Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
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A coleta de amostras de tumores humanos utilizadas para as culturas de células tumorais primárias foi realizada de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê de Revisão Institucional (IRB) no Rabin Medical Center, com consentimento informado por escrito dos pacientes. Os pacientes elegíveis para participação no estudo incluíram pacientes com câncer adulto e pediátrico, de ambos os sexos, com câncer de mama, cólon, fígado, pulmão, neuroendócrino, ovário ou pâncreas não metastático, qualquer câncer ...

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	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. 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J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

O presente protocolo descreve um método simples para gerar culturas de células primárias 3D (esferoides) derivadas de amostras tumorais humanas. Esses esferoides podem ser usados para várias análises, incluindo a avaliação de potenciais candidatos a fármacos e combinações de fármacos, a identificação de potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e a investigação dos mecanismos de resposta e resistência. O protocolo utiliza células tumorais primárias derivadas diretamente de amostras de pacientes ou...

Estudos in vitro e in vivo representam abordagens complementares para o desenvolvimento de tratamentos oncológicos. Os modelos in vitro permitem o controle da maioria das variáveis experimentais e facilitam as análises quantitativas. Muitas vezes servem como plataformas de triagem de baixo custo e também podem ser usadas para estudos mecanísticos1. No entanto, sua relevância biológica é inerentemente limitada, uma vez que tais modelos refletem apenas parcialmente o microambientetumoral1. Em contraste, modelos in vivo, como os xenoenxertos derivados do paciente (PDX), capturam a complexidade do microambiente tumoral e são mais adequados para estudos translacionais e tratamento individualizado em pacientes (ou seja, investigando a resposta a drogas em um modelo derivado de um paciente individual)1. No entanto, os modelos in vivo não são propícios a abordagens de alto rendimento para triagem de drogas, uma vez que os parâmetros experimentais não podem ser controlados tão rigorosamente quanto nos modelos in vitro e porque seu desenvolvimento é demorado, trabalhoso e dispendioso 1,2.
Modelos in vitro estão disponíveis há mais de 100 anos e linhagens celulares estão disponíveis há mais de 70 anos3. Durante as últimas décadas, no entanto, a complexidade dos modelos disponíveis in vitro de tumores sólidos aumentou dramaticamente. Essa complexidade varia desde modelos de cultura 2-dimensional (2D) (estruturas monocamadas) que são linhagens celulares estabelecidas derivadas de tumores ou linhagens celulares primárias até abordagens mais recentes envolvendo modelos 3-dimensionais (3D)1. Dentro dos modelos 2D, uma distinção fundamental é entre as linhagens celulares estabelecidas e primárias4. Linhagens celulares estabelecidas são imortalizadas; Portanto, a mesma linhagem celular pode ser usada globalmente ao longo de muitos anos, o que, de uma perspectiva histórica, facilita a colaboração, o acúmulo de dados e o desenvolvimento de muitas estratégias de tratamento. No entanto, aberrações genéticas nessas linhagens celulares se acumulam a cada passagem, comprometendo sua relevância biológica. Além disso, o número limitado de linhagens celulares disponíveis não reflete a heterogeneidade dos tumores nospacientes4,5. As linhagens celulares primárias de câncer são derivadas diretamente de amostras tumorais ressecadas obtidas por biópsias, derrames pleurais ou ressecções. Portanto, as linhagens primárias de células cancerosas são biologicamente mais relevantes, pois preservam elementos do microambiente tumoral e características tumorais, como comportamentos intercelulares (por exemplo, cross-talk entre células saudáveis e cancerosas) e fenótipos semelhantes a troncos de células cancerosas. No entanto, a capacidade replicativa das linhagens celulares primárias é limitada, o que leva a um tempo de cultivo estreito e limita o número de células tumorais que podem ser utilizadas paraanálises4,5.
Modelos usando culturas 3D são biologicamente mais relevantes do que modelos de cultura 2D, uma vez que as condições in vivo são mantidas. Assim, modelos de cultura 3D preservam a forma e o crescimento natural das células e replicam elementos do ambiente tumoral, como hipóxia, necrose e adesão celular. Os modelos 3D mais comumente usados na pesquisa do câncer incluem esferoides multicelulares, estruturas baseadas em arcabouços e culturas embutidas emmatriz4,6,7.
O presente protocolo gera modelos de cultura tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primárias e avalia sua sensibilidade a drogas usando duas abordagens complementares: um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exames microscópicos. Os resultados representativos aqui apresentados são de câncer de mama e cólon; No entanto, esse protocolo é amplamente aplicável a outros tipos de tumores sólidos (por exemplo, colangiocarcinoma, câncer gástrico, pulmonar e pancreático) e também é custo-efetivo, pois pode ser realizado em sua totalidade em um laboratório típico de pesquisa em câncer/biologia celular sem depender de equipamentos especializados. Os esferoides multicelulares gerados por essa abordagem podem ser usados para avaliar potenciais candidatos a fármacos, identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e investigar os mecanismos de resposta e resistência.
Esse protocolo é dividido em três seções: (1) geração, coleta e contagem dos esferoides em preparação para seu uso como modelo para testar a eficácia de fármacos; (2) ensaio de MTT para avaliar a eficácia da droga sobre os esferoides; e (3) a avaliação microscópica das alterações morfológicas após o tratamento dos esferoides com drogas como outra abordagem para avaliar a eficácia das drogas (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

Apesar dos notáveis avanços na compreensão da biologia tumoral, a grande maioria dos candidatos a medicamentos oncológicos que entram em ensaios clínicos falham, muitas vezes devido à falta de eficácia clínica. Essa alta taxa de falha ilumina a incapacidade dos modelos pré-clínicos atuais em predizer a eficácia clínica, principalmente devido à sua inadequação em refletir a heterogeneidade tumoral e o microambiente tumoral. Essas limitações podem ser abordadas com modelos de cultura tridimensionais (3D) (esferoides) estabelecidos a partir de amostras tumorais humanas derivadas de pacientes individuais. Essas culturas 3D representam melhor a biologia do mundo real do que linhagens celulares estabelecidas que não refletem a heterogeneidade tumoral. Além disso, as culturas 3D são melhores do que os modelos de cultura 2D (estruturas monocamadas), pois replicam elementos do ambiente tumoral, como hipóxia, necrose e adesão celular, e preservam a forma e o crescimento natural da célula. No presente estudo, um método foi desenvolvido para preparar culturas primárias de células cancerosas de pacientes individuais que são 3D e crescem em esferoides multicelulares. As células podem ser derivadas diretamente de tumores de pacientes ou xenoenxertos derivados de pacientes. O método é amplamente aplicável a tumores sólidos (por exemplo, cólon, mama e pulmão) e também é custo-efetivo, pois pode ser realizado em sua totalidade em um laboratório típico de pesquisa de câncer/biologia celular sem depender de equipamentos especializados. Neste trabalho, é apresentado um protocolo para gerar modelos 3D de cultura tumoral (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primárias e avaliar sua sensibilidade a drogas usando duas abordagens complementares: um ensaio de viabilidade celular (MTT) e exames microscópicos. Esses esferoides multicelulares podem ser usados para avaliar potenciais candidatos a fármacos, identificar potenciais biomarcadores ou alvos terapêuticos e investigar os mecanismos de resposta e resistência.

Este protocolo apresenta procedimentos para gerar uma cultura homogênea de esferoides a partir de células tumorais primárias, avaliar quantitativamente a eficácia de drogas em cultura de esferoides (ensaio de MTT) e determinar o efeito de drogas em estudo sobre a morfologia esferoide. Dados representativos de experimentos em esferoides gerados a partir de culturas de células de câncer de cólon e mama são apresentados. Experimentos semelhantes foram realizados usando outros tipos de tumores, incluindo colangiocarc...

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Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Nosso protocolo é significativo porque descreve uma geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias, e este modelo representa melhor a biologia tumoral do mundo real do que as linhagens celulares. Esta abordagem é aplicável a uma variedade de tumores sólidos. Também é custo-efetivo, pois pode ser realizado do início ao fim em um laboratório típico de biologia celular.Os modelos tumorais 3D gerados usando esta abordagem apoiam a pesquisa sobre a sensibilidade e resistência dos tumores a terapias anti-câncer ou a uma combinação de terapias. Esta abordagem gera modelos 3D a partir de células cancerosas primárias. Portanto, poderia identificar qual terapia é provável de ser eficaz para um determinado paciente e, assim, ajudar a personalizar seu tratamento.Quem demonstrará o procedimento será Ella Itzhaki, aluna de doutorado do meu laboratório. Para começar, pegue um pequeno frasco T25 com uma cultura de células primárias aderente de célula única e remova o meio de cultura celular. Lave as células com PBS e adicione um mililitro de 1x Accutase por três minutos a 37 graus Celsius para preparar uma suspensão de célula única de culturas de células tumorais primárias aderentes de 75 a 100% de confluência.Neutralizar a solução de Accutase adicionando cinco mililitros de meio de cultura celular. Aspirar as células com uma pipeta sorológica de 10 mililitros e depositá-las em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo a 800g durante cinco minutos à temperatura ambiente.Retire o meio de cultura celular e adicione oito mililitros de meio de cultura de células frescas em cima do pellet de células e, em seguida, misture suavemente. Para contar as células viáveis com um hemocitômetro, pegue uma alíquota de 50 microlitros da suspensão celular e misture com 50 microlitros de azul de tripano. Em seguida, conte as células vivas e calcule o número total de células vivas na suspensão.Em seguida, prepare o meio de cultura 3D. E após calcular o número de células necessárias para o ensaio e o volume total necessário, preparar a suspensão celular com o número desejado de células em 200 microlitros do meio de cultura 3D. Misture suavemente com a pipeta para garantir uma distribuição homogénea.Transfira a suspensão para um reservatório de pipetagem e adicione 200 microlitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa com uma pipeta multicanal. Centrifugar a placa a 300g durante 10 minutos à temperatura ambiente para reforçar o agrupamento das células, melhorando assim a agregação celular, e incubar a placa a 37 graus Celsius numa incubadora humidificada com dióxido de carbono a 5%. Depois de centrifugar novamente a 300g por 10 minutos à temperatura ambiente, remova e descarte suavemente 50% do meio e adicione 100 microlitros de meio de cultura 3D fresco para substituir a solução existente.Repita este passo e coloque a placa de volta na incubadora umidificada de 37 graus Celsius e dióxido de carbono a 5%. Inspecione as células ao microscópio a cada um a dois dias para monitorar a formação esferoide. Meça o diâmetro dos esferoides formados usando a ferramenta de escala no software de imagem.E quando o diâmetro do esferoide atingir 100 a 200 micrômetros, realize os experimentos de eficácia do medicamento. Para a coleta de esferoides, use uma pipeta de 1.000 microlitros para coletar os esferoides de cada poço e deposite-os em um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o tubo cônico a 300g por cinco minutos à temperatura ambiente e aspirar e descartar cuidadosamente o sobrenadante com pipeta.Adicione 0,5 mililitros do meio de cultura celular e ressuspenda bem o pellet, mas suavemente. Para realizar a contagem esferoide, use uma placa de 96 poços e desenhe um sinal de mais na parte inferior de um poço para dividir o poço em quadrantes. Adicione 50 microlitros da suspensão ao poço.E com uma lente objetiva de 10x, conte os esferoides manualmente sob o microscópio. Conte os esferoides em cada quadrante e calcule o número total de esferoides no poço. Em seguida, calcule a concentração de esferoides dobrando a contagem de esferoides contando o volume e calcule o número total de esferoides na suspensão.Em um novo tubo, preparar a suspensão esferoide a uma concentração de 200 esferoides por 200 microlitros de meio de cultura celular. Para cada tratamento medicamentoso, prepare o estoque de esferoides em um tubo diferente. Calcule a quantidade total necessária para cada droga pelo número de poços necessários para repetições e adicione o fármaco ao tubo até a concentração final necessária.Transfira 200 microlitros da suspensão esferoide para os poços de uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa e incube a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com dióxido de carbono a 5%. Depois de incubar os esferoides com a droga do estudo por 24 a 72 horas, centrifugar a placa a 300g por cinco minutos à temperatura ambiente e remover suavemente 170 microlitros do meio de cultura celular, deixando 30 microlitros no fundo do poço. Prepare a solução MTT e adicione 70 microlitros da solução a cada poço para um volume final de 100 microlitros por poço.A concentração final de MTT no poço será de 0,05 miligramas por 100 microlitros. Além disso, prepare poços em branco com solução de MTT sem células. Incubar a placa a 37 graus Celsius em uma estufa umidificada com dióxido de carbono a 5% por três a quatro horas até que uma mudança na cor da solução nos poços seja observada.Quando uma mudança for observada, adicione 100 microlitros de solução Stop a cada poço e misture suavemente o conteúdo dos poços sem criar bolhas. Leia a absorbância da placa em um leitor ELISA de parâmetro em um comprimento de onda de 570 nanômetros e um comprimento de onda de fundo de 630 a 690 nanômetros. Para calcular a viabilidade celular, calcule o sinal específico para cada poço.Em seguida, calcule o valor médio dos poços em branco e subtraia esse valor de cada poço. Calcular a média dos sinais específicos nos poços de controle que contêm células que não foram tratadas com o medicamento do estudo. Finalmente, calcular a viabilidade das células em cada poço em relação aos poços com células não tratadas.A formação de esferoides a partir de uma cultura primária de células de câncer de cólon ao longo do tempo pelo número de células inicialmente semeadas é mostrada aqui. A partir desta figura, pode-se observar que o número de esferoides gerados depende do número de células inicialmente semeadas em cada poço. Esferoides das células primárias de câncer de cólon após 10 dias em cultura com semeadura inicial de 2.000 células por poço são mostrados aqui.Após a cultura prolongada dos esferoides do câncer de cólon, eles começaram a se ligar uns aos outros e formaram aglomerados de esferoides e estruturas semelhantes a uvas que impediram uma cultura homogênea e, portanto, proibiram o uso dos esferoides nos ensaios de MTT. Os efeitos do palbociclib, sunitinibe e sua combinação em esferoides de células tumorais primárias, incluindo câncer de cólon e mama, são mostrados aqui. Um ensaio de MTT foi conduzido em esferoides derivados de células de câncer de cólon e mama.Os sinais MTT foram normalizados para valores de células tratadas com DMSO. Os valores representam as médias de quatro a oito repetições. Os efeitos dos diversos tratamentos sobre o crescimento celular também foram avaliados microscopicamente no dia zero e após três dias de tratamento dos esferoides derivados de células de câncer de cólon e câncer de mama.Os efeitos do trastuzumabe mais vinorelbina e 5 fluorouracila mais cisplatina sobre esferoides derivados do câncer de mama ao longo do tempo são apresentados nesta figura. A mudança no diâmetro dos esferoides em relação ao dia zero pela duração do tratamento é mostrada aqui. Cada grupo de tratamento incluiu de quatro a seis poços com um esferoide em cada poço.A variação média é apresentada aqui. Os esferoides são ferramentas importantes para muitos estudos além da resposta ao tratamento anticâncer. Esses estudos abordam, por exemplo, a liberação de fármacos e até mesmo questões básicas de biologia, como interações célula-célula.É fundamental iniciar um processo de geração de esferoides com uma suspensão de célula única. Também é fundamental usar placas de fixação ultrabaixas com um meio contendo uma métrica de membrana básica de 5%.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Ensaio in vitro de alta produtividade usando organoides tumorais derivados do paciente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...