nieuwe buis sferoïde suspensie in een concentratie van 200 sferoïden per 200 microliter celkweekmedium. Bereid voor elke medicamenteuze behandeling de voorraad sferoïden voor in een andere buis. Bereken de totale hoeveelheid die nodig is voor elk medicijn door het aantal putten dat nodig is voor herhalingen en voeg het medicijn toe aan de buis tot de uiteindelijke benodigde concentratie.Breng 200 microliter van de sferoïde suspensie over in de putten van een ultralage 96-putplaat en incuber de plaat bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator. Na het incuberen van de sferoïden met het onderzoeksgeneesmiddel gedurende 24 tot 72 uur, centrifugeert u de plaat gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur op 300 g en verwijdert u voorzichtig 170 microliter van het celkweekmedium, waardoor 30 microliter op de bodem van de put achterblijft. Bereid de MTT-oplossing voor en voeg 70 microliter van de oplossing toe aan elke put tot een eindvolume van 100 microliter per put.De uiteindelijke MTT-concentratie in de put is 0,05 milligram per 100 microliter. Bereid bovendien lege putten voor met MTT-oplossing zonder cellen. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator gedurende drie tot vier uur totdat een verandering in de kleur van de oplossing in de putten wordt waargenomen.Wanneer een verandering wordt waargenomen, voegt u 100 microliter Stop-oplossing toe aan elke put en mengt u voorzichtig de inhoud van de putten zonder bubbels te creëren. Lees de absorptie van de plaat in een parameter ELISA-lezer bij een golflengte van 570 nanometer en een achtergrondgolflengte van 630 tot 690 nanometer. Om de levensvatbaarheid van de cel te berekenen, berekent u het specifieke signaal voor elke put.Bereken vervolgens de gemiddelde waarde van de lege putten en trek deze waarde van elke put af. Bereken het gemiddelde van de specifieke signalen in de controleputten die cellen bevatten die niet met het onderzoeksgeneesmiddel zijn behandeld. Bereken ten slotte de levensvatbaarheid van cellen in elke put ten opzichte van de putten met onbehandelde cellen.De vorming van sferoïden uit een primaire darmkankercelcultuur in de loop van de tijd door het aantal aanvankelijk gezaaide cellen wordt hier weergegeven. Uit deze figuur kan worden afgeleid dat het aantal gegenereerde sferoïden afhankelijk is van het aantal cellen dat aanvankelijk in elke put is gezaaid. Sferoïden van de primaire darmkankercellen na 10 dagen in cultuur met initiële celzaaiing van 2.000 per put worden hier weergegeven.Na langdurige kweek van de darmkankersferoïden begonnen ze zich aan elkaar te hechten en vormden ze clusters van sferoïden en druifachtige structuren die een homogene cultuur voorkwamen en dus het gebruik van de sferoïden in de MTT-testen verboden. De effecten van palbociclib, sunitinib en hun combinatie op sferoïden uit primaire tumorcellen, waaronder darm- en borstkanker, worden hier weergegeven. Een MTT-test werd uitgevoerd op sferoïden afgeleid van darm- en borstkankercellen.De MTT-signalen werden genormaliseerd naar waarden van met DMSO behandelde cellen. De waarden vertegenwoordigen de gemiddelden van vier tot acht replicaties. De effecten van de verschillende behandelingen op de celgroei werden ook microscopisch geëvalueerd op dag nul en na drie dagen behandeling van de sferoïden afkomstig van darmkanker en borstkankercellen.De effecten van trastuzumab plus vinorelbine en 5 fluorouracil plus cisplatine op sferoïden afgeleid van borstkanker in de loop van de tijd worden weergegeven in deze figuur. De verandering in de diameter van de sferoïden ten opzichte van dag nul door de duur van de behandeling wordt hier weergegeven. Elke behandelingsgroep omvatte vier tot zes putten met één sferoïde in elke put.De gemiddelde verandering wordt hier weergegeven. Sferoïden zijn belangrijke hulpmiddelen voor veel studies die verder gaan dan de reactie op de behandeling van kanker. Deze studies richten zich bijvoorbeeld op medicijnafgifte en zelfs op fundamentele biologische vragen zoals cel-celinteracties.Het is van cruciaal belang om een sferoïde-generatieproces te starten met een eencellige suspensie. Het is ook van cruciaal belang om ultralage bevestigingsplaten te gebruiken met een medium dat een basismembraanmetriek van 5% bevat.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolatie en karakterisering van tumor initiërende cellen uit Sarcoom patiënt-afgeleide xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Nabootsen en manipuleren van de alvleesklier acinaire-naar-ductaal metaplasie in 3-dimensionale celcultuur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Oprichting en karakterisering van de neuro-endocriene tumor Spheroids van de kleine darm

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolatie van stam-achtige cellen uit 3-dimensionale Spheroid-culturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...