Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Innsamlingen av humane tumorprøver som ble brukt til de primære tumorcellekulturene ble utført i henhold til IRB-godkjente protokoller ved Rabin Medical Center med skriftlig informert samtykke fra pasientene. Pasienter som var kvalifisert for deltakelse i studien, inkluderte mannlige og kvinnelige voksne og pediatriske kreftpasienter med ikke-metastatisk bryst-, tykktarms-, lever-, lunge-, nevroendokrine, ovarie- eller bukspyttkjertelkreft, barnekreft eller metastatisk kreft. Det eneste eksklusjonskriteriet var mangle...

<ol>
	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

Den foreliggende protokollen beskriver en enkel metode for å generere 3D primære cellekulturer (sfæroider) avledet fra humane tumorprøver. Disse sfæroidene kan brukes til ulike analyser, inkludert evaluering av potensielle legemiddelkandidater og legemiddelkombinasjoner, identifisering av potensielle biomarkører eller terapeutiske mål, og undersøkelse av mekanismer for respons og resistens. Protokollen bruker enten primære tumorceller avledet direkte fra pasientprøver eller tumorceller fra PDX-modeller, som kan...

In vitro og in vivo studier representerer komplementære tilnærminger for å utvikle kreftbehandling. In vitro-modeller muliggjør kontroll av de fleste eksperimentelle variabler og legger til rette for kvantitative analyser. De fungerer ofte som rimelige screeningplattformer og kan også brukes til mekanistiske studier1. Imidlertid er deres biologiske relevans iboende begrenset, da slike modeller bare delvis reflekterer tumormikromiljøet1. In vivo-modeller, som pasientavledede xenotransplantater (PDX), fanger derimot kompleksiteten i tumormikromiljøet og er mer egnet for translasjonsstudier og individualiserende behandling hos pasienter (dvs. undersøkelse av respons på legemidler i en modell avledet fra en individuell pasient)1. In vivo-modeller bidrar imidlertid ikke til høykapasitetstilnærminger for narkotikascreening, ettersom de eksperimentelle parametrene ikke kan kontrolleres like tett som in vitro-modeller, og fordi utviklingen er tidkrevende, arbeidskrevende og kostbar 1,2.
In vitro-modeller har vært tilgjengelige i over 100 år, og cellelinjer har vært tilgjengelige i over 70 år3. I løpet av de siste tiårene har imidlertid kompleksiteten til de tilgjengelige in vitro-modellene av solide svulster økt dramatisk. Denne kompleksiteten spenner fra 2-dimensjonale (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer) som enten er tumoravledede etablerte cellelinjer eller primære cellelinjer til de nyere tilnærmingene som involverer 3-dimensjonale (3D) modeller1. Innenfor 2D-modellene er det et sentralt skille mellom de etablerte og primære cellelinjene4. Etablerte cellelinjer er foreviget; Derfor kan den samme cellelinjen brukes globalt over mange år, noe som i et historisk perspektiv letter samarbeid, akkumulering av data og utvikling av mange behandlingsstrategier. Imidlertid akkumuleres genetiske avvik i disse cellelinjene med hver passasje, og kompromitterer dermed deres biologiske relevans. Videre reflekterer det begrensede antallet tilgjengelige cellelinjer ikke heterogeniteten til svulster hos pasienter 4,5. Primære kreftcellelinjer er avledet direkte fra resekterte tumorprøver oppnådd via biopsier, pleural effusjoner eller reseksjoner. Derfor er primære kreftcellelinjer mer biologisk relevante da de bevarer elementer av tumormikromiljøet og tumoregenskapene, for eksempel intercellulær atferd (f.eks. Kryssprat mellom friske og kreftceller) og de stamlignende fenotypene av kreftceller. Imidlertid er replikasjonskapasiteten til primære cellelinjer begrenset, noe som fører til en smal kulturtid og begrenser antall tumorceller som kan brukes til analyser 4,5.
Modeller som bruker 3D-kulturer er mer biologisk relevante enn 2D-kulturmodeller siden in vivo-betingelsene beholdes. Dermed bevarer 3D-kulturmodeller den naturlige celleformen og veksten og replikerer elementer i tumormiljøet, som hypoksi, nekrose og celleadhesjon. De mest brukte 3D-modellene i kreftforskning inkluderer flercellede sfæroider, stillasbaserte strukturer og matrise-innebygde kulturer 4,6,7.
Den nåværende protokollen genererer 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kreftceller og evaluerer deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av to komplementære tilnærminger: en celle-levedyktighetsanalyse (MTT) og mikroskopiske undersøkelser. De representative resultatene som presenteres her er fra bryst- og tykktarmskreft; Imidlertid er denne protokollen allment anvendelig for andre solide tumortyper (f.eks. Kolangiokarcinom, mage-, lunge- og bukspyttkjertelkreft) og er også kostnadseffektiv, da den kan utføres i sin helhet i et typisk kreftforsknings- / cellebiologilaboratorium uten å stole på spesialutstyr. De multicellulære sfæroidene som genereres ved hjelp av denne tilnærmingen, kan brukes til å vurdere potensielle legemiddelkandidater, identifisere potensielle biomarkører eller terapeutiske mål, og undersøke mekanismene for respons og motstand.
Denne protokollen er delt inn i tre seksjoner: (1) generering, innsamling og telling av sfæroider som forberedelse til bruk som modell for testing av legemiddeleffektivitet; (2) MTT-analyse for å vurdere legemiddeleffekt på sfæroidene; og (3) mikroskopisk evaluering av morfologiske endringer etter behandling av sfæroidene med legemidler som en annen tilnærming for å evaluere legemiddeleffekt (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

Til tross for bemerkelsesverdige fremskritt i forståelsen av tumorbiologi, mislykkes det store flertallet av onkologiske legemiddelkandidater som går inn i kliniske studier, ofte på grunn av mangel på klinisk effekt. Denne høye feilfrekvensen belyser manglende evne til dagens prekliniske modeller til å forutsi klinisk effekt, hovedsakelig på grunn av deres utilstrekkelighet i å reflektere tumorheterogenitet og tumormikromiljøet. Disse begrensningene kan løses med 3-dimensjonale (3D) kulturmodeller (sfæroider) etablert fra humane tumorprøver avledet fra individuelle pasienter. Disse 3D-kulturene representerer virkelighetsbiologi bedre enn etablerte cellelinjer som ikke reflekterer tumorheterogenitet. Videre er 3D-kulturer bedre enn 2-dimensjonale (2D) kulturmodeller (monolagsstrukturer) siden de replikerer elementer i tumormiljøet, som hypoksi, nekrose og celleadhesjon, og bevarer den naturlige celleformen og veksten. I denne studien ble det utviklet en metode for å forberede primære kulturer av kreftceller fra individuelle pasienter som er 3D og vokser i multicellulære sfæroider. Cellene kan utledes direkte fra pasienttumorer eller pasientavledede xenotransplantater. Metoden er allment anvendelig for solide svulster (f.eks. Kolon, bryst og lunge) og er også kostnadseffektiv, da den kan utføres i sin helhet i et typisk kreftforsknings- / cellebiologilaboratorium uten å stole på spesialutstyr. Her presenteres en protokoll for å generere 3D-tumorkulturmodeller (multicellulære sfæroider) fra primære kreftceller og evaluere deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av to komplementære tilnærminger: en celle-levedyktighetsanalyse (MTT) og mikroskopiske undersøkelser. Disse multicellulære sfæroidene kan brukes til å vurdere potensielle legemiddelkandidater, identifisere potensielle biomarkører eller terapeutiske mål, og undersøke mekanismene for respons og resistens.

Denne protokollen presenterer prosedyrer for å generere en homogen kultur av sfæroider fra primære tumorceller, kvantitativt evaluere legemiddeleffekt på sfæroidkultur (MTT-analyse) og bestemme effekten av studiemedisiner på sfæroid morfologi. Data fra representative eksperimenter i sfæroider generert fra kolon- og brystkreftcellekulturer presenteres. Lignende eksperimenter ble utført ved bruk av andre tumortyper, inkludert kolangiokarcinom, mage-, lunge- og bukspyttkjertelkreft (data ikke vist). Alle forsøkene...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Den nåværende protokollen beskriver generering av 3D-tumorkulturmodeller fra primære kreftceller og evaluering av deres følsomhet overfor legemidler ved hjelp av celle-levedyktighetsanalyser og mikroskopiske undersøkelser.

Etablering av 3-dimensjonale sfæroider fra pasientavledede tumorprøver og evaluering av deres følsomhet overfor legemidler

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Vår protokoll er viktig fordi den beskriver en generasjon av 3D-tumorkulturmodeller fra primære kreftceller, og denne modellen representerer den virkelige verdens tumorbiologi bedre enn cellelinjer. Denne tilnærmingen gjelder for en rekke faste svulster. Det er også kostnadseffektivt da det kan utføres fra begynnelse til slutt i et typisk cellebiologisk laboratorium.3D-tumormodellene generert ved hjelp av denne tilnærmingen støtter forskning på følsomhet og motstand av svulster mot kreftbehandlinger eller en kombinasjon av terapier. Denne tilnærmingen genererer 3D-modeller fra primære kreftceller. Derfor kan det identifisere hvilken terapi som sannsynligvis vil være effektiv for en bestemt pasient og dermed bidra til å tilpasse hans eller hennes behandling.Demonstrere prosedyren vil være Ella Itzhaki, en doktorgradsstudent fra laboratoriet mitt. For å begynne, ta en liten T25-kolbe med en enkeltcelle adherent primær cellekultur og fjern cellekulturmediet. Vask cellene med PBS, og tilsett en milliliter 1x Accutase i tre minutter ved 37 grader Celsius for å forberede en enkeltcellesuspensjon av adherente primære tumorcellekulturer på 75 til 100% sammenløp.Nøytraliser Accutase-løsningen ved å tilsette fem milliliter cellekulturmedium. Aspirer cellene med en 10 milliliter serologisk pipette, og legg dem i et 15 milliliter konisk rør. Sentrifuger røret ved 800g i fem minutter ved romtemperatur.Fjern cellekulturmediet, og tilsett åtte milliliter friskt cellekulturmedium på toppen av cellepelleten, og bland deretter forsiktig. For å telle de levedyktige cellene med et hemocytometer, ta en aliquot på 50 mikroliter av cellesuspensjonen og bland den med 50 mikroliter trypanblå. Tell deretter de levende cellene, og beregne totalt antall levende celler i suspensjonen.Deretter forbereder du 3D-kulturmedium. Og etter å ha beregnet antall celler som trengs for analysen og det totale volumet som kreves, må du forberede cellesuspensjon med ønsket antall celler i 200 mikroliter av 3D-kulturmediet. Bland forsiktig med pipetten for å sikre homogen fordeling.Overfør suspensjonen til et pipetteringsreservoar, og tilsett 200 mikroliter av cellesuspensjonen til hver brønn med en 96-brønnsplate med ultralavt vedlegg med en flerkanalspipett. Sentrifuge platen ved 300g i 10 minutter ved romtemperatur for å håndheve klyngen av cellene, og dermed forbedre celleaggregeringen, og inkubere platen ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidfuktet inkubator. Etter sentrifugering igjen ved 300 g i 10 minutter ved romtemperatur, fjern og kast forsiktig 50% av mediet, og tilsett 100 mikroliter friskt 3D-kulturmedium for å erstatte den eksisterende løsningen.Gjenta dette trinnet, og legg platen tilbake i 37 grader Celsius og 5% karbondioksidfuktet inkubator. Inspiser cellene under et mikroskop hver og en til to dager for å overvåke sfæroiddannelse. Mål diameteren på sfæroidene som dannes ved hjelp av skalaverktøyet i bildebehandlingsprogramvaren.Og når sfæroiddiameteren når 100 til 200 mikrometer, utfør stoffeffektforsøkene. For sfæroidoppsamling, bruk en 1.000 mikroliter pipette for å samle sfæroidene fra hver brønn, og sett dem inn i et 15 milliliter konisk rør. Sentrifuger det koniske røret ved 300 g i fem minutter ved romtemperatur, og aspirer og kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette.Tilsett 0,5 ml av cellekulturmediet, og resuspender pelleten godt, men forsiktig. For å utføre sfæroidtelling, bruk en 96-brønnsplate og tegne et plusstegn på undersiden av en brønn for å dele brønnen i kvadranter. Tilsett 50 mikroliter av suspensjonen til brønnen.Og med en 10x objektivlinse, telle sfæroidene manuelt under mikroskopet. Telle sfæroider i hver kvadrant, og beregne totalt antall sfæroider i brønnen. Beregn deretter sfæroidkonsentrasjonen ved å doble sfæroidtallet ved å telle volum, og beregne totalt antall sfæroider i suspensjonen.I et nytt rør, lag sfæroid suspensjon i en konsentrasjon på 200 sfæroider per 200 mikroliter cellekulturmedium. For hver medisinbehandling, lag lageret av sfæroider i et annet rør. Beregn den totale mengden som trengs for hvert legemiddel med antall brønner som trengs for gjentakelser, og legg stoffet til røret til den endelige konsentrasjonen som trengs.Overfør 200 mikroliter av sfæroidsuspensjonen til brønnene i en 96-brønnplate med ultralavt vedlegg, og inkuber platen ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidfuktet inkubator. Etter å ha inkubert sfæroidene med studiemedisinen i 24 til 72 timer, sentrifuger platen ved 300g i fem minutter ved romtemperatur, og fjern forsiktig 170 mikroliter av cellekulturmediet, og etterlater 30 mikroliter på bunnen av brønnen. Forbered MTT-løsningen, og tilsett 70 mikroliter av løsningen til hver brønn til et endelig volum på 100 mikroliter per brønn.Den endelige MTT-konsentrasjonen i brønnen vil være 0, 05 milligram per 100 mikroliter. I tillegg må du forberede blanke brønner med MTT-løsning uten celler. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidfuktet inkubator i tre til fire timer til en endring i oppløsningens farge i brønnene blir observert.Når en endring observeres, tilsett 100 mikroliter Stopp-løsning til hver brønn, og bland innholdet i brønnene forsiktig uten å skape bobler. Les absorbansen av platen i en parameter ELISA-leser ved en bølgelengde på 570 nanometer og en bakgrunnsbølgelengde på 630 til 690 nanometer. For å beregne cellens levedyktighet, beregne det spesifikke signalet for hver brønn.Beregn deretter gjennomsnittsverdien av de tomme brønnene, og trekk denne verdien fra hver brønn. Beregn gjennomsnittet av de spesifikke signalene i kontrollbrønnene som inneholder celler som ikke ble behandlet med studiemedisinen. Til slutt beregner du levedyktigheten til celler i hver brønn i forhold til brønnene med ubehandlede celler.Dannelsen av sfæroider fra en primær tykktarmskreftcellekultur over tid ved antall opprinnelig sådde celler er vist her. Fra denne figuren kan det ses at antall sfæroider generert avhenger av antall celler som opprinnelig ble frøet i hver brønn. Sfæroider fra de primære tykktarmskreftcellene etter 10 dager i kultur med initial cellesåing på 2.000 per brønn er vist her.Ved langvarig kultur av tykktarmskreft sfæroider, begynte de å feste seg til hverandre og dannet klynger av sfæroider og drue-lignende strukturer som forhindret en homogen kultur og dermed forbudt bruk av sfæroider i MTT analyser. Effektene av palbociklib og deres kombinasjon på sfæroider fra primære tumorceller, inkludert tykktarm og brystkreft, er vist her. En MTT-analyse ble utført på sfæroider avledet fra kolon- og brystkreftceller.MTT-signalene ble normalisert til verdier fra DMSO-behandlede celler. Verdiene representerer gjennomsnittet fra fire til åtte replikater. Effekten av de ulike behandlingene på cellevekst ble også evaluert mikroskopisk ved dag null og etter tre dagers behandling av sfæroider avledet fra tykktarmskreft og brystkreftceller.Effektene av trastuzumab pluss vinorelbin og 5 fluorouracil pluss cisplatin på sfæroider avledet fra brystkreft over tid er presentert i denne figuren. Endringen i diameteren av sfæroidene i forhold til dag null ved behandlingens varighet er vist her. Hver behandlingsgruppe omfattet fire til seks brønner med en sfæroid i hver brønn.Den gjennomsnittlige endringen presenteres her. Sfæroider er viktige verktøy for mange studier utover respons på anti-kreftbehandling. Disse studiene adresserer for eksempel legemiddellevering og til og med grunnleggende biologiske spørsmål som celle-celle-interaksjoner.Det er kritisk å starte en sfæroidgenereringsprosess med en enkeltcellesuspensjon. Det er også viktig å bruke ultra-lave festeplater med et medium som inneholder en 5% grunnleggende membranmetrikk.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Merking av brystkreftpasient-avledet xenografter med Spor Reporters for tumorvekst og metastase Studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering og karakterisering av tumor-initiere celler fra sarkom pasient-avledet Xenotransplantater

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Høy følsomhet påvisning av Micrometastases generert av GFP Lentivirus-transduced Organoids kultivert fra en pasient-avledede kolon svulst

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Etterligne og manipulere bukspyttkjertelen Acinar til Ductal Metaplasi i 3-dimensjonale cellekultur

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Pasient-avledet Orthotopic Xenograft modeller for Human Urotelialt Cell kreft og tykktarmskreft tumor vekst og spontan metastasering

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologiske pasient avledet 3D Spheroids for anti-neoplastic Drug screening å målrette Cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering og karakterisering av små tarm Nevroendokrine tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering av Stem-lignende celler fra 3-dimensjonale spheroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Narkotikascreening av primær pasient avledet tumor xenografts i sebrafisk

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay ved bruk av pasientavledede tumororganoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...