Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
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La recolección de muestras de tumores humanos utilizados para los cultivos de células tumorales primarias se realizó según los protocolos aprobados por la junta de revisión institucional (IRB) en el Centro Médico Rabin con el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Los pacientes elegibles para participar en el estudio incluyeron hombres y mujeres adultos y pacientes pediátricos con cáncer de mama, colon, hígado, pulmón, neuroendocrino, ovario o páncreas no metastásico, cualquier cáncer pediát...

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	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

El presente protocolo describe un método simple para generar cultivos celulares primarios 3D (esferoides) derivados de muestras de tumores humanos. Estos esferoides se pueden utilizar para diversos análisis, incluida la evaluación de posibles candidatos a fármacos y combinaciones de fármacos, la identificación de posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, y la investigación de los mecanismos de respuesta y resistencia. El protocolo utiliza células tumorales primarias derivadas directamente de muestras de p...

Los estudios in vitro e in vivo representan enfoques complementarios para desarrollar tratamientos contra el cáncer. Los modelos in vitro permiten el control de la mayoría de las variables experimentales y facilitan los análisis cuantitativos. A menudo sirven como plataformas de detección de bajo costo y también se pueden utilizar para estudios mecanicistas1. Sin embargo, su relevancia biológica es inherentemente limitada, ya que tales modelos sólo reflejan parcialmente el microambiente tumoral1. Por el contrario, los modelos in vivo, como los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), capturan la complejidad del microambiente tumoral y son más adecuados para estudios traslacionales y tratamiento individualizado en pacientes (es decir, investigar la respuesta a fármacos en un modelo derivado de un paciente individual)1. Sin embargo, los modelos in vivo no son propicios para enfoques de alto rendimiento para el cribado de fármacos, ya que los parámetros experimentales no pueden controlarse tan estrechamente como en los modelos in vitro y porque su desarrollo requiere mucho tiempo, requiere mucha mano de obra y es costoso 1,2.
Los modelos in vitro han estado disponibles por más de 100 años, y las líneas celulares han estado disponibles por más de 70 años3. Durante las últimas décadas, sin embargo, la complejidad de los modelos in vitro disponibles de tumores sólidos ha aumentado dramáticamente. Esta complejidad abarca desde modelos de cultivo bidimensionales (2D) (estructuras monocapa) que son líneas celulares establecidas derivadas de tumores o líneas celulares primarias hasta los enfoques más recientes que involucran modelos tridimensionales (3D)1. Dentro de los modelos 2D, una distinción clave es entre las líneas celulares establecidas y primarias4. Las líneas celulares establecidas son inmortalizadas; Por lo tanto, la misma línea celular se puede utilizar globalmente durante muchos años, lo que desde una perspectiva histórica, facilita la colaboración, la acumulación de datos y el desarrollo de muchas estrategias de tratamiento. Sin embargo, las aberraciones genéticas en estas líneas celulares se acumulan con cada paso, comprometiendo así su relevancia biológica. Además, el número limitado de líneas celulares disponibles no refleja la heterogeneidad de los tumores en los pacientes 4,5. Las líneas celulares de cáncer primario se derivan directamente de muestras tumorales resecadas obtenidas mediante biopsias, derrames pleurales o resecciones. Por lo tanto, las líneas celulares de cáncer primario son biológicamente más relevantes ya que preservan elementos del microambiente tumoral y las características del tumor, como los comportamientos intercelulares (por ejemplo, la diafonía entre células sanas y cancerosas) y los fenotipos similares a los vástagos de las células cancerosas. Sin embargo, la capacidad replicativa de las líneas celulares primarias es limitada, lo que conduce a un tiempo de cultivo estrecho y limita el número de células tumorales que pueden ser utilizadas para los análisis 4,5.
Los modelos que utilizan cultivos 3D son biológicamente más relevantes que los modelos de cultivo 2D, ya que se conservan las condiciones in vivo. Por lo tanto, los modelos de cultivo 3D preservan la forma y el crecimiento natural de las células y replican elementos del entorno tumoral, como la hipoxia, la necrosis y la adhesión celular. Los modelos 3D más utilizados en la investigación del cáncer incluyen esferoides multicelulares, estructuras basadas en andamios y cultivos incrustados en matrices 4,6,7.
El presente protocolo genera modelos de cultivo tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primarias y evalúa su sensibilidad a los fármacos utilizando dos enfoques complementarios: un ensayo de viabilidad celular (MTT) y exámenes microscópicos. Los resultados representativos presentados en este documento son de cáncer de mama y colon; Sin embargo, este protocolo es ampliamente aplicable a otros tipos de tumores sólidos (por ejemplo, colangiocarcinoma, cáncer gástrico, de pulmón y de páncreas) y también es rentable, ya que se puede realizar en su totalidad en un laboratorio típico de investigación / biología celular del cáncer sin depender de equipos especializados. Los esferoides multicelulares generados utilizando este enfoque se pueden utilizar para evaluar posibles candidatos a fármacos, identificar posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos e investigar los mecanismos de respuesta y resistencia.
Este protocolo se divide en tres secciones: (1) la generación, recolección y conteo de los esferoides en preparación para su uso como modelo para probar la eficacia del fármaco; (2) ensayo MTT para evaluar la eficacia del fármaco en los esferoides; y (3) la evaluación microscópica de los cambios morfológicos después del tratamiento de los esferoides con fármacos como otro enfoque para evaluar la eficacia del fármaco (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

A pesar de los notables avances en la comprensión de la biología tumoral, la gran mayoría de los candidatos a fármacos oncológicos que ingresan a los ensayos clínicos fracasan, a menudo debido a la falta de eficacia clínica. Esta alta tasa de fracaso ilumina la incapacidad de los modelos preclínicos actuales para predecir la eficacia clínica, principalmente debido a su insuficiencia para reflejar la heterogeneidad tumoral y el microambiente tumoral. Estas limitaciones se pueden abordar con modelos de cultivo tridimensionales (3D) (esferoides) establecidos a partir de muestras de tumores humanos derivados de pacientes individuales. Estos cultivos 3D representan la biología del mundo real mejor que las líneas celulares establecidas que no reflejan la heterogeneidad tumoral. Además, los cultivos 3D son mejores que los modelos de cultivo bidimensionales (2D) (estructuras monocapa), ya que replican elementos del entorno tumoral, como hipoxia, necrosis y adhesión celular, y preservan la forma y el crecimiento natural de las células. En el presente estudio, se desarrolló un método para preparar cultivos primarios de células cancerosas de pacientes individuales que son 3D y crecen en esferoides multicelulares. Las células pueden derivarse directamente de tumores de pacientes o xenoinjertos derivados de pacientes. El método es ampliamente aplicable a tumores sólidos (por ejemplo, colon, mama y pulmón) y también es rentable, ya que se puede realizar en su totalidad en un laboratorio típico de investigación / biología celular del cáncer sin depender de equipos especializados. En este documento, se presenta un protocolo para generar modelos de cultivo tumoral 3D (esferoides multicelulares) a partir de células cancerosas primarias y evaluar su sensibilidad a los medicamentos utilizando dos enfoques complementarios: un ensayo de viabilidad celular (MTT) y exámenes microscópicos. Estos esferoides multicelulares se pueden utilizar para evaluar posibles candidatos a fármacos, identificar posibles biomarcadores u objetivos terapéuticos, e investigar los mecanismos de respuesta y resistencia.

Este protocolo presenta procedimientos para generar un cultivo homogéneo de esferoides a partir de células tumorales primarias, evaluar cuantitativamente la eficacia del fármaco en el cultivo de esferoides (ensayo MTT) y determinar el efecto de los fármacos del estudio sobre la morfología del esferoide. Se presentan los datos de los experimentos representativos en esferoides generados a partir de cultivos celulares de cáncer de colon y mama. Se realizaron experimentos similares con otros tipos de tumores, incluidos...

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Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Nuestro protocolo es significativo porque describe una generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias, y este modelo representa la biología tumoral del mundo real mejor que las líneas celulares. Este enfoque es aplicable a una variedad de tumores sólidos. También es rentable, ya que se puede realizar de principio a fin en un laboratorio típico de biología celular.Los modelos tumorales 3D generados utilizando este enfoque apoyan la investigación sobre la sensibilidad y la resistencia de los tumores a las terapias contra el cáncer o una combinación de terapias. Este enfoque genera modelos 3D a partir de células cancerosas primarias. Por lo tanto, podría identificar qué terapia es probable que sea efectiva para un determinado paciente y, por lo tanto, ayudar a personalizar su tratamiento.Demostrando el procedimiento estará Ella Itzhaki, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, tome un matraz T25 pequeño con un cultivo celular primario adherente de una sola célula y retire los medios de cultivo celular. Lave las células con PBS y agregue un mililitro de 1x Accutase durante tres minutos a 37 grados centígrados para preparar una suspensión unicelular de cultivos de células tumorales primarias adherentes de 75 a 100% de confluencia.Neutralizar la solución Accutase añadiendo cinco mililitros de medio de cultivo celular. Aspirar las células con una pipeta serológica de 10 mililitros y depositarlas en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 800 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.Retire el medio de cultivo celular y agregue ocho mililitros de medio de cultivo celular fresco sobre el pellet celular, luego mezcle suavemente. Para contar las células viables con un hemocitómetro, tome una alícuota de 50 microlitros de la suspensión celular y mézclela con 50 microlitros de azul de tripano. Luego cuente las celdas vivas y calcule el número total de celdas vivas en la suspensión.A continuación, prepare el medio de cultivo 3D. Y después de calcular el número de células necesarias para el ensayo y el volumen total requerido, prepare la suspensión celular con el número deseado de células en 200 microlitros del medio de cultivo 3D. Mezclar suavemente con la pipeta para asegurar una distribución homogénea.Transfiera la suspensión a un depósito de pipeteo y agregue 200 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja con una pipeta multicanal. Centrifugar la placa a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para reforzar la agrupación de las células, mejorando así la agregación celular, e incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. Después de centrifugar nuevamente a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, retire y deseche suavemente el 50% del medio, y agregue 100 microlitros de medio de cultivo 3D fresco para reemplazar la solución existente.Repita este paso y vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Inspeccione las células bajo un microscopio cada uno o dos días para controlar la formación de esferoides. Mida el diámetro de los esferoides formados utilizando la herramienta de escala en el software de imágenes.Y una vez que el diámetro del esferoide alcanza de 100 a 200 micrómetros, realice los experimentos de eficacia del medicamento. Para la recolección de esferoides, use una pipeta de 1, 000 microlitros para recolectar los esferoides de cada pocillo y depositarlos en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo cónico a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente, y aspirar y desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.Agregue 0,5 mililitros del medio de cultivo celular y vuelva a suspender el pellet bien pero suavemente. Para realizar el conteo de esferoides, use una placa de 96 pocillos y dibuje un signo más en la parte inferior de un pozo para dividir el pozo en cuadrantes. Agregue 50 microlitros de la suspensión al pozo.Y con una lente de objetivo 10x, cuente los esferoides manualmente bajo el microscopio. Cuente los esferoides en cada cuadrante y calcule el número total de esferoides en el pozo. Luego calcule la concentración de esferoides duplicando el recuento de esferoides contando el volumen y calcule el número total de esferoides en la suspensión.En un tubo nuevo, prepare la suspensión esferoide a una concentración de 200 esferoides por 200 microlitros de medio de cultivo celular. Para cada tratamiento farmacológico, prepare el stock de esferoides en un tubo diferente. Calcule la cantidad total necesaria para cada medicamento por el número de pocillos necesarios para las repeticiones, y agregue el medicamento al tubo a la concentración final necesaria.Transfiera 200 microlitros de la suspensión esferoide a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja e incube la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. Después de incubar los esferoides con el fármaco del estudio durante 24 a 72 horas, centrifugar la placa a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar suavemente 170 microlitros del medio de cultivo celular, dejando 30 microlitros en el fondo del pozo. Prepare la solución MTT y agregue 70 microlitros de la solución a cada pocillo a un volumen final de 100 microlitros por pocillo.La concentración final de MTT en el pozo será de 0,05 miligramos por 100 microlitros. Además, prepare pocillos en blanco con solución MTT sin células. Incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante tres o cuatro horas hasta que se observe un cambio en el color de la solución en los pocillos.Cuando se observe un cambio, agregue 100 microlitros de solución Stop a cada pocillo y mezcle suavemente el contenido de los pocillos sin crear burbujas. Lea la absorbancia de la placa en un lector ELISA de parámetros a una longitud de onda de 570 nanómetros y una longitud de onda de fondo de 630 a 690 nanómetros. Para calcular la viabilidad celular, calcule la señal específica para cada pozo.Luego calcule el valor promedio de los pozos en blanco y reste este valor de cada pozo. Calcular el promedio de las señales específicas en los pocillos de control que contienen células que no fueron tratadas con el fármaco del estudio. Finalmente, calcule la viabilidad de las células en cada pocillo en relación con los pocillos con células no tratadas.La formación de esferoides a partir de un cultivo primario de células de cáncer de colon a lo largo del tiempo por el número de células inicialmente sembradas se muestra aquí. A partir de esta figura, se puede ver que el número de esferoides generados depende del número de células inicialmente sembradas en cada pozo. Aquí se muestran los esferoides de las células primarias de cáncer de colon después de 10 días en cultivo con una siembra celular inicial de 2, 000 por pocillo.Tras el cultivo prolongado de los esferoides de cáncer de colon, comenzaron a unirse entre sí y formaron grupos de esferoides y estructuras similares a uvas que impidieron un cultivo homogéneo y, por lo tanto, prohibieron el uso de los esferoides en los ensayos MTT. Los efectos de palbociclib, sunitinib y su combinación en los esferoides de las células tumorales primarias, incluyendo el cáncer de colon y de mama, se muestran aquí. Se realizó un ensayo MTT en esferoides derivados de células de cáncer de colon y mama.Las señales MTT se normalizaron a valores de células tratadas con DMSO. Los valores representan las medias de cuatro a ocho réplicas. Los efectos de los diversos tratamientos sobre el crecimiento celular también se evaluaron microscópicamente en el día cero y después de tres días de tratamiento de los esferoides derivados del cáncer de colon y las células de cáncer de mama.En esta figura se presentan los efectos de trastuzumab más vinorelbina y 5 fluorouracilo más cisplatino sobre los esferoides derivados del cáncer de mama a lo largo del tiempo. El cambio en el diámetro de los esferoides en relación con el día cero por la duración del tratamiento se muestra aquí. Cada grupo de tratamiento incluyó de cuatro a seis pocillos con un esferoide en cada pozo.El cambio promedio se presenta aquí. Los esferoides son herramientas importantes para muchos estudios más allá de la respuesta al tratamiento contra el cáncer. Estos estudios abordan, por ejemplo, la administración de fármacos e incluso cuestiones básicas de biología, como las interacciones célula-célula.Es fundamental iniciar un proceso de generación de esferoides con una suspensión de una sola célula. También es fundamental utilizar placas de fijación ultra bajas con un medio que contenga un 5% de métricas básicas de membrana.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Etiquetado de los xenoinjertos derivados de los pacientes con cáncer de mama Trazables Reporteros para el crecimiento tumoral y la metástasis Estudios

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

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Aislamiento y caracterización de células que inician tumores a partir de xenoinjertos derivados del paciente de sarcoma

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Alta sensibilidad detección de micrometástasis de GFP Lentivirus-transduced organitas cultivados de un Tumor de Colon paciente derivado

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Imitando y manipulando Metaplasia pancreática Acinar Ductal en cultivo celular 3-dimensional

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Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

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Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Establecimiento y caracterización de esferoides de tumores neuroendocrinos de intestino delgado

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High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Ensayo in vitro de alto rendimiento utilizando organoides tumorales derivados del paciente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...