Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Insamlingen av humana tumörprover som används för de primära tumörcellkulturerna utfördes enligt institutionella granskningsnämndens (IRB) godkända protokoll vid Rabin Medical Center med skriftligt informerat samtycke från patienterna. Patienter som var lämpliga att delta i studien inkluderade manliga och kvinnliga vuxna och pediatriska cancerpatienter med icke-metastaserande bröst-, kolon-, lever-, lung-, neuroendokrina, äggstocks- eller bukspottkörtelcancer, någon barncancer eller någon metastaserad canc...

<ol>
	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

Detta protokoll beskriver en enkel metod för att generera primära 3D-cellkulturer (sfäroider) härledda från humana tumörprover. Dessa sfäroider kan användas för olika analyser, inklusive utvärdering av potentiella läkemedelskandidater och läkemedelskombinationer, identifiering av potentiella biomarkörer eller terapeutiska mål och undersökning av mekanismerna för respons och resistens. Protokollet använder antingen primära tumörceller som härrör direkt från patientprover eller tumörceller från PDX-...

In vitro- och in vivo-studier representerar kompletterande metoder för att utveckla cancerbehandlingar. In vitro-modeller möjliggör kontroll av de flesta experimentella variabler och underlättar kvantitativa analyser. De fungerar ofta som billiga screeningplattformar och kan också användas för mekanistiska studier1. Deras biologiska relevans är emellertid i sig begränsad, eftersom sådana modeller endast delvis återspeglar tumörmikromiljön1. Däremot fångar in vivo-modeller, såsom patient-derived xenografts (PDX), komplexiteten i tumörmikromiljön och är mer lämpade för translationella studier och individualiserande behandling hos patienter (dvs. undersöker svaret på läkemedel i en modell härledd från en enskild patient)1. In vivo-modeller bidrar dock inte till metoder med hög kapacitet för läkemedelsscreening, eftersom de experimentella parametrarna inte kan kontrolleras lika noggrant som i in vitro-modeller och eftersom deras utveckling är tidskrävande, arbetsintensiv och kostsam 1,2.
In vitro-modeller har funnits i över 100 år, och cellinjer har funnits i över 70 år3. Under de senaste decennierna har dock komplexiteten hos de tillgängliga in vitro-modellerna av solida tumörer ökat dramatiskt. Denna komplexitet sträcker sig från 2-dimensionella (2D) odlingsmodeller (monolagerstrukturer) som antingen är tumörhärledda etablerade cellinjer eller primära cellinjer till de nyare metoderna som involverar 3-dimensionella (3D) modeller1. Inom 2D-modellerna är en viktig skillnad mellan de etablerade och primära cellinjerna4. Etablerade cellinjer förevigas; Därför kan samma cellinje användas globalt under många år, vilket ur ett historiskt perspektiv underlättar samarbete, ackumulering av data och utveckling av många behandlingsstrategier. Men genetiska avvikelser i dessa cellinjer ackumuleras med varje passage, vilket äventyrar deras biologiska relevans. Dessutom återspeglar det begränsade antalet tillgängliga cellinjer inte heterogeniteten hos tumörer hos patienter 4,5. Primära cancercellinjer härrör direkt från resekterade tumörprover erhållna via biopsier, pleurautgjutningar eller resektioner. Därför är primära cancercellinjer mer biologiskt relevanta eftersom de bevarar delar av tumörmikromiljön och tumöregenskaperna, såsom intercellulära beteenden (t.ex. överhörning mellan friska och cancerceller) och de stamliknande fenotyperna av cancerceller. Den replikerande kapaciteten hos primära cellinjer är dock begränsad, vilket leder till en smal odlingstid och begränsar antalet tumörceller som kan användas för analyser 4,5.
Modeller som använder 3D-kulturer är mer biologiskt relevanta än 2D-odlingsmodeller eftersom in vivo-förhållandena bibehålls. Således bevarar 3D-odlingsmodeller den naturliga cellformen och tillväxten och replikerar element i tumörmiljön, såsom hypoxi, nekros och celladhesion. De vanligaste 3D-modellerna inom cancerforskning inkluderar flercelliga sfäroider, byggnadsställningsbaserade strukturer och matrisinbäddade kulturer 4,6,7.
Det nuvarande protokollet genererar 3D-tumörodlingsmodeller (multicellulära sfäroider) från primära cancerceller och utvärderar deras känslighet för läkemedel med hjälp av två komplementära metoder: en cellviabilitetsanalys (MTT) och mikroskopiska undersökningar. De representativa resultaten som presenteras här är från bröst- och tjocktarmscancer; Detta protokoll är emellertid allmänt tillämpligt på andra solida tumörtyper (t.ex. kolangiokarcinom, mag-, lung- och bukspottskörtelcancer) och är också kostnadseffektivt, eftersom det kan utföras i sin helhet i ett typiskt cancerforsknings- / cellbiologilaboratorium utan att förlita sig på specialutrustning. De flercelliga sfäroiderna som genereras med detta tillvägagångssätt kan användas för att bedöma potentiella läkemedelskandidater, identifiera potentiella biomarkörer eller terapeutiska mål och undersöka mekanismerna för respons och resistens.
Detta protokoll är uppdelat i tre avsnitt: (1) generering, insamling och räkning av sfäroiderna som förberedelse för deras användning som modell för testning av läkemedelseffektivitet; (2) MTT-analys för att bedöma läkemedelseffektivitet på sfäroiderna; och (3) den mikroskopiska utvärderingen av morfologiska förändringar efter behandling av sfäroiderna med läkemedel som en annan metod för att utvärdera läkemedelseffektivitet (figur 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

Trots anmärkningsvärda framsteg när det gäller att förstå tumörbiologi misslyckas de allra flesta onkologiska läkemedelskandidater som går in i kliniska prövningar, ofta på grund av brist på klinisk effekt. Denna höga felfrekvens belyser oförmågan hos de nuvarande prekliniska modellerna att förutsäga klinisk effekt, främst på grund av deras otillräcklighet när det gäller att reflektera tumörheterogenitet och tumörmikromiljön. Dessa begränsningar kan hanteras med 3-dimensionella (3D) odlingsmodeller (sfäroider) etablerade från humana tumörprover härrörande från enskilda patienter. Dessa 3D-kulturer representerar verklig biologi bättre än etablerade cellinjer som inte återspeglar tumörheterogenitet. Dessutom är 3D-kulturer bättre än 2-dimensionella (2D) odlingsmodeller (monolagerstrukturer) eftersom de replikerar element i tumörmiljön, såsom hypoxi, nekros och celladhesion, och bevarar den naturliga cellformen och tillväxten. I den aktuella studien har en metod utvecklats för att förbereda primära kulturer av cancerceller från enskilda patienter som är 3D och växer i flercelliga sfäroider. Cellerna kan härledas direkt från patienttumörer eller patient-derived xenotransplantts. Metoden är allmänt tillämplig på solida tumörer (t.ex. kolon, bröst och lunga) och är också kostnadseffektiv, eftersom den kan utföras i sin helhet i ett typiskt cancerforsknings- / cellbiologilaboratorium utan att förlita sig på specialutrustning. Här presenteras ett protokoll för att generera 3D-tumörodlingsmodeller (multicellulära sfäroider) från primära cancerceller och utvärdera deras känslighet för läkemedel med hjälp av två komplementära metoder: en cellviabilitetsanalys (MTT) och mikroskopiska undersökningar. Dessa flercelliga sfäroider kan användas för att bedöma potentiella läkemedelskandidater, identifiera potentiella biomarkörer eller terapeutiska mål och undersöka mekanismerna för respons och resistens.

Detta protokoll presenterar procedurer för att generera en homogen kultur av sfäroider från primära tumörceller, kvantitativt utvärdera läkemedelseffekt på sfäroidkultur (MTT-analys) och bestämma effekten av studieläkemedel på sfäroidmorfologi. Data från representativa experiment i sfäroider genererade från kolon- och bröstcancercellkulturer presenteras. Liknande experiment utfördes med användning av andra tumörtyper, inklusive kolangiokarcinom, mag-, lung- och bukspottskörtelcancer (data visas inte)...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Detta protokoll beskriver generering av 3D-tumörodlingsmodeller från primära cancerceller och utvärdering av deras känslighet för läkemedel med hjälp av cellviabilitetsanalyser och mikroskopiska undersökningar.

Etablera 3-dimensionella sfäroider från patient-härledda tumörprover och utvärdera deras känslighet för läkemedel

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Vårt protokoll är viktigt eftersom det beskriver en generation av 3D-tumörodlingsmodeller från primära cancerceller, och denna modell representerar verklig tumörbiologi bättre än cellinjer. Detta tillvägagångssätt är tillämpligt på en mängd olika solida tumörer. Det är också kostnadseffektivt eftersom det kan utföras från början till slut i ett typiskt cellbiologilaboratorium.De 3D-tumörmodeller som genereras med hjälp av detta tillvägagångssätt stöder forskning om tumörers känslighet och resistens mot anti-cancerterapier eller en kombination av terapier. Detta tillvägagångssätt genererar 3D-modeller från primära cancerceller. Därför kan det identifiera vilken terapi som sannolikt kommer att vara effektiv för en viss patient och därmed hjälpa till att anpassa hans eller hennes behandling.Demonstrerar proceduren kommer att vara Ella Itzhaki, en doktorand från mitt laboratorium. Börja med att ta en liten T25-kolv med en encells vidhäftande primärcellkultur och avlägsna cellodlingsmediet. Tvätta cellerna med PBS och tillsätt en milliliter 1x Accutase i tre minuter vid 37 grader Celsius för att förbereda en encellssuspension av vidhäftande primära tumörcellkulturer med 75 till 100% sammanflöde.Neutralisera Accutase-lösningen genom att tillsätta fem milliliter cellodlingsmedium. Aspirera cellerna med en 10-milliliter serologisk pipett och deponera dem i ett 15-milliliter koniskt rör. Centrifugera röret vid 800 g i fem minuter vid rumstemperatur.Ta bort cellodlingsmediet och tillsätt åtta milliliter färskt cellodlingsmedium ovanpå cellpelleten och blanda sedan försiktigt. För att räkna de livskraftiga cellerna med en hemocytometer, ta en alikvot av 50 mikroliter av cellsuspensionen och blanda den med 50 mikroliter trypanblå. Räkna sedan de levande cellerna och beräkna det totala antalet levande celler i suspensionen.Förbered sedan 3D-odlingsmedium. Och efter beräkning av antalet celler som behövs för analysen och den totala volymen som krävs, förbered cellsuspension med önskat antal celler i 200 mikroliter av 3D-odlingsmediet. Blanda försiktigt med pipetten för att säkerställa homogen fördelning.Överför suspensionen till en pipetteringsbehållare och tillsätt 200 mikroliter av cellsuspensionen till varje brunn på en 96-brunnsplatta med ultralåg fastsättning med en flerkanalig pipett. Centrifugera plattan vid 300 g i 10 minuter vid rumstemperatur för att framtvinga klustring av cellerna, vilket förbättrar cellaggregeringen, och inkubera plattan vid 37 grader Celsius i en 5% koldioxidfuktad inkubator. Efter centrifugering igen vid 300 g i 10 minuter vid rumstemperatur, ta försiktigt bort och kassera 50% av mediet och tillsätt 100 mikroliter färskt 3D-odlingsmedium för att ersätta den befintliga lösningen.Upprepa detta steg och placera plattan tillbaka i 37-graders Celsius och 5% koldioxidfuktad inkubator. Inspektera cellerna under ett mikroskop varannan till två dagar för att övervaka sfäroidbildning. Mät diametern på sfäroiderna som bildas med skalverktyget i bildbehandlingsprogrammet.Och när sfäroiddiametern når 100 till 200 mikrometer, utför läkemedelseffektivitetsexperimenten. För sfäroiduppsamling, använd en 1 000 mikroliter pipett för att samla sfäroiderna från varje brunn och deponera dem i ett 15 ml koniskt rör. Centrifugera det koniska röret vid 300 g i fem minuter vid rumstemperatur och aspirera försiktigt och kassera supernatanten med en pipett.Tillsätt 0,5 ml av cellodlingsmediet och suspendera pelleten väl men försiktigt. För att utföra sfäroidräkning, använd en 96-brunnsplatta och rita ett plustecken på undersidan av en brunn för att dela brunnen i kvadranter. Tillsätt 50 mikroliter suspension till brunnen.Och med en 10x objektivlins, räkna sfäroiderna manuellt under mikroskopet. Räkna sfäroiderna i varje kvadrant och beräkna det totala antalet sfäroider i brunnen. Beräkna sedan sfäroidkoncentrationen genom att fördubbla sfäroidantalet genom att räkna volymen och beräkna det totala antalet sfäroider i suspensionen.I ett nytt rör, förbered sfäroidsuspension i en koncentration av 200 sfäroider per 200 mikroliter cellodlingsmedium. För varje läkemedelsbehandling, förbered beståndet av sfäroider i ett annat rör. Beräkna den totala mängden som behövs för varje läkemedel med antalet brunnar som behövs för upprepningar och tillsätt läkemedlet till röret till den slutliga koncentrationen som behövs.Överför 200 mikroliter av sfäroidsuspensionen till brunnarna på en 96-brunnsplatta med ultralåg fastsättning och inkubera plattan vid 37 grader Celsius i en 5% koldioxidfuktad inkubator. Efter inkubation av sfäroiderna med studieläkemedlet i 24 till 72 timmar, centrifugera plattan vid 300 g i fem minuter vid rumstemperatur och avlägsna försiktigt 170 mikroliter av cellodlingsmediet och lämna 30 mikroliter i botten av brunnen. Förbered MTT-lösningen och tillsätt 70 mikroliter av lösningen till varje brunn till en slutlig volym på 100 mikroliter per brunn.Den slutliga MTT-koncentrationen i brunnen kommer att vara 0,05 milligram per 100 mikroliter. Förbered dessutom tomma brunnar med MTT-lösning utan celler. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i en 5% koldioxidfuktad inkubator i tre till fyra timmar tills en förändring i lösningens färg i brunnarna observeras.När en förändring observeras, tillsätt 100 mikroliter stopplösning till varje brunn och blanda försiktigt innehållet i brunnarna utan att skapa bubblor. Läs plattans absorbans i en parameter ELISA-läsare vid en våglängd på 570 nanometer och en bakgrundsvåglängd på 630 till 690 nanometer. För att beräkna cellens livskraft, beräkna den specifika signalen för varje brunn.Beräkna sedan medelvärdet för de tomma brunnarna och subtrahera detta värde från varje brunn. Beräkna medelvärdet av de specifika signalerna i kontrollbrunnarna som innehåller celler som inte behandlades med studieläkemedlet. Slutligen beräkna livskraften hos celler i varje brunn i förhållande till brunnarna med obehandlade celler.Bildandet av sfäroider från en primär koloncancercellkultur över tiden med antalet initialt sådda celler visas här. Från denna figur kan man se att antalet sfäroider som genereras beror på antalet celler som ursprungligen såddes i varje brunn. Sfäroider från de primära koloncancercellerna efter 10 dagar i odling med initial cellsådd av 2 000 per brunn visas här.Vid långvarig odling av tjocktarmscancersfäroiderna började de fästa vid varandra och bildade kluster av sfäroider och druvliknande strukturer som förhindrade en homogen kultur och därmed förbjöd användningen av sfäroiderna i MTT-analyserna. Effekterna av palbociclib, sunitinib och deras kombination på sfäroider från primära tumörceller, inklusive kolon- och bröstcancer, visas här. En MTT-analys utfördes på sfäroider härrörande från kolon- och bröstcancerceller.MTT-signalerna normaliserades till värden från DMSO-behandlade celler. Värdena representerar medelvärdet från fyra till åtta replikat. Effekterna av de olika behandlingarna på celltillväxt utvärderades också mikroskopiskt vid dag noll och efter tre dagars behandling av sfäroider härrörande från tjocktarmscancer och bröstcancerceller.Effekterna av trastuzumab plus vinorelbin och 5 fluorouracil plus cisplatin på sfäroider härledda från bröstcancer över tid presenteras i denna figur. Förändringen i sfäroidernas diameter i förhållande till dag noll med behandlingstiden visas här. Varje behandlingsgrupp inkluderade fyra till sex brunnar med en sfäroid i varje brunn.Den genomsnittliga förändringen presenteras här. Sfäroider är viktiga verktyg för många studier utöver svar på anti-cancerbehandling. Dessa studier behandlar till exempel läkemedelsleverans och till och med grundläggande biologiska frågor som cell-cellinteraktioner.Det är viktigt att starta en sfäroidgenereringsprocess med en encellssuspension. Det är också viktigt att använda extremt låga fästplattor med ett medium som innehåller 5% grundläggande membranmått.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Märkning av bröstcancerpatient som härrör xenografter med spår Reportrar för tumörtillväxt och metastas studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Isolering och karakterisering av tumör-initiera celler från sarkom patient-derived xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Hög känslighet detektion av Micrometastases genereras av GFP Lentivirus-sensorik Organoids odlade från en patientderiverade kolon tumör

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Härma och manipulera bukspottskörteln Acinar-till-duktal metaplasi i 3-dimensionell cellodling

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Patient-härledda ortotopiska xenograft-modeller för Human Urotelial cellkarcinom och kolorektal cancer tumörtillväxt och spontan metastaser

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient härledda 3D spheroids för anti-neoplastisk drog screening för att rikta cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Etablering och karakterisering av små tarm neuroendokrina tumör spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolering av Stem-liknande celler från 3-dimensionella sfäroid kulturer

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

In vitro-analys med hög genomströmning med patient-härledda tumörorganoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...