Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
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원발성 종양 세포 배양에 사용된 인간 종양 샘플의 수집은 환자의 서면 동의와 함께 Rabin Medical Center에서 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 연구에 참여할 수 있는 환자는 비전이성 유방암, 결장암, 간암, 폐암, 신경내분비암, 난소암 또는 췌장암, 소아암 또는 전이성 암이 있는 남성 및 여성 성인 및 소아암 환자를 포함했습니다. 유일한 제외 기준은 정보에 입각한 동?...

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	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

본 프로토콜은 인간 종양 샘플로부터 유래된 3D 일차 세포 배양물(스페로이드)을 생성하기 위한 간단한 방법을 설명한다. 이러한 스페로이드는 잠재적인 약물 후보 및 약물 조합 평가, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적 식별, 반응 및 내성 메커니즘 조사를 포함한 다양한 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 환자 샘플에서 직접 파생된 원발성 종양 세포 또는 환자 샘플을 사용하여 확립?...

시험관 내 및 생체 내 연구는 암 치료법 개발을 위한 보완적인 접근 방식을 나타냅니다. 체외 모델은 대부분의 실험 변수를 제어하고 정량적 분석을 용이하게 합니다. 그들은 종종 저비용 스크리닝 플랫폼 역할을 하며 기계론적 연구에도 사용할 수 있습니다1. 그러나, 이들의 생물학적 관련성은 본질적으로 제한적인데, 그러한 모델은 종양 미세환경을 부분적으로만 반영하기 때문이다1. 대조적으로, 환자 유래 이종이식(PDX)과 같은 생체 내 모델은 종양 미세 환경의 복잡성을 포착하고 환자의 중개 연구 및 개별화 치료(즉, 개별 환자에서 파생된 모델에서 약물에 대한 반응 조사)에 더 적합합니다1. 그러나 생체 내 모델은 실험 매개 변수를 시험관 내 모델만큼 엄격하게 제어 할 수 없으며 개발에 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이며 비용이 많이 들기 때문에 약물 스크리닝을위한 고 처리량 접근법에 도움이되지 않습니다 1,2.
시험관 내 모델은 100년 이상 사용되어 왔으며 세포주는 70년 이상 사용되어 왔습니다3. 그러나 지난 수십 년 동안 고형 종양의 시험관 내 모델의 복잡성이 극적으로 증가했습니다. 이러한 복잡성은 종양 유래 확립된 세포주 또는 1차 세포주인 2차원(2D) 배양 모델(단층 구조)에서 3차원(3D) 모델을 포함하는 최신 접근 방식에 이르기까지 다양합니다1. 2D 모델 내에서, 확립된 세포주와 일차 세포주 사이의 중요한 차이점이 있다4. 확립 된 세포주는 불멸화됩니다. 따라서 동일한 세포주를 수년에 걸쳐 전 세계적으로 사용할 수 있으며, 이는 역사적 관점에서 협업, 데이터 축적 및 많은 치료 전략의 개발을 용이하게 합니다. 그러나 이러한 세포주의 유전적 이상은 모든 통과와 함께 축적되어 생물학적 관련성을 손상시킵니다. 또한, 이용가능한 세포주의 제한된 수는 환자에서 종양의 이질성을 반영하지 않는다 4,5. 원발성 암 세포주는 생검, 흉막 삼출액 또는 절제를 통해 얻은 절제된 종양 샘플에서 직접 파생됩니다. 따라서 원발성 암 세포주는 종양 미세 환경 및 종양 특성의 요소, 예를 들어 세포간 행동(예: 건강한 세포와 암세포 간의 누화) 및 암세포의 줄기 유사 표현형을 보존하기 때문에 생물학적으로 더 관련이 있습니다. 그러나, 일차 세포주의 복제 능력은 제한되어 있어 배양 시간이 짧아지고 분석에 사용할 수 있는 종양 세포의 수가 제한된다 4,5.
3D 배양을 사용하는 모델은 생체 내 조건이 유지되기 때문에 2D 배양 모델보다 생물학적으로 더 관련성이 높습니다. 따라서 3D 배양 모델은 자연적인 세포 형태와 성장을 보존하고 저산소증, 괴사 및 세포 부착과 같은 종양 환경의 요소를 복제합니다. 암 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 3D 모델에는 다세포 스페로이드, 스캐폴드 기반 구조 및 매트릭스 내장 배양이 포함됩니다 4,6,7.
현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델(다세포 스페로이드)을 생성하고 세포 생존력 분석(MTT)과 현미경 검사의 두 가지 보완 접근 방식을 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가합니다. 본원에 제시된 대표적인 결과는 유방암 및 결장암; 그러나 이 프로토콜은 다른 고형 종양 유형(예: 담관암, 위암, 폐암 및 췌장암)에 광범위하게 적용할 수 있으며 전문 장비에 의존하지 않고 일반적인 암 연구/세포 생물학 실험실에서 전체를 수행할 수 있기 때문에 비용 효율적입니다. 이 접근법을 사용하여 생성된 다세포 스페로이드는 잠재적인 약물 후보를 평가하고, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적을 식별하고, 반응 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 세 부분으로 나뉩니다: (1) 약물 효능을 테스트하기 위한 모델로 사용하기 위한 준비에서 스페로이드의 생성, 수집 및 계수; (2) 스페로이드에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 MTT 분석; (3) 약물 효능을 평가하기 위한 또 다른 접근 방식으로서 스페로이드를 약물로 처리한 후 형태학적 변화를 현미경으로 평가합니다(그림 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

종양 생물학에 대한 이해의 놀라운 발전에도 불구하고, 임상 시험에 참여하는 종양학 약물 후보의 대다수는 종종 임상 효능의 부족으로 인해 실패합니다. 이 높은 실패율은 주로 종양 이질성과 종양 미세 환경을 반영하는 데 부적절하기 때문에 현재 전임상 모델이 임상 효능을 예측할 수 없음을 보여줍니다. 이러한 한계는 개별 환자에서 추출한 인간 종양 샘플에서 확립된 3차원(3D) 배양 모델(스페로이드)로 해결할 수 있습니다. 이러한 3D 배양은 종양 이질성을 반영하지 않는 기존 세포주보다 실제 생물학을 더 잘 나타냅니다. 또한 3D 배양은 저산소증, 괴사 및 세포 부착과 같은 종양 환경의 요소를 복제하고 자연적인 세포 형태 및 성장을 보존하기 때문에 2차원(2D) 배양 모델(단층 구조)보다 우수합니다. 본 연구에서는 3D 및 다세포 스페로이드에서 성장하는 개별 환자로부터 암세포의 1차 배양물을 제조하는 방법을 개발했습니다. 세포는 환자 종양 또는 환자 유래 이종이식으로부터 직접 유래될 수 있다. 이 방법은 고형 종양(예: 결장, 유방 및 폐)에 광범위하게 적용할 수 있으며 전문 장비에 의존하지 않고 일반적인 암 연구/세포 생물학 실험실에서 전체를 수행할 수 있으므로 비용 효율적입니다. 여기에서는 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델(다세포 스페로이드)을 생성하고 세포 생존력 분석(MTT)과 현미경 검사라는 두 가지 보완 접근 방식을 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이러한 다세포 스페로이드는 잠재적인 약물 후보를 평가하고, 잠재적인 바이오마커 또는 치료 표적을 식별하고, 반응 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 원발성 종양 세포에서 스페로이드의 균질한 배양을 생성하고, 스페로이드 배양에 대한 약물 효능을 정량적으로 평가하고(MTT 분석), 스페로이드 형태에 대한 연구 약물의 효과를 결정하는 절차를 제시합니다. 결장암 및 유방암 세포 배양에서 생성된 스페로이드의 대표적인 실험 데이터가 제시됩니다. 담관암, 위암, 폐암 및 췌장암을 포함한 다른 종양 유형을 사용하여 유사한 실험?...

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Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

우리의 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델의 생성을 설명하기 때문에 중요하며, 이 모델은 세포주보다 실제 종양 생물학을 더 잘 나타냅니다. 이 접근법은 다양한 고형 종양에 적용 할 수 있습니다. 또한 일반적인 세포 생물학 실험실에서 처음부터 끝까지 수행할 수 있으므로 비용 효율적입니다.이 접근법을 사용하여 생성된 3D 종양 모델은 항암 요법 또는 요법의 조합에 대한 종양의 민감도 및 내성에 대한 연구를 지원합니다. 이 접근 방식은 원발성 암세포에서 3D 모델을 생성합니다. 따라서 특정 환자에게 어떤 치료법이 효과적인지 식별하여 치료를 개인화하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Ella Itzhaki가 될 것입니다. 먼저, 단일 세포 부착성 1차 세포 배양이 있는 작은 T25 플라스크를 취하여 세포 배양 배지를 제거합니다. 세포를 PBS로 세척하고, 섭씨 37도에서 3분 동안 1x Accutase 1밀리리터를 첨가하여 75 내지 100% 합류의 부착성 원발성 종양 세포 배양액의 단세포 현탁액을 제조한다.5 밀리리터의 세포 배양 배지를 첨가하여 Accutase 용액을 중화시킨다. 10 밀리리터 혈청 학적 피펫으로 세포를 흡인하고 15 밀리리터 원추형 튜브에 증착합니다. 튜브를 800g에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.세포 배양 배지를 제거하고 세포 펠릿 위에 8밀리리터의 신선한 세포 배양 배지를 추가한 다음 부드럽게 혼합합니다. 혈구계로 생존 가능한 세포를 계산하려면 50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 취하여 50 마이크로 리터의 트리판 블루와 혼합하십시오. 그런 다음 살아있는 세포를 세고 현탁액에 있는 살아있는 세포의 총 수를 계산합니다.다음으로, 3D 배양 배지를 준비한다. 그리고 분석에 필요한 세포 수와 필요한 총 부피를 계산한 후 200마이크로리터의 3D 배양 배지에서 원하는 수의 세포로 세포 현탁액을 준비합니다. 균질한 분포를 보장하기 위해 피펫과 부드럽게 혼합하십시오.현탁액을 피펫팅 저장소로 옮기고, 200 마이크로리터의 세포 현탁액을 다중-채널 피펫을 갖는 초저 부착 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 300g에서 실온에서 10분 동안 원심분리하여 세포의 클러스터링을 시행하여 세포 응집을 개선하고, 플레이트를 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 배양합니다. 다시 300g에서 상온에서 10분간 원심분리한 후 배지의 50%를 부드럽게 제거하여 버리고 100마이크로리터의 신선한 3D 배양액을 첨가하여 기존 용액을 교체합니다.이 단계를 반복하고 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에 다시 넣습니다. 스페로이드 형성을 모니터링하기 위해 1-2일마다 현미경으로 세포를 검사합니다. 이미징 소프트웨어의 스케일 도구를 사용하여 형성된 스페로이드의 직경을 측정합니다.그리고 스페로이드 직경이 100 내지 200 마이크로미터에 도달하면, 약물 효능 실험을 수행한다. 스페로이드 수집의 경우 1, 000 마이크로 리터 피펫을 사용하여 각 웰에서 스페로이드를 수집하고 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 증착합니다. 원뿔형 튜브를 300g에서 실온에서 5분간 원심분리하고, 피펫을 이용하여 상층액을 조심스럽게 흡인하여 버린다.세포 배양 배지 0.5 밀리리터를 첨가하고 펠렛을 잘 그러나 부드럽게 재현탁하십시오. 스페로이드 계수를 수행하려면 96웰 플레이트를 사용하고 웰 밑면에 더하기 기호를 그려 웰을 사분면으로 나눕니다. 50 마이크로 리터의 현탁액을 우물에 첨가하십시오.그리고 10x 대물 렌즈를 사용하여 현미경으로 수동으로 스페로이드를 계수합니다. 각 사분면의 스페로이드를 세고 웰에 있는 총 스페로이드 수를 계산합니다. 그런 다음 부피를 계산하여 스페로이드 수를 두 배로 늘려 스페로이드 농도를 계산하고 현탁액의 총 스페로이드 수를 계산합니다.새 튜브에서 세포 배양 배지 200마이크로리터당 스페로이드 200개 농도의 스페로이드 현탁액을 준비합니다. 각 약물 처리에 대해 다른 튜브에 스페로이드 스톡을 준비하십시오. 반복에 필요한 웰 수로 각 약물에 필요한 총량을 계산하고 필요한 최종 농도까지 튜브에 약물을 추가합니다.200 마이크로리터의 스페로이드 현탁액을 초저 부착 96웰 플레이트의 웰로 옮기고, 5% 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 스페로이드를 연구 약물과 함께 24 내지 72시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 실온에서 5분 동안 300g에서 원심분리하고, 170 마이크로리터의 세포 배양 배지를 부드럽게 제거하고, 웰의 바닥에 30 마이크로리터를 남겼다. MTT 용액을 준비하고, 70 마이크로리터의 용액을 각 웰에 웰 당 100 마이크로리터의 최종 부피에 첨가한다.우물의 최종 MTT 농도는 100 마이크로 리터 당 0.05 밀리그램입니다. 또한 세포가없는 MTT 용액으로 빈 웰을 준비하십시오. 웰 내 용액의 색상 변화가 관찰 될 때까지 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 가습 인큐베이터에서 3-4 시간 동안 플레이트를 배양합니다.변화가 관찰되면 각 웰에 100 마이크로 리터의 정지 용액을 넣고 기포를 생성하지 않고 웰의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 파라미터 ELISA 판독기에서 570 나노미터의 파장 및 630 내지 690 나노미터의 배경 파장에서 플레이트의 흡광도를 판독한다. 세포 생존율을 계산하려면 각 웰에 대한 특정 신호를 계산하십시오.그런 다음 빈 웰의 평균값을 계산하고 각 웰에서이 값을 뺍니다. 연구 약물로 처리되지 않은 세포를 포함하는 대조군 웰에서 특정 신호의 평균을 계산합니다. 마지막으로, 처리되지 않은 세포가 있는 웰에 대한 각 웰의 세포 생존율을 계산합니다.초기 시딩된 세포의 수에 의한 시간 경과에 따른 원발성 결장암 세포 배양으로부터의 스페로이드의 형성이 여기에 표시됩니다. 이 그림에서 생성된 스페로이드의 수는 각 웰에 처음 파종된 세포의 수에 따라 달라진다는 것을 알 수 있습니다. 웰 당 2, 000의 초기 세포 파종으로 배양 10 일 후 원발성 결장암 세포로부터의 스페로이드가 여기에 표시됩니다.결장암 스페로이드의 장기간 배양에 따라, 그들은 서로 부착되기 시작했고 균질한 배양을 방해하는 스페로이드와 포도 같은 구조의 클러스터를 형성하여 MTT 분석에서 스페로이드의 사용을 금지했습니다. 결장암과 유방암을 포함한 원발성 종양 세포의 스페로이드에 대한 palbociclib, sunitinib 및 이들의 조합의 효과가 여기에 나와 있습니다. 결장암 및 유방암 세포에서 유래한 스페로이드에 대해 MTT 분석을 수행했습니다.MTT 신호는 DMSO 처리된 세포로부터의 값으로 표준화되었다. 이 값은 4번에서 8번까지의 반복실험의 평균을 나타냅니다. 세포 성장에 대한 다양한 처리의 효과는 또한 결장암 및 유방암 세포에서 유래한 스페로이드의 치료 0일째와 3일 후에 현미경으로 평가되었습니다.트라스투주맙과 비노렐빈 및 5 플루오로우라실과 시스플라틴이 시간 경과에 따른 유방암 유래 스페로이드에 미치는 영향이 이 그림에 나와 있습니다. 치료 기간에 따른 0일째에 대한 스페로이드 직경의 변화가 여기에 표시됩니다. 각 처리 그룹은 각 웰에 하나의 스페로이드가 있는 4 내지 6개의 웰을 포함하였다.평균 변경 사항이 여기에 표시됩니다. 스페로이드는 항암 치료에 대한 반응을 넘어 많은 연구에서 중요한 도구입니다. 이러한 연구는 예를 들어 약물 전달 및 세포-세포 상호 작용과 같은 기본적인 생물학 질문까지 다룹니다.단일 세포 현탁액으로 스페로이드 생성 공정을 시작하는 것이 중요합니다. 또한 5%basic membrane metrics를 포함하는 매체와 함께 초저 부착 플레이트를 사용하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

종양의 성장과 전이 연구 추적 가능한 기자와 유방암 환자 유래의 이종 이식의 라벨링

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

연구

암 연구학

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

육종 환자 유래 이종이식에서 종양 을 발하는 세포의 격리 및 특성화

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

GFP Lentivirus 불리고 Organoids 환자 파생 결 장 종양에서 경작에 의해 생성 된 Micrometastases의 고감도 검출

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

흉내 낸 고 3 차원 세포 배양에서 췌 장 Acinar-Ductal Metaplasia 조작

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

3차원 스페로이드 배양에서 줄기와 같은 세포의 분리

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...