Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
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Die Entnahme von menschlichen Tumorproben, die für die Primärtumorzellkulturen verwendet wurden, wurde gemäß den vom Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokollen im Rabin Medical Center mit schriftlicher Einverständniserklärung der Patienten durchgeführt. Zu den Patienten, die für die Teilnahme an der Studie in Frage kamen, gehörten männliche und weibliche erwachsene und pädiatrische Krebspatienten mit nicht metastasiertem Brust-, Dickdarm-, Leber-, Lungen-, neuroendokrinen, Eierstock- oder Bauchsp...

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	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Erzeugung von 3D-Primärzellkulturen (Sphäroiden), die aus menschlichen Tumorproben gewonnen werden. Diese Sphäroide können für verschiedene Analysen verwendet werden, einschließlich der Bewertung potenzieller Wirkstoffkandidaten und Wirkstoffkombinationen, der Identifizierung potenzieller Biomarker oder therapeutischer Ziele und der Untersuchung der Mechanismen des Ansprechens und der Resistenz. Das Protokoll verwendet entweder Primärtumorzellen, die...

In-vitro- und In-vivo-Studien stellen komplementäre Ansätze für die Entwicklung von Krebstherapien dar. In-vitro-Modelle ermöglichen die Kontrolle der meisten experimentellen Variablen und erleichtern quantitative Analysen. Sie dienen oft als kostengünstige Screening-Plattformen und können auch für mechanistische Studien verwendet werden1. Ihre biologische Relevanz ist jedoch von Natur aus begrenzt, da solche Modelle die Mikroumgebung des Tumors nur teilweise widerspiegeln1. Im Gegensatz dazu erfassen In-vivo-Modelle, wie z. B. patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX), die Komplexität der Tumormikroumgebung und eignen sich besser für translationale Studien und die Individualisierung der Behandlung von Patienten (d. h. die Untersuchung des Ansprechens auf Medikamente in einem Modell, das von einem einzelnen Patienten abgeleitet wurde)1. In-vivo-Modelle sind jedoch nicht förderlich für Hochdurchsatz-Ansätze für das Wirkstoff-Screening, da die experimentellen Parameter nicht so streng kontrolliert werden können wie In-vitro-Modelle und weil ihre Entwicklung zeitaufwändig, arbeitsintensiv und kostspielig ist 1,2.
In-vitro-Modelle sind seit über 100 Jahren verfügbar, und Zelllinien sind seit über 70 Jahren verfügbar3. In den letzten Jahrzehnten hat die Komplexität der verfügbaren In-vitro-Modelle solider Tumoren jedoch dramatisch zugenommen. Diese Komplexität reicht von 2-dimensionalen (2D) Kulturmodellen (Monolayer-Strukturen), bei denen es sich entweder um etablierte Tumorzelllinien oder um primäre Zelllinien handelt, bis hin zu neueren Ansätzen mit 3-dimensionalen (3D) Modellen1. Innerhalb der 2D-Modelle besteht eine wesentliche Unterscheidung zwischen der etablierten und der primären Zelllinie4. Etablierte Zelllinien werden immortalisiert; Daher kann dieselbe Zelllinie über viele Jahre hinweg global verwendet werden, was aus historischer Sicht die Zusammenarbeit, die Anhäufung von Daten und die Entwicklung vieler Behandlungsstrategien erleichtert. Genetische Aberrationen in diesen Zelllinien häufen sich jedoch mit jeder Passage an und beeinträchtigen so ihre biologische Relevanz. Darüber hinaus spiegelt die begrenzte Anzahl verfügbarer Zelllinien nicht die Heterogenität der Tumoren bei Patientenwider 4,5. Primäre Krebszelllinien werden direkt aus resezierten Tumorproben gewonnen, die durch Biopsien, Pleuraergüsse oder Resektionen gewonnen wurden. Daher sind primäre Krebszelllinien biologisch relevanter, da sie Elemente der Tumormikroumgebung und Tumoreigenschaften bewahren, wie z. B. interzelluläres Verhalten (z. B. Cross-Talk zwischen gesunden und krebsartigen Zellen) und die stammähnlichen Phänotypen von Krebszellen. Die Replikationskapazität der primären Zelllinien ist jedoch begrenzt, was zu einer engen Kulturzeit führt und die Anzahl der Tumorzellen begrenzt, die für Analysen verwendet werden können 4,5.
Modelle, die 3D-Kulturen verwenden, sind biologisch relevanter als 2D-Kulturmodelle, da die In-vivo-Bedingungen beibehalten werden. So bewahren 3D-Kulturmodelle die natürliche Zellform und das Zellwachstum und replizieren Elemente der Tumorumgebung wie Hypoxie, Nekrose und Zelladhäsion. Zu den am häufigsten verwendeten 3D-Modellen in der Krebsforschung gehören mehrzellige Sphäroide, gerüstbasierte Strukturen und matrixeingebettete Kulturen 4,6,7.
Das vorliegende Protokoll generiert 3D-Tumorkulturmodelle (multizelluläre Sphäroide) aus primären Krebszellen und bewertet deren Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten mit zwei komplementären Ansätzen: einem Zellviabilitätstest (MTT) und mikroskopischen Untersuchungen. Die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse stammen von Brust- und Darmkrebs; Dieses Protokoll ist jedoch auf andere solide Tumorarten (z. B. Cholangiokarzinom, Magen-, Lungen- und Bauchspeicheldrüsenkrebs) anwendbar und auch kostengünstig, da es in seiner Gesamtheit in einem typischen Krebsforschungs-/Zellbiologielabor durchgeführt werden kann, ohne auf spezielle Geräte angewiesen zu sein. Die mit diesem Ansatz erzeugten multizellulären Sphäroide können verwendet werden, um potenzielle Wirkstoffkandidaten zu bewerten, potenzielle Biomarker oder therapeutische Ziele zu identifizieren und die Mechanismen des Ansprechens und der Resistenz zu untersuchen.
Dieses Protokoll gliedert sich in drei Abschnitte: (1) die Erzeugung, Sammlung und Zählung der Sphäroide in Vorbereitung auf ihre Verwendung als Modell für die Prüfung der Wirksamkeit von Arzneimitteln; (2) MTT-Assay zur Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit auf die Sphäroide; und (3) die mikroskopische Bewertung morphologischer Veränderungen nach der Behandlung der Sphäroide mit Medikamenten als weiterer Ansatz zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten (Abbildung 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

Trotz bemerkenswerter Fortschritte im Verständnis der Tumorbiologie scheitert die überwiegende Mehrheit der onkologischen Arzneimittelkandidaten, die in klinische Studien eintreten, oft aufgrund mangelnder klinischer Wirksamkeit. Diese hohe Ausfallrate verdeutlicht die Unfähigkeit der aktuellen präklinischen Modelle, die klinische Wirksamkeit vorherzusagen, hauptsächlich aufgrund ihrer Unzulänglichkeit bei der Reflexion der Tumorheterogenität und der Tumormikroumgebung. Diese Einschränkungen können mit 3-dimensionalen (3D) Kulturmodellen (Sphäroiden) behoben werden, die aus menschlichen Tumorproben von einzelnen Patienten erstellt wurden. Diese 3D-Kulturen repräsentieren die reale Biologie besser als etablierte Zelllinien, die keine Tumorheterogenität widerspiegeln. Darüber hinaus sind 3D-Kulturen besser als 2-dimensionale (2D) Kulturmodelle (Monolayer-Strukturen), da sie Elemente der Tumorumgebung wie Hypoxie, Nekrose und Zelladhäsion nachbilden und die natürliche Zellform und das Wachstum erhalten. In der vorliegenden Studie wurde eine Methode zur Herstellung von Primärkulturen von Krebszellen von einzelnen Patienten entwickelt, die 3D sind und in mehrzelligen Sphäroiden wachsen. Die Zellen können direkt aus Patiententumoren oder von Patienten stammenden Xenotransplantaten gewonnen werden. Die Methode ist bei soliden Tumoren (z. B. Dickdarm, Brust und Lunge) weit verbreitet und auch kostengünstig, da sie in ihrer Gesamtheit in einem typischen Labor für Krebsforschung/Zellbiologie durchgeführt werden kann, ohne auf spezielle Geräte angewiesen zu sein. Hier wird ein Protokoll zur Generierung von 3D-Tumorkulturmodellen (multizelluläre Sphäroide) aus primären Krebszellen und zur Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten mit zwei komplementären Ansätzen vorgestellt: einem Zellviabilitätstest (MTT) und mikroskopischen Untersuchungen. Diese multizellulären Sphäroide können verwendet werden, um potenzielle Wirkstoffkandidaten zu bewerten, potenzielle Biomarker oder therapeutische Ziele zu identifizieren und die Mechanismen des Ansprechens und der Resistenz zu untersuchen.

In diesem Protokoll werden Verfahren zur Erzeugung einer homogenen Kultur von Sphäroiden aus Primärtumorzellen, zur quantitativen Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln auf die Sphäroidkultur (MTT-Assay) und zur Bestimmung der Wirkung von Studienmedikamenten auf die Sphäroidmorphologie vorgestellt. Es werden Daten aus den repräsentativen Experimenten mit Sphäroiden vorgestellt, die aus Dickdarm- und Brustkrebszellkulturen generiert wurden. Ähnliche Experimente wurden mit anderen Tumorarten durchgeführt, daru...

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Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen und die Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten unter Verwendung von Zellviabilitätsassays und mikroskopischen Untersuchungen.

Etablierung von 3-dimensionalen Sphäroiden aus patienteneigenen Tumorproben und Bewertung ihrer Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Unser Protokoll ist bedeutsam, weil es eine Generation von 3D-Tumorkulturmodellen aus primären Krebszellen beschreibt, und dieses Modell repräsentiert die reale Tumorbiologie besser als Zelllinien. Dieser Ansatz ist auf eine Vielzahl von soliden Tumoren anwendbar. Es ist auch kostengünstig, da es von Anfang bis Ende in einem typischen zellbiologischen Labor durchgeführt werden kann.Die mit diesem Ansatz erstellten 3D-Tumormodelle unterstützen die Erforschung der Sensitivität und Resistenz von Tumoren gegenüber Krebstherapien oder einer Kombination von Therapien. Dieser Ansatz generiert 3D-Modelle aus primären Krebszellen. Daher könnte es identifizieren, welche Therapie für einen bestimmten Patienten wahrscheinlich wirksam ist, und so dazu beitragen, seine Behandlung zu personalisieren.Das Verfahren wird von Ella Itzhaki, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Nehmen Sie zunächst einen kleinen T25-Kolben mit einer einzelligen adhärenten primären Zellkultur und entfernen Sie das Zellkulturmedium. Waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie einen Milliliter 1x Accutase für drei Minuten bei 37 Grad Celsius hinzu, um eine Einzelzellsuspension von adhärenten Primärtumorzellkulturen von 75 bis 100% Konfluenz herzustellen.Neutralisieren Sie die Accutase-Lösung durch Zugabe von fünf Millilitern Zellkulturmedium. Aspirieren Sie die Zellen mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette und legen Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 800 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.Entfernen Sie das Zellkulturmedium, geben Sie acht Milliliter frisches Zellkulturmedium auf das Zellpellet und mischen Sie es dann vorsichtig. Um die lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer zu zählen, nehmen Sie ein Aliquot von 50 Mikrolitern der Zellsuspension und mischen Sie es mit 50 Mikrolitern Trypanblau. Zählen Sie dann die lebenden Zellen und berechnen Sie die Gesamtzahl der lebenden Zellen in der Suspension.Als nächstes bereiten Sie das 3D-Nährmedium vor. Nachdem Sie die Anzahl der für den Assay benötigten Zellen und das erforderliche Gesamtvolumen berechnet haben, bereiten Sie die Zellsuspension mit der gewünschten Anzahl von Zellen in 200 Mikrolitern des 3D-Kulturmediums vor. Vorsichtig mit der Pipette mischen, um eine homogene Verteilung zu gewährleisten.Übertragen Sie die Suspension in ein Pipettierreservoir und geben Sie 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz und einer Mehrkanalpipette. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um die Clusterbildung der Zellen zu erzwingen und dadurch die Zellaggregation zu verbessern, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach erneutem Zentrifugieren mit 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur 50 % des Mediums vorsichtig entfernen und verwerfen und 100 Mikroliter frisches 3D-Nährmedium hinzufügen, um die vorhandene Lösung zu ersetzen.Wiederholen Sie diesen Schritt und legen Sie die Platte wieder in den mit 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator. Untersuchen Sie die Zellen alle ein bis zwei Tage unter dem Mikroskop, um die Sphäroidbildung zu überwachen. Messen Sie den Durchmesser der gebildeten Sphäroide mit dem Skalenwerkzeug in der Bildgebungssoftware.Und sobald der Sphäroiddurchmesser 100 bis 200 Mikrometer erreicht, führen Sie die Experimente zur Wirksamkeit des Arzneimittels durch. Verwenden Sie für die Sphäroidsammlung eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die Sphäroide aus jeder Vertiefung zu sammeln, und legen Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn mit einer Pipette.Fügen Sie 0,5 Milliliter des Zellkulturmediums hinzu und resuspendieren Sie das Pellet gut, aber vorsichtig. Um eine Sphäroidzählung durchzuführen, verwenden Sie eine 96-Well-Platte und zeichnen Sie ein Pluszeichen auf die Unterseite eines Wells, um das Well-Loch in Quadranten zu unterteilen. Geben Sie 50 Mikroliter der Suspension in die Vertiefung.Und mit einer 10-fachen Objektivlinse können Sie die Sphäroide manuell unter dem Mikroskop zählen. Zählen Sie die Sphäroide in jedem Quadranten und berechnen Sie die Gesamtzahl der Sphäroide im Bohrloch. Berechnen Sie dann die Sphäroidkonzentration, indem Sie die Sphäroidzahl durch Zählen des Volumens verdoppeln, und berechnen Sie die Gesamtzahl der Sphäroide in der Suspension.In einem neuen Röhrchen wird eine Sphäroidsuspension in einer Konzentration von 200 Sphäroiden pro 200 Mikroliter Zellkulturmedium hergestellt. Bereiten Sie für jede medikamentöse Behandlung den Vorrat an Sphäroiden in einem anderen Röhrchen vor. Berechnen Sie die Gesamtmenge, die für jedes Medikament benötigt wird, anhand der Anzahl der Vertiefungen, die für Wiederholungen benötigt werden, und geben Sie das Medikament bis zur erforderlichen Endkonzentration in das Röhrchen.Übertragen Sie 200 Mikroliter der Sphäroidsuspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nachdem Sie die Sphäroide 24 bis 72 Stunden lang mit dem Studienmedikament inkubiert haben, zentrifugieren Sie die Platte bei 300 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur und entfernen Sie vorsichtig 170 Mikroliter des Zellkulturmediums, wobei 30 Mikroliter am Boden der Vertiefung verbleiben. Bereiten Sie die MTT-Lösung vor und geben Sie 70 Mikroliter der Lösung in jede Vertiefung zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern pro Vertiefung.Die endgültige MTT-Konzentration im Bohrloch beträgt 0,05 Milligramm pro 100 Mikroliter. Bereiten Sie außerdem leere Vertiefungen mit MTT-Lösung ohne Zellen vor. Inkubieren Sie die Platte drei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, bis eine Farbänderung der Lösung in den Vertiefungen beobachtet wird.Wenn eine Veränderung beobachtet wird, geben Sie 100 Mikroliter Stop-Lösung in jede Vertiefung und mischen Sie den Inhalt der Vertiefungen vorsichtig, ohne Blasen zu erzeugen. Lesen Sie die Absorption der Platte in einem Parameter-ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 570 Nanometern und einer Hintergrundwellenlänge von 630 bis 690 Nanometern ab. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu berechnen, berechnen Sie das spezifische Signal für jede Vertiefung.Berechnen Sie dann den Durchschnittswert der leeren Vertiefungen und subtrahieren Sie diesen Wert von jeder Vertiefung. Berechnen Sie den Durchschnitt der spezifischen Signale in den Kontrollvertiefungen, die Zellen enthalten, die nicht mit dem Studienmedikament behandelt wurden. Berechnen Sie schließlich die Lebensfähigkeit der Zellen in jeder Vertiefung im Verhältnis zu den Vertiefungen mit unbehandelten Zellen.Die Bildung von Sphäroiden aus einer primären Kolonkarzinom-Zellkultur im Zeitverlauf anhand der Anzahl der anfänglich ausgesäten Zellen wird hier gezeigt. Aus dieser Abbildung ist ersichtlich, dass die Anzahl der erzeugten Sphäroide von der Anzahl der Zellen abhängt, die ursprünglich in jeder Vertiefung ausgesät wurden. Hier sind Sphäroide aus den primären Darmkrebszellen nach 10 Tagen in Kultur mit einer anfänglichen Zellaussaat von 2.000 pro Well dargestellt.Bei längerer Kultivierung der Darmkrebs-Sphäroide begannen sie sich aneinander zu binden und bildeten Cluster von Sphäroiden und traubenartigen Strukturen, die eine homogene Kultur verhinderten und somit die Verwendung der Sphäroide in den MTT-Assays verhinderten. Die Wirkungen von Palbociclib, Sunitinib und ihrer Kombination auf Sphäroide aus Primärtumorzellen, einschließlich Dickdarm- und Brustkrebs, werden hier gezeigt. Ein MTT-Assay wurde an Sphäroiden durchgeführt, die aus Dickdarm- und Brustkrebszellen gewonnen wurden.Die MTT-Signale wurden auf Werte von DMSO-behandelten Zellen normalisiert. Die Werte stellen die Mittelwerte von vier bis acht Replikaten dar. Die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf das Zellwachstum wurden auch am Tag Null und nach dreitägiger Behandlung der aus Darmkrebs- und Brustkrebszellen stammenden Sphäroide mikroskopisch bewertet.Die Auswirkungen von Trastuzumab plus Vinorelbin und 5 Fluorouracil plus Cisplatin auf Sphäroide, die im Laufe der Zeit von Brustkrebs stammen, sind in dieser Abbildung dargestellt. Die Veränderung des Durchmessers der Sphäroide relativ zum Tag Null durch die Dauer der Behandlung ist hier dargestellt. Jede Behandlungsgruppe umfasste vier bis sechs Vertiefungen mit einem Sphäroid in jeder Vertiefung.Die durchschnittliche Veränderung wird hier dargestellt. Sphäroide sind wichtige Werkzeuge für viele Studien, die über das Ansprechen auf die Krebsbehandlung hinausgehen. Diese Studien befassen sich zum Beispiel mit der Verabreichung von Medikamenten und sogar mit grundlegenden biologischen Fragen wie Zell-Zell-Interaktionen.Es ist wichtig, einen Sphäroidegenerierungsprozess mit einer Einzelzellsuspension zu starten. Es ist auch wichtig, extrem niedrige Befestigungsplatten mit einem Medium zu verwenden, das eine Grundmembranmetrik von 5 % enthält.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Forschung

Krebsforschung

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolierung und Charakterisierung tumorinitiierender Zellen aus Sarkom-Patienten-abgeleiteten Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Hochempfindlichen Nachweis von Fixierungsprotokoll von GFP Lentivirus ausgestrahlt Organellen kultiviert von einem Patienten abgeleitet Doppelpunkt Tumor erzeugt

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patientenabgeleitete orthotopische Xenograft-Modelle für humanes Urotheliale Zellkarzinom und Kolorektalkrebs-Tumorwachstum und spontane Metastasierung

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Physiologische Rand-3D-Sphäroide für antineoplastisches Arzneimittel-Screening, um Krebs-Stammzellen gezielt anzusprechen

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablierung und Charakterisierung von kleinen Darm Neuroendokrinen Tumor Sphäriden

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Arzneimittel-Screening von Primärpatienten abgeleitetTumor Xenografts in Zebrafischen

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...