Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Никакой.

Сбор образцов опухолей человека, используемых для первичных культур опухолевых клеток, проводился в соответствии с протоколами, одобренными институциональным наблюдательным советом (IRB) в Медицинском центре им. Рабина, с письменного информированного согласия пациентов. Пациенты, име?...

<ol>
	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

Настоящий протокол описывает простой способ получения 3D-первичных клеточных культур (сфероидов), полученных из образцов опухолей человека. Эти сфероиды могут быть использованы для различных анализов, включая оценку потенциальных кандидатов на лекарства и комбинации лекарств, иденти?...

Исследования in vitro и in vivo представляют собой взаимодополняющие подходы к разработке методов лечения рака. Модели in vitro позволяют контролировать большинство экспериментальных переменных и облегчают количественный анализ. Они часто служат недорогими платформами для скрининга, а также могут использоваться для механистических исследований1. Однако их биологическая значимость по своей сути ограничена, поскольку такие модели лишь частично отражают микроокружение опухоли1. Напротив, модели in vivo, такие как ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), фиксируют сложность микроокружения опухоли и больше подходят для трансляционных исследований и индивидуализации лечения у пациентов (т.е. исследования реакции на лекарства в модели, полученной от отдельного пациента)1. Однако модели in vivo не способствуют высокопроизводительным подходам к скринингу лекарств, поскольку экспериментальные параметры не могут контролироваться так же жестко, как модели in vitro, и потому что их разработка требует много времени, труда и средств 1,2.
Модели in vitro доступны уже более 100 лет, а клеточные линии доступны уже более 70 лет3. Однако за последние несколько десятилетий сложность доступных моделей солидных опухолей in vitro резко возросла. Эта сложность варьируется от 2-мерных (2D) моделей культивирования (монослойных структур), которые являются либо укоренившимися клеточными линиями, полученными из опухоли, либо первичными клеточными линиями, до более поздних подходов, включающих 3-мерные (3D) модели1. В 2D-моделях ключевое различие между установленными и первичными клеточными линиями4. Установленные клеточные линии увековечены; Таким образом, одна и та же клеточная линия может использоваться во всем мире в течение многих лет, что с исторической точки зрения облегчает сотрудничество, накопление данных и разработку многих стратегий лечения. Однако генетические аберрации в этих клеточных линиях накапливаются с каждым проходом, что ставит под угрозу их биологическую значимость. Кроме того, ограниченное количество доступных клеточных линий не отражает гетерогенность опухолей у пациентов 4,5. Первичные линии раковых клеток получают непосредственно из резецированных образцов опухолей, полученных с помощью биопсии, плеврального выпота или резекций. Таким образом, первичные линии раковых клеток более биологически значимы, поскольку они сохраняют элементы микроокружения опухоли и характеристики опухоли, такие как межклеточное поведение (например, перекрестные помехи между здоровыми и раковыми клетками) и стволовые фенотипы раковых клеток. Однако репликативная способность первичных клеточных линий ограничена, что приводит к узкому времени культивирования и ограничивает количество опухолевых клеток, которые могут быть использованы для анализов 4,5.
Модели, использующие 3D-культуры, более биологически значимы, чем модели 2D-культур, поскольку сохраняются условия in vivo. Таким образом, 3D-модели культур сохраняют естественную форму и рост клеток и воспроизводят элементы опухолевой среды, такие как гипоксия, некроз и клеточная адгезия. Наиболее часто используемые 3D-модели в исследованиях рака включают многоклеточные сфероиды, структуры на основе скаффолдов и культуры с матрицей 4,6,7.
Настоящий протокол генерирует 3D-модели опухолевых культур (многоклеточных сфероидов) из первичных раковых клеток и оценивает их чувствительность к лекарственным средствам с использованием двух взаимодополняющих подходов: анализа жизнеспособности клеток (МТТ) и микроскопических исследований. Репрезентативные результаты, представленные в настоящем документе, относятся к раку молочной железы и толстой кишки; Тем не менее, этот протокол широко применим к другим типам солидных опухолей (например, холангиокарциноме, раку желудка, легких и поджелудочной железы), а также является экономически эффективным, поскольку он может быть выполнен полностью в типичной лаборатории исследования рака / клеточной биологии, не полагаясь на специализированное оборудование. Многоклеточные сфероиды, полученные с использованием этого подхода, могут быть использованы для оценки потенциальных кандидатов на лекарственные средства, выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических мишеней, а также для исследования механизмов ответа и резистентности.
Этот протокол разделен на три раздела: (1) генерация, сбор и подсчет сфероидов при подготовке к их использованию в качестве модели для тестирования эффективности лекарств; (2) анализ МТТ для оценки эффективности лекарственного средства на сфероидах; и (3) микроскопическая оценка морфологических изменений после обработки сфероидов лекарственными препаратами в качестве еще одного подхода к оценке эффективности лекарственного средства (рис. 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

Несмотря на замечательные успехи в понимании биологии опухоли, подавляющее большинство кандидатов на онкологические препараты, участвующие в клинических испытаниях, терпят неудачу, часто из-за отсутствия клинической эффективности. Эта высокая частота неудач подчеркивает неспособность современных доклинических моделей предсказывать клиническую эффективность, главным образом из-за их неадекватности в отражении гетерогенности опухоли и микроокружения опухоли. Эти ограничения могут быть устранены с помощью 3-мерных (3D) культуральных моделей (сфероидов), созданных из образцов опухолей человека, полученных от отдельных пациентов. Эти 3D-культуры представляют реальную биологию лучше, чем установленные клеточные линии, которые не отражают гетерогенность опухоли. Кроме того, 3D-культуры лучше, чем 2-мерные (2D) модели культур (монослойные структуры), поскольку они воспроизводят элементы опухолевой среды, такие как гипоксия, некроз и клеточная адгезия, и сохраняют естественную форму и рост клеток. В настоящем исследовании был разработан метод получения первичных культур раковых клеток от отдельных пациентов, которые являются 3D и растут в многоклеточных сфероидах. Клетки могут быть получены непосредственно из опухолей пациента или ксенотрансплантатов, полученных от пациентов. Метод широко применим к солидным опухолям (например, толстой кишки, молочной железы и легких), а также является экономически эффективным, поскольку он может быть выполнен в полном объеме в типичной лаборатории исследования рака / клеточной биологии, не полагаясь на специализированное оборудование. Представлен протокол генерации 3D-моделей опухолевых культур (многоклеточных сфероидов) из первичных раковых клеток и оценки их чувствительности к лекарственным препаратам с использованием двух взаимодополняющих подходов: анализа жизнеспособности клеток (МТТ) и микроскопических исследований. Эти многоклеточные сфероиды могут быть использованы для оценки потенциальных кандидатов в лекарства, выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических мишеней, а также для исследования механизмов ответа и резистентности.

В этом протоколе представлены процедуры получения гомогенной культуры сфероидов из первичных опухолевых клеток, количественной оценки эффективности препарата на культуре сфероидов (анализ МТТ) и определения влияния исследуемых препаратов на морфологию сфероидов. Представлены данн?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Настоящий протокол описывает создание 3D-моделей опухолевых культур из первичных раковых клеток и оценку их чувствительности к лекарственным средствам с использованием анализов жизнеспособности клеток и микроскопических исследований.

Создание 3-мерных сфероидов из образцов опухолей, полученных от пациентов, и оценка их чувствительности к лекарствам

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Наш протокол важен, потому что он описывает поколение 3D-моделей опухолевых культур из первичных раковых клеток, и эта модель представляет реальную биологию опухоли лучше, чем клеточные линии. Этот подход применим к различным солидным опухолям. Это также экономически выгодно, так как может быть выполнено от начала до конца в типичной лаборатории клеточной биологии.3D-модели опухолей, созданные с использованием этого подхода, поддерживают исследования чувствительности и резистентности опухолей к противораковой терапии или комбинации методов лечения. Этот подход генерирует 3D-модели из первичных раковых клеток. Таким образом, он может определить, какая терапия может быть эффективной для определенного пациента, и, таким образом, помочь персонализировать его или ее лечение.Продемонстрировать процедуру будет Элла Ицхаки, аспирант из моей лаборатории. Для начала возьмите небольшую колбу T25 с одноклеточной адгезивной первичной клеточной культурой и удалите среду для клеточных культур. Промойте клетки PBS и добавьте один миллилитр 1x Accutase в течение трех минут при 37 градусах Цельсия, чтобы приготовить одноклеточную суспензию адгезивных первичных опухолевых клеточных культур с 75-100% слиянием.Нейтрализуйте раствор Аккутазы, добавив пять миллилитров среды для культивирования клеток. Аспирируйте клетки с помощью серологической пипетки объемом 10 миллилитров и поместите их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 800 г в течение пяти минут при комнатной температуре.Удалите среду для культивирования клеток и добавьте восемь миллилитров свежей среды для культивирования клеток поверх гранулы клеток, затем аккуратно перемешайте. Чтобы подсчитать жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра, возьмите аликвоту из 50 микролитров клеточной суспензии и смешайте ее с 50 микролитрами трипанового синего. Затем подсчитайте живые клетки и рассчитайте общее количество живых клеток в суспензии.Далее подготовьте 3D-питательную среду. И после расчета количества клеток, необходимых для анализа, и общего требуемого объема, приготовьте клеточную суспензию с нужным количеством клеток в 200 микролитрах 3D-питательной среды. Аккуратно перемешайте пипеткой, чтобы обеспечить однородное распределение.Перенесите суспензию в резервуар для пипетки, и добавьте по 200 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку сверхнизкой насадки 96-луночной пластины с многоканальной пипеткой. Центрифугируйте пластину при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы усилить кластеризацию клеток, тем самым улучшая агрегацию клеток, и инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в 5%-ном инкубаторе, увлажненном углекислым газом. После повторного центрифугирования при 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре осторожно удалите и выбросьте 50% среды и добавьте 100 микролитров свежей 3D-питательной среды, чтобы заменить существующий раствор.Повторите этот шаг и поместите тарелку обратно в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% увлажненным углекислым газом. Осматривайте клетки под микроскопом каждые один-два дня, чтобы контролировать образование сфероидов. Измерьте диаметр сформированных сфероидов с помощью инструмента масштабирования в программном обеспечении для обработки изображений.И как только диаметр сфероида достигнет 100-200 микрометров, проведите эксперименты по эффективности препарата. Для сбора сфероидов используйте пипетку объемом 1 000 микролитров, чтобы собрать сфероиды из каждой лунки и поместить их в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте коническую пробирку при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре, тщательно аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.Добавьте 0,5 миллилитра среды для культивирования клеток и хорошо и осторожно ресуспендируйте гранулу. Чтобы выполнить подсчет сфероидов, используйте табличку с 96 лунками и нарисуйте знак плюса на нижней стороне лунки, чтобы разделить скважину на квадранты. Добавьте в лунку 50 микролитров суспензии.А с 10-кратным объективом подсчитайте сфероиды вручную под микроскопом. Подсчитайте сфероиды в каждом квадранте и рассчитайте общее количество сфероидов в лунке. Затем рассчитайте концентрацию сфероидов, удвоив количество сфероидов, подсчитав объем, и рассчитайте общее количество сфероидов во взвешенной суспензии.В новой пробирке готовят сфероидную суспензию в концентрации 200 сфероидов на 200 микролитров питательной среды клеток. Для каждого медикаментозного лечения подготовьте запас сфероидов в разной пробирке. Рассчитайте общее количество, необходимое для каждого препарата, по количеству лунок, необходимых для повторов, и добавьте лекарство в пробирку до конечной необходимой концентрации.Перенесите 200 микролитров сфероидной суспензии в лунки 96-луночной пластины со сверхнизкой насадкой и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия в 5%-ном инкубаторе, увлажненном углекислым газом. После инкубации сфероидов с исследуемым препаратом в течение 24-72 часов центрифугируют пластину при 300 г в течение пяти минут при комнатной температуре и осторожно удаляют 170 микролитров среды для культивирования клеток, оставляя 30 микролитров на дне лунки. Приготовьте раствор МТТ и добавьте 70 микролитров раствора в каждую лунку до конечного объема 100 микролитров на лунку.Конечная концентрация МТТ в лунке составит 0,05 миллиграмма на 100 микролитров. Кроме того, подготовьте заготовки с раствором МТТ без ячеек. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в 5%-ном инкубаторе, увлажненном углекислым газом, в течение трех-четырех часов, пока не будет наблюдаться изменение цвета раствора в лунках.При наблюдении изменения добавьте в каждую лунку по 100 микролитров раствора Стопа, и аккуратно перемешайте содержимое лунок, не создавая пузырьков. Считайте поглощение пластины в считывателе параметров ИФА на длине волны 570 нанометров и фоновой длине волны от 630 до 690 нанометров. Чтобы рассчитать жизнеспособность клеток, рассчитайте конкретный сигнал для каждой скважины.Затем вычислите среднее значение пустых скважин и вычтите это значение из каждой скважины. Рассчитайте среднее значение специфических сигналов в контрольных лунках, содержащих клетки, которые не были обработаны исследуемым препаратом. Наконец, рассчитайте жизнеспособность клеток в каждой лунке относительно лунок с необработанными клетками.Здесь показано образование сфероидов из первичной культуры клеток рака толстой кишки с течением времени по количеству первоначально засеянных клеток. Из этого рисунка видно, что количество генерируемых сфероидов зависит от количества клеток, изначально засеянных в каждую лунку. Здесь показаны сфероиды из клеток первичного рака толстой кишки после 10 дней в культуре с начальным засевом клеток 2 000 на лунку.При длительном культивировании сфероидов рака толстой кишки они начали прикрепляться друг к другу и образовывали скопления сфероидов и виноградоподобных структур, которые препятствовали однородной культуре и, таким образом, запрещали использование сфероидов в анализах МТТ. Показано влияние палбоциклиба, сунитиниба и их комбинации на сфероиды из первичных опухолевых клеток, включая рак толстой кишки и молочной железы. Анализ МТТ был проведен на сфероидах, полученных из клеток рака толстой кишки и молочной железы.Сигналы МТТ были нормализованы до значений клеток, обработанных ДМСО. Значения представляют собой среднее значение от четырех до восьми реплик. Влияние различных методов лечения на рост клеток также оценивалось микроскопически на нулевой день и после трех дней лечения сфероидов, полученных из клеток рака толстой кишки и рака молочной железы.На этом рисунке представлено влияние трастузумаба плюс винорелбин и 5-фторурацила плюс цисплатин на сфероиды, полученные при раке молочной железы с течением времени. Здесь показано изменение диаметра сфероидов относительно нулевого дня по продолжительности лечения. Каждая группа лечения включала от четырех до шести лунок с одним сфероидом в каждой лунке.Среднее изменение представлено здесь. Сфероиды являются важными инструментами для многих исследований, помимо ответа на противораковое лечение. Эти исследования касаются, например, доставки лекарств и даже основных вопросов биологии, таких как межклеточные взаимодействия.Очень важно начать процесс генерации сфероидов с одноклеточной суспензии. Также крайне важно использовать пластины со сверхнизким креплением со средой, содержащей 5%-ную базовую мембрану.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Маркировку рака молочной железы на пациента получены ксенотрансплантатов с прослеживаемы Репортеров для опухолевого роста и метастазирования исследований

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Изоляция и характеристика опухолевых клеток от саркомы пациента полученных Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Высокая чувствительность обнаружения микрометастазы, порожденных GFP человека преобразованы Organoids культивированный от опухоли пациента производные Колон

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Подражая и манипулирования поджелудочной железы ацинарной протоковой метаплазии в 3-мерной клеточной культуре

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Пациент полученных ортотопические ксенотрансплантат Модели для человека Уротелиальной карциномы клеток и колоректального рака опухоли роста и спонтанного метастаза

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Физиологические пациент выведенных 3D сфероидов для анти-неопластических наркотиков скрининга целевой рак стволовых клеток

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Создание и характеристика малого кишечника нейроэндокринных опухолевых сфероидов

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Изоляция стволовых клеток от трехмерных сфероидных культур

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Скрининг наркотиков первичного пациента, полученных опухоли Xenografts в зебрафиш

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...