Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

איסוף דגימות הגידול האנושי המשמשות לתרביות תאי הגידול הראשוניות בוצע בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית (IRB) במרכז הרפואי רבין ובהסכמה מדעת בכתב של החולים. בין החולים הזכאים להשתתף במחקר היו חולי סרטן מבוגרים וילדים עם סרטן שד, מעי גס, כבד, ריאה, נוירואנדוקרינה, שחלות או ל...

<ol>
	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה פשוטה ליצירת תרביות תאים ראשוניות תלת-ממדיות (ספרואידים) שמקורן בדגימות גידול אנושיות. ספרואידים אלה יכולים לשמש לניתוחים שונים, כולל הערכת מועמדים פוטנציאליים לתרופות ושילובי תרופות, זיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות, וחקירת מנגנוני התגובה...

מחקרי In vitro ו-in vivo מייצגים גישות משלימות לפיתוח טיפולים לסרטן. מודלים במבחנה מאפשרים שליטה ברוב משתני הניסוי ומאפשרים ניתוחים כמותיים. לעתים קרובות הם משמשים כפלטפורמות סינון בעלות נמוכה וניתן להשתמש בהם גם למחקרים מכניסטיים1. עם זאת, הרלוונטיות הביולוגית שלהם מוגבלת מטבעה, שכן מודלים כאלה משקפים רק חלקית את המיקרו-סביבה של הגידול1. לעומת זאת, מודלים in vivo, כגון xenografts שמקורם במטופל (PDX), לוכדים את המורכבות של המיקרו-סביבה של הגידול ומתאימים יותר למחקרים תרגומיים ולטיפול אינדיבידואלי בחולים (כלומר, חקירת התגובה לתרופות במודל הנגזר ממטופל בודד)1. עם זאת, מודלים in vivo אינם תורמים לגישות בעלות תפוקה גבוהה לסינון תרופות, מכיוון שלא ניתן לשלוט בפרמטרים הניסיוניים בצורה הדוקה כמו במודלים במבחנה ומכיוון שפיתוחם גוזל זמן, דורש עבודה ויקר 1,2.
מודלים במבחנה זמינים כבר מעל 100 שנה, וקווי תאים זמינים מעל 70 שנה3. במהלך העשורים האחרונים, עם זאת, המורכבות של מודלים זמינים במבחנה של גידולים מוצקים גדל באופן דרמטי. מורכבות זו נעה בין מודלים דו-ממדיים (דו-ממדיים) של תרבית (מבנים חד-שכבתיים) שהם קווי תאים מבוססים שמקורם בגידול או קווי תאים ראשוניים ועד לגישות עדכניות יותר הכוללות מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים)1. בתוך המודלים הדו-ממדיים, הבחנה מרכזית היא בין קווי התאים המבוססים והראשוניים4. קווי תאים מבוססים מונצחים; לכן, אותו קו תאים יכול לשמש באופן גלובלי לאורך שנים רבות, אשר בפרספקטיבה היסטורית, מאפשר שיתוף פעולה, הצטברות נתונים, ופיתוח אסטרטגיות טיפול רבות. עם זאת, סטיות גנטיות בקווי תאים אלה מצטברות עם כל מעבר, ובכך פוגעות ברלוונטיות הביולוגית שלהם. יתר על כן, המספר המוגבל של שורות תאים זמינות אינו משקף את ההטרוגניות של גידולים בחולים 4,5. קווי תאים סרטניים ראשוניים נגזרים ישירות מדגימות גידול שנכרתו המתקבלות באמצעות ביופסיות, עירוי פלאורלי או כריתות. לכן, קווי תאים סרטניים ראשוניים רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית מכיוון שהם משמרים אלמנטים של מיקרו-סביבה של הגידול ומאפייני הגידול, כגון התנהגויות בין-תאיות (למשל, דיבור צולב בין תאים בריאים וסרטניים) ופנוטיפים דמויי גזע של תאים סרטניים. עם זאת, יכולת השכפול של קווי תאים ראשוניים מוגבלת, מה שמוביל לזמן תרבית צר ומגביל את מספר תאי הגידול שניתן להשתמש בהם לאנליזות 4,5.
מודלים המשתמשים בתרביות תלת-ממדיות רלוונטיים יותר מבחינה ביולוגית מאשר מודלים של תרביות דו-ממדיות מכיוון שתנאי in vivo נשמרים. לפיכך, מודלים של תרבית תלת ממדית משמרים את צורת התא הטבעית ואת צמיחתה ומשכפלים אלמנטים של סביבת הגידול, כגון היפוקסיה, נמק והיצמדות תאים. המודלים התלת-ממדיים הנפוצים ביותר בחקר הסרטן כוללים ספרואידים רב-תאיים, מבנים מבוססי פיגומים ותרביות משובצות מטריצה 4,6,7.
הפרוטוקול הנוכחי מייצר מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידולים (ספרואידים רב-תאיים) מתאי סרטן ראשוניים ומעריך את רגישותם לתרופות באמצעות שתי גישות משלימות: בדיקת כדאיות התא (MTT) ובדיקות מיקרוסקופיות. התוצאות המייצגות המוצגות כאן הן מסרטן השד והמעי הגס; עם זאת, פרוטוקול זה ישים באופן נרחב לסוגי גידולים מוצקים אחרים (למשל, כולנגיוקרצינומה, סרטן קיבה, ריאות ולבלב) והוא גם חסכוני, מכיוון שניתן לבצע אותו במלואו במעבדה טיפוסית לחקר הסרטן / ביולוגיה של התא מבלי להסתמך על ציוד מיוחד. הספרואידים הרב-תאיים הנוצרים באמצעות גישה זו יכולים לשמש להערכת מועמדים פוטנציאליים לתרופה, לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות, ולחקור את מנגנוני התגובה והעמידות.
פרוטוקול זה מחולק לשלושה חלקים: (1) ייצור, איסוף וספירה של הספרואידים לקראת השימוש בהם כמודל לבדיקת יעילות התרופה; (2) בדיקת MTT להערכת יעילות התרופה על הספרואידים; ו-(3) הערכה מיקרוסקופית של שינויים מורפולוגיים בעקבות הטיפול בכדורידים בתרופות כגישה נוספת להערכת יעילות התרופה (איור 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

למרות התקדמות מרשימה בהבנת הביולוגיה של הגידול, הרוב המכריע של התרופות האונקולוגיות המועמדות לניסויים קליניים נכשלים, לעתים קרובות בשל חוסר יעילות קלינית. שיעור כישלון גבוה זה מאיר את חוסר יכולתם של המודלים הפרה-קליניים הנוכחיים לחזות יעילות קלינית, בעיקר בשל חוסר יכולתם לשקף את הטרוגניות הגידול ואת המיקרו-סביבה של הגידול. ניתן לטפל במגבלות אלה באמצעות מודלים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) של תרבית (ספרואידים) שהוקמו מדגימות גידול אנושיות שמקורן בחולים בודדים. תרביות תלת-ממדיות אלה מייצגות ביולוגיה של העולם האמיתי טוב יותר מאשר קווי תאים מבוססים שאינם משקפים הטרוגניות של הגידול. יתר על כן, תרביות תלת-ממדיות טובות יותר ממודלים של תרביות דו-ממדיות (2D) (מבנים חד-שכבתיים) מכיוון שהן משכפלות אלמנטים של סביבת הגידול, כגון היפוקסיה, נמק והיצמדות תאים, ומשמרים את צורת התא הטבעית ואת צמיחתה. במחקר הנוכחי פותחה שיטה להכנת תרביות ראשוניות של תאים סרטניים מחולים בודדים שהם תלת ממדיים וגדלים בכדוריות רב-תאיות. התאים יכולים להיגזר ישירות מגידולים של חולים או xenografts שמקורם בחולה. השיטה ישימה באופן נרחב לגידולים מוצקים (למשל, מעי גס, שד וריאות) והיא גם חסכונית, מכיוון שניתן לבצע אותה בשלמותה במעבדה טיפוסית לחקר הסרטן / ביולוגיה של התא מבלי להסתמך על ציוד מיוחד. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידולים (ספרואידים רב-תאיים) מתאי סרטן ראשוניים ולהערכת רגישותם לתרופות באמצעות שתי גישות משלימות: בדיקת כדאיות התא (MTT) ובדיקות מיקרוסקופיות. ניתן להשתמש בספרואידים רב-תאיים אלה כדי להעריך מועמדים פוטנציאליים לתרופה, לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות, ולחקור את מנגנוני התגובה והעמידות.

פרוטוקול זה מציג נהלים ליצירת תרבית הומוגנית של ספרואידים מתאי גידול ראשוניים, הערכה כמותית של יעילות התרופה על תרבית ספרואידים (בדיקת MTT), וקביעת ההשפעה של תרופות מחקר על מורפולוגיה ספרואידית. מוצגים נתונים מהניסויים המייצגים בספרואידים שנוצרו מתרביות תאי סרטן המעי הגס והשד. ניסויים דומ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים והערכת רגישותם לתרופות באמצעות בדיקות כדאיות תאים ובדיקות מיקרוסקופיות.

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

הפרוטוקול שלנו משמעותי מכיוון שהוא מתאר דור של מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים, ומודל זה מייצג את הביולוגיה של הגידול בעולם האמיתי טוב יותר מאשר קווי תאים. גישה זו ישימה למגוון גידולים מוצקים. זה גם חסכוני כפי שהוא יכול להתבצע מתחילתו ועד סופו במעבדה ביולוגיה טיפוסית התא.המודלים התלת-ממדיים של גידולים שנוצרו בגישה זו תומכים במחקר על הרגישות והעמידות של גידולים לטיפולים אנטי-סרטניים או לשילוב של טיפולים. גישה זו מייצרת מודלים תלת-ממדיים מתאי סרטן ראשוניים. לכן, הוא יכול לזהות איזה טיפול עשוי להיות יעיל עבור מטופל מסוים ובכך לעזור להתאים אישית את הטיפול שלו או שלה.מי שתדגים את ההליך תהיה אלה יצחקי, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, קח בקבוק T25 קטן עם תרבית תאים ראשונית דבק יחיד והסר את מדיית תרבית התא. שטפו את התאים עם PBS, והוסיפו מיליליטר אחד של 1x Accutase למשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי להכין תרחיף חד-תאי של תרביות תאי גידול ראשוניים דבקים במפגש של 75% עד 100%.נטרול תמיסת Accutase על ידי הוספת חמישה מיליליטר של מדיום תרבית תאים. שואפים את התאים עם פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, ומפקידים אותם בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 800 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.הסר את מדיום תרבית התא, והוסף שמונה מיליליטר של מדיום תרבית תאים טרי על גבי גלולת התא, ולאחר מכן ערבב בעדינות. כדי לספור את התאים קיימא עם hemocytometer, לקחת aliquot של 50 מיקרוליטר של השעיית התא ולערבב אותו עם 50 מיקרוליטר של טריפאן כחול. לאחר מכן ספור את התאים החיים וחשב את המספר הכולל של תאים חיים בהשעיה.לאחר מכן, להכין מדיום תרבות 3D. ולאחר חישוב מספר התאים הדרושים לבדיקה ואת הנפח הכולל הנדרש, להכין השעיית תאים עם מספר התאים הרצוי ב 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית 3D. מערבבים בעדינות עם פיפטה כדי להבטיח פיזור הומוגני.מעבירים את התרחיף למאגר צנרת, ומוסיפים 200 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של צלחת חיבור 96 בארות נמוכה במיוחד עם פיפטה רב ערוצית. צנטריפוגו את הצלחת ב-300 גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאכוף את התקבצות התאים, ובכך לשפר את צבירת התא, ולדגור על הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני. לאחר צנטריפוגה שוב ב 300 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר בעדינות ולהשליך 50% של המדיום, ולהוסיף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תלת ממדית טרי כדי להחליף את הפתרון הקיים.חזור על שלב זה, והחזיר את הצלחת לאינקובטור לחות של 37 מעלות צלזיוס ו- 5% פחמן דו חמצני. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כל יום עד יומיים כדי לעקוב אחר היווצרות הספרואידים. מדוד את קוטר הספרואידים שנוצרו באמצעות כלי קנה המידה בתוכנת ההדמיה.וברגע שקוטר הספרואיד מגיע ל -100 עד 200 מיקרומטר, בצע את ניסויי יעילות התרופה. לאיסוף ספרואידים, השתמש פיפטה 1, 000 מיקרוליטר כדי לאסוף את הספרואידים מכל באר, והפקיד אותם לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגו את הצינור החרוטי ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ובזהירות שאפו והשליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.מוסיפים 0.5 מיליליטר של מדיום תרבית התא, ומשעיפים מחדש את הגלולה היטב אך בעדינות. כדי לבצע ספירה ספרואידית, השתמש בלוח של 96 בארות וצייר סימן פלוס בחלק התחתון של באר כדי לחלק את הבאר לרבעים. מוסיפים 50 מיקרוליטר של התרחיף לבאר.ועם עדשה אובייקטיבית פי 10, ספרו את הספרואידים ידנית מתחת למיקרוסקופ. ספרו את הספרואידים בכל רביע, וחשבו את המספר הכולל של הספרואידים בבאר. לאחר מכן חשב את ריכוז הספרואידים על ידי הכפלת ספירת הספרואידים על ידי ספירת נפח, וחשב את המספר הכולל של הספרואידים בתרחיף.בצינור חדש, להכין תרחיף ספרואיד בריכוז של 200 spheroids לכל 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים. עבור כל טיפול תרופתי, להכין את מלאי spheroids בצינור אחר. חשב את הסכום הכולל הדרוש לכל תרופה לפי מספר הבארות הדרושות לחזרות, והוסף את התרופה לצינור לריכוז הסופי הדרוש.מעבירים 200 מיקרוליטר של תרחיף הספרואיד לבארות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד של 96 בארות, ודגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה על הספרואידים עם תרופת המחקר במשך 24 עד 72 שעות, צנטריפוגות את הצלחת ב 300 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ובעדינות להסיר 170 מיקרוליטר של מדיום תרבית התא, משאיר 30 מיקרוליטר בתחתית הבאר. הכינו את תמיסת MTT, והוסיפו 70 מיקרוליטר של התמיסה לכל באר לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לבאר.ריכוז MTT הסופי בבאר יהיה 0.05 מיליגרם לכל 100 מיקרוליטר. בנוסף, להכין בארות ריקות עם פתרון MTT ללא תאים. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני למשך שלוש עד ארבע שעות עד שנצפה שינוי בצבע התמיסה בבארות.כאשר נצפה שינוי, להוסיף 100 מיקרוליטר של פתרון Stop לכל באר, ולערבב בעדינות את התוכן של הבארות מבלי ליצור בועות. קרא את בליעת הלוח בקורא ELISA פרמטר באורך גל של 570 ננומטר ובאורך גל רקע של 630 עד 690 ננומטר. כדי לחשב את כדאיות התא, חשב את האות הספציפי עבור כל באר.לאחר מכן חשב את הערך הממוצע של הבארות הריקות והפחת ערך זה מכל באר. חשב את הממוצע של האותות הספציפיים בבארות הבקרה המכילות תאים שלא טופלו בתרופת המחקר. לבסוף, לחשב את הכדאיות של תאים בכל באר ביחס לבארות עם תאים לא מטופלים.היווצרות ספרואידים מתרבית תאי סרטן המעי הגס הראשונית לאורך זמן על ידי מספר תאי הזרע הראשוניים מוצגת כאן. מאיור זה ניתן לראות כי מספר הספרואידים הנוצרים תלוי במספר התאים שנזרעו בתחילה בכל באר. ספרואידים מתאי סרטן המעי הגס הראשוניים לאחר 10 ימים בתרבית עם זריעת תאים ראשונית של 2, 000 לכל באר מוצגים כאן.לאחר תרבית ממושכת של ספרואידים מסרטן המעי הגס, הם החלו להיצמד זה לזה ויצרו אשכולות של ספרואידים ומבנים דמויי ענבים שמנעו תרבית הומוגנית ולכן אסרו על השימוש בספרואידים בבדיקות MTT. ההשפעות של פלבוציקליב, סוניטיניב, והשילוב שלהם על ספרואידים מתאי גידול ראשוניים, כולל סרטן המעי הגס וסרטן השד, מוצגות כאן. בדיקת MTT בוצעה על ספרואידים שמקורם בתאי סרטן המעי הגס והשד.אותות MTT נורמלו לערכים מתאים שטופלו ב- DMSO. הערכים מייצגים את האמצעים בין ארבעה לשמונה עותקים משוכפלים. גם השפעות הטיפולים השונים על גדילת התאים הוערכו מיקרוסקופית ביום האפס ולאחר שלושה ימי טיפול בכדורידים שמקורם בסרטן המעי הגס ובתאי סרטן השד.ההשפעות של trastuzumab בתוספת vinorelbine ו 5 fluorouracil בתוספת cisplatin על spheroids נגזר סרטן השד לאורך זמן מוצגים באיור זה. השינוי בקוטר הספרואידים ביחס ליום האפס על ידי משך הטיפול מוצג כאן. כל קבוצת טיפול כללה ארבע עד שש בארות עם ספרואיד אחד בכל באר.השינוי הממוצע מוצג כאן. ספרואידים הם כלים חשובים למחקרים רבים מעבר לתגובה לטיפול אנטי סרטני. מחקרים אלה עוסקים, למשל, בהעברת תרופות ואפילו בשאלות ביולוגיות בסיסיות כגון אינטראקציות בין תאים לתאים.זה קריטי להתחיל תהליך דור spheroid עם השעיה תא יחיד. כמו כן, קריטי להשתמש בלוחות חיבור נמוכים במיוחד עם מדיום המכיל 5% מדדי ממברנה בסיסיים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

תיוג של xenografts הנגזר חולה סרטן השד עם כתבים לעקיבים עבור צמיחת גידולים וגרורים מחקרים

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

בידוד ואפיון של הגידול-ליזום תאים מחולה סרקומה-Xenografts נגזרים

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

רגישות גבוהה זיהוי של Micrometastases שנוצרו על-ידי Organoids Lentivirus transduced GFP תרבותי מגידול נגזר המטופל הגס

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

מחקה וטיפול מטפלזיה Acinar-כדי-Ductal הלבלב בתרבות תלת-ממדי תא

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

מטופל-נגזר אורתוטופית מודלים של תאים האדם Urothelial קרצינומה של סרטן המעי הגס ואת הגידול גרורות ספונטנית

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

החולה הפיזיולוגי הנגזרות 3D Spheroids עבור הקרנת תרופות אנטי-נאופלסטית כדי למקד את תאי גזע הסרטן

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

הקמה ואפיון של המעי הקטן נוירואנדוקרינים הגידול האנדוקרינית

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...