Name: establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs
Uploaded: 2022-12-16T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Primer tümör hücre kültürleri için kullanılan insan tümör örneklerinin toplanması, Rabin Tıp Merkezi'nde kurumsal inceleme kurulu (IRB) onaylı protokollere göre, hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alınarak gerçekleştirildi. Çalışmaya katılmaya uygun hastalar arasında metastatik olmayan meme, kolon, karaciğer, akciğer, nöroendokrin, yumurtalık veya pankreas kanseri, herhangi bir pediatrik kanser veya herhangi bir metastatik kanseri olan erkek ve kadın yetişkin ve pediatrik kanser hasta...

<ol>
	<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+tumor+models:+Advantages,+disadvantages,+variables,+and+selecting+the+right+platform.">In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematology &amp; Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Ledur, P. F., Onzi, G. R., Zong, H., Lenz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+defining+glioblastoma+cells+behavior:+What+is+the+impact+for+novel+discoveries.">Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries.</a> Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).</li><li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+donor+to+the+lab:+A+fascinating+journey+of+primary+cell+lines.">From donor to the lab: A fascinating journey of primary cell lines.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 711381 (2021).</li><li>Esparza-Lopez, J., Martinez-Aguilar, J. F., Ibarra-Sanchez, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deriving+primary+cancer+cell+cultures+for+personalized+therapy.">Deriving primary cancer cell cultures for personalized therapy.</a> Revista de Investigacio&#769;n Cli&#769;nica. 71 (6), 369-380 (2019).</li><li>Choi, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cancer+models+for+biomedical+applications.">In vitro human cancer models for biomedical applications.</a> Cancers. 14 (9), 2284 (2022).</li><li>Eglen, R. M., Randle, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+discovery+goes+three-dimensional:+Goodbye+to+flat+high-throughput+screening.">Drug discovery goes three-dimensional: Goodbye to flat high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (5), 262-265 (2015).</li><li>Kodack, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+patient-derived+cancer+cells+and+their+potential+for+personalized+cancer+patient+care.">Primary patient-derived cancer cells and their potential for personalized cancer patient care.</a> Cell Reports. 21 (11), 3298-3309 (2017).</li><li>Moskovits, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palbociclib+in+combination+with+sunitinib+exerts+a+synergistic+anti-cancer+effect+in+patient-derived+xenograft+models+of+various+human+cancers+types.">Palbociclib in combination with sunitinib exerts a synergistic anti-cancer effect in patient-derived xenograft models of various human cancers types.</a> Cancer Letters. 536, 215665 (2022).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+determining+the+viability+of+cultured+cells.">Counting and determining the viability of cultured cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).</li><li>Braj&#353;a, K., Trzun, M., Zlatar, I., Jeli&#263;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+cultures+as+a+new+tool+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell cultures as a new tool in drug discovery.</a> Periodicum Biologorum. 118 (1), 59-65 (2016).</li><li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase.">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell International. 21 (1), 152 (2021).</li><li>van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sensitivity+assays:+The+MTT+assay.">Cell sensitivity assays: The MTT assay.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 237-245 (2011).</li><li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+resazurin+reduction+assay+can+distinguish+cytotoxic+from+cytostatic+compounds+in+spheroid+screening+assays.">The resazurin reduction assay can distinguish cytotoxic from cytostatic compounds in spheroid screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (7), 1047-1059 (2014).</li></ol>

Mevcut protokol, insan tümör örneklerinden türetilen 3D birincil hücre kültürleri (sferoidler) üretmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Bu sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını ve ilaç kombinasyonlarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak da dahil olmak üzere çeşitli analizler için kullanılabilir. Protokol, doğrudan hasta örneklerinden türetilen primer tümör hücrelerini veya hasta örne...

İn vitro ve in vivo çalışmalar, kanser tedavilerinin geliştirilmesinde tamamlayıcı yaklaşımları temsil etmektedir. İn vitro modeller çoğu deneysel değişkenin kontrolüne izin verir ve nicel analizleri kolaylaştırır. Genellikle düşük maliyetli tarama platformları olarak hizmet ederler ve mekanik çalışmalar için de kullanılabilirler1. Bununla birlikte, biyolojik alaka düzeyleri doğal olarak sınırlıdır, çünkü bu tür modeller tümör mikroçevresini sadece kısmen yansıtır1. Buna karşılık, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX) gibi in vivo modeller, tümör mikroçevresinin karmaşıklığını yakalar ve translasyonel çalışmalar ve hastalarda bireyselleştirici tedavi için daha uygundur (yani, bireysel bir hastadan türetilen bir modelde ilaçlara verilen yanıtı araştırmak)1. Bununla birlikte, in vivo modeller, deneysel parametreler in vitro modeller kadar sıkı bir şekilde kontrol edilemediğinden ve gelişimleri zaman alıcı, emek yoğun ve maliyetli olduğundan ilaç taraması için yüksek verimli yaklaşımlara elverişli değildir 1,2.
İn vitro modeller 100 yılı aşkın bir süredir mevcuttur ve hücre hatları 70 yılı aşkın bir süredir mevcuttur3. Bununla birlikte, son birkaç on yılda, solid tümörlerin mevcut in vitro modellerinin karmaşıklığı çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu karmaşıklık, tümör kaynaklı yerleşik hücre hatları veya birincil hücre hatları olan 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar), 3 boyutlu (3B) modelleri içeren daha yeni yaklaşımlara kadar uzanır1. 2B modellerde, kurulan ve birincil hücre çizgileri4 arasında önemli bir ayrım vardır. Kurulan hücre hatları ölümsüzleştirilir; Bu nedenle, aynı hücre hattı, tarihsel bir perspektiften bakıldığında, işbirliğini, veri birikimini ve birçok tedavi stratejisinin geliştirilmesini kolaylaştıran uzun yıllar boyunca küresel olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarındaki genetik anormallikler her geçişte birikir ve böylece biyolojik alaka düzeylerini tehlikeye atar. Ayrıca, mevcut hücre hatlarının sınırlı sayısı, 4,5 hastalarında tümörlerin heterojenliğini yansıtmamaktadır. Primer kanser hücre hatları doğrudan biyopsiler, plevral efüzyonlar veya rezeksiyonlar yoluyla elde edilen rezeke tümör örneklerinden elde edilir. Bu nedenle, birincil kanser hücre hatları, tümör mikroçevresinin unsurlarını ve hücreler arası davranışlar (örneğin, sağlıklı ve kanserli hücreler arasındaki çapraz konuşma) ve kanser hücrelerinin kök benzeri fenotipleri gibi tümör özelliklerini korudukları için biyolojik olarak daha önemlidir. Bununla birlikte, birincil hücre hatlarının replikatif kapasitesi sınırlıdır, bu da dar bir kültür süresine yol açar ve analizler için kullanılabilecek tümör hücrelerinin sayısını sınırlar 4,5.
3D kültürleri kullanan modeller, in vivo koşullar korunduğundan 2D kültür modellerinden biyolojik olarak daha önemlidir. Böylece, 3D kültür modelleri doğal hücre şeklini ve büyümesini korur ve hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltır. Kanser araştırmalarında en yaygın kullanılan 3D modeller arasında çok hücreli sferoidler, iskele tabanlı yapılar ve matrise gömülü kültürlerbulunur 4,6,7.
Mevcut protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) üretmekte ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmektedir: hücre canlılığı testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Burada sunulan temsili sonuçlar meme ve kolon kanserinden; Bununla birlikte, bu protokol diğer katı tümör tiplerine (örneğin, kolanjiyokarsinom, gastrik, akciğer ve pankreas kanseri) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında özel ekipmana dayanmadan tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Bu yaklaşım kullanılarak üretilen çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.
Bu protokol üç bölüme ayrılmıştır: (1) ilaç etkinliğini test etmek için bir model olarak kullanılmalarına hazırlık olarak sferoidlerin oluşturulması, toplanması ve sayılması; (2) Sferoidler üzerindeki ilaç etkinliğini değerlendirmek için MTT testi; ve (3) ilaç etkinliğinin değerlendirilmesinde başka bir yaklaşım olarak sferoidlerin ilaçlarla tedavisini takiben morfolojik değişikliklerin mikroskobik olarak değerlendirilmesi (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 Fluorouracil</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>lot 16c22NA</td>
			<td>Fluorouracil, Adrucil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>TEVA Israel</td>
			<td>20B06LA</td>
			<td>Abiplatin,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3632-010-02</td>
			<td>Basement membrane matrix, type 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethyl sulfoxide)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2391595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurometer&#160;ELISA reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy H1</td>
			<td>Gen5 3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>320331</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>&#160;Version 1.52a</td>
			<td>Open-source software ImageJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Gadot</td>
			<td>P180008215</td>
			<td>for stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1843977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTT&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M5655-1G</td>
			<td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palbociclib&#160;&#160;</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 571190-30-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)*Without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;streptomycin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2119399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol-free RPMI 1640</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>01-103-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippeting reservoir</td>
			<td>Alexred</td>
			<td>RED LTT012025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 culture medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11530586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunitinib</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>CAS # 341031-54-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trastuzumab</td>
			<td>F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basel, Switherland</td>
			<td>10172154 IL</td>
			<td>Herceptin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue 0.5% solution</td>
			<td>Biological industries, Israel</td>
			<td>03-102-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment 96 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>650970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>Ebewe</td>
			<td>11733027-03</td>
			<td>Navelbine</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing 3-dimensional spheroids from patient-derived tumor samples and evaluating their sensitivity to drugs

Tümör biyolojisini anlamadaki kayda değer ilerlemelere rağmen, klinik çalışmalara giren onkoloji ilaç adaylarının büyük çoğunluğu, genellikle klinik etkinlik eksikliği nedeniyle başarısız olmaktadır. Bu yüksek başarısızlık oranı, mevcut preklinik modellerin, esas olarak tümör heterojenliğini ve tümör mikroçevresini yansıtmadaki yetersizlikleri nedeniyle klinik etkinliği tahmin edememelerini aydınlatmaktadır. Bu sınırlamalar, bireysel hastalardan elde edilen insan tümör örneklerinden oluşturulan 3 boyutlu (3D) kültür modelleri (sferoidler) ile ele alınabilir. Bu 3D kültürler, gerçek dünya biyolojisini, tümör heterojenliğini yansıtmayan yerleşik hücre çizgilerinden daha iyi temsil eder. Ayrıca, 3B kültürler 2 boyutlu (2B) kültür modellerinden (tek katmanlı yapılar) daha iyidir, çünkü hipoksi, nekroz ve hücre yapışması gibi tümör ortamının unsurlarını çoğaltırlar ve doğal hücre şeklini ve büyümesini korurlar. Bu çalışmada, 3D olan ve çok hücreli sferoidlerde büyüyen bireysel hastalardan kanser hücrelerinin primer kültürlerinin hazırlanması için bir yöntem geliştirilmiştir. Hücreler doğrudan hasta tümörlerinden veya hasta kaynaklı ksenogreftlerden türetilebilir. Yöntem, katı tümörlere (örneğin, kolon, meme ve akciğer) yaygın olarak uygulanabilir ve aynı zamanda özel ekipmanlara güvenmeden tipik bir kanser araştırması / hücre biyolojisi laboratuvarında tamamen gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir. Burada, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri (çok hücreli sferoidler) oluşturmak ve iki tamamlayıcı yaklaşım kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmek için bir protokol sunulmuştur: bir hücre canlılık testi (MTT) ve mikroskobik incelemeler. Bu çok hücreli sferoidler, potansiyel ilaç adaylarını değerlendirmek, potansiyel biyobelirteçleri veya terapötik hedefleri tanımlamak ve yanıt ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir.

Bu protokol, primer tümör hücrelerinden homojen bir sferoid kültürü oluşturmak, sferoid kültür (MTT testi) üzerindeki ilaç etkinliğini kantitatif olarak değerlendirmek ve çalışma ilaçlarının sferoid morfoloji üzerindeki etkisini belirlemek için prosedürler sunmaktadır. Kolon ve meme kanseri hücre kültürlerinden üretilen sferoidlerdeki temsili deneylerden elde edilen veriler sunulmuştur. Benzer deneyler, kolanjiyokarsinom, gastrik, akciğer ve pankreas kanseri dahil olmak üzere diğer tümör ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs at JoVE.com

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Bu protokol, primer kanser hücrelerinden 3D tümör kültürü modelleri oluşturmayı ve hücre canlılık testleri ve mikroskobik incelemeler kullanarak ilaçlara duyarlılıklarını değerlendirmeyi açıklamaktadır.

Hasta Kaynaklı Tümör Örneklerinden 3 Boyutlu Sferoidlerin Oluşturulması ve İlaçlara Duyarlılıklarının Değerlendirilmesi

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

Protokolümüz önemlidir, çünkü birincil kanser hücrelerinden bir nesil 3D tümör kültürü modelini tanımlar ve bu model gerçek dünyadaki tümör biyolojisini hücre hatlarından daha iyi temsil eder. Bu yaklaşım çeşitli solid tümörlere uygulanabilir. Ayrıca, tipik bir hücre biyolojisi laboratuvarında baştan sona gerçekleştirilebildiği için uygun maliyetlidir.Bu yaklaşım kullanılarak üretilen 3D tümör modelleri, tümörlerin anti-kanser tedavilerine veya tedavilerin bir kombinasyonuna duyarlılığı ve direnci üzerine yapılan araştırmaları desteklemektedir. Bu yaklaşım, birincil kanser hücrelerinden 3D modeller üretir. Bu nedenle, belirli bir hasta için hangi tedavinin etkili olabileceğini belirleyebilir ve böylece tedavisini kişiselleştirmeye yardımcı olabilir.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Ella Itzhaki olacak. Başlamak için, tek hücreli yapışkan birincil hücre kültürüne sahip küçük bir T25 şişesi alın ve hücre kültürü ortamını çıkarın. Hücreleri PBS ile yıkayın ve% 75 ila% 100 birleşimli yapışkan primer tümör hücre kültürlerinin tek hücreli bir süspansiyonunu hazırlamak için 37 santigrat derecede üç dakika boyunca bir mililitre 1x Accutase ekleyin.Beş mililitre hücre kültürü ortamı ekleyerek Accutase çözeltisini nötralize edin. Hücreleri 10 mililitrelik bir serolojik pipetle aspire edin ve 15 mililitrelik bir konik tüpte biriktirin. Tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 800g'de santrifüjleyin.Hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücre peletinin üzerine sekiz mililitre taze hücre kültürü ortamı ekleyin, ardından yavaşça karıştırın. Canlı hücreleri bir hemositometre ile saymak için, hücre süspansiyonunun 50 mikrolitrelik bir alikotunu alın ve 50 mikrolitre tripan mavisi ile karıştırın. Ardından canlı hücreleri sayın ve süspansiyondaki toplam canlı hücre sayısını hesaplayın.Ardından, 3B kültür ortamını hazırlayın. Tahlil için gereken hücre sayısını ve gereken toplam hacmi hesapladıktan sonra, 3D kültür ortamının 200 mikrolitresinde istenen sayıda hücre ile hücre süspansiyonunu hazırlayın. Homojen bir dağılım sağlamak için pipetle nazikçe karıştırın.Süspansiyonu bir pipetleme haznesine aktarın ve çok kanallı pipetli ultra düşük bağlantı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin kümelenmesini zorlamak için plakayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300g'de santrifüj edin, böylece hücre agregasyonunu iyileştirin ve plakayı% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 g'da tekrar santrifüj yaptıktan sonra, ortamın %50'sini nazikçe çıkarın ve atın ve mevcut çözeltiyi değiştirmek için 100 mikrolitre taze 3D kültür ortamı ekleyin.Bu adımı tekrarlayın ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatöre geri yerleştirin. Sferoid oluşumu izlemek için hücreleri her bir ila iki günde bir mikroskop altında inceleyin. Görüntüleme yazılımındaki ölçek aracı kullanılarak oluşturulan sferoidlerin çapını ölçün.Küresel çap 100 ila 200 mikrometreye ulaştığında, ilaç etkinliği deneylerini gerçekleştirin. Küre toplama için, her bir kuyucuktan küreleri toplamak için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve bunları 15 mililitrelik bir konik tüpe koyun. Konik tüpü oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 g'da santrifüj edin ve bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin ve atın.Hücre kültürü ortamının 0.5 mililitresini ekleyin ve peleti iyi ama nazikçe askıya alın. Küresel sayım yapmak için, 96 delikli bir plaka kullanın ve kuyuyu kadranlara bölmek için kuyunun alt tarafına bir artı işareti çizin. Kuyuya 50 mikrolitre süspansiyon ekleyin.Ve 10x objektif lensle, sferoidleri mikroskop altında manuel olarak sayın. Her kadrandaki sferoidleri sayın ve kuyudaki toplam sferoid sayısını hesaplayın. Ardından, hacmi sayarak küresel sayıyı iki katına çıkararak küresel konsantrasyonu hesaplayın ve süspansiyondaki toplam sferoid sayısını hesaplayın.Yeni bir tüpte, 200 mikrolitre hücre kültürü ortamı başına 200 sferoid konsantrasyonunda sferoid süspansiyon hazırlayın. Her ilaç tedavisi için, sferoid stoğunu farklı bir tüpte hazırlayın. Her ilaç için gereken toplam miktarı, tekrarlar için gereken kuyucuk sayısına göre hesaplayın ve ilacı tüpe gereken son konsantrasyona ekleyin.Küresel süspansiyonun 200 mikrolitresini ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarın ve plakayı% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Sferoidleri çalışma ilacı ile 24 ila 72 saat boyunca inkübe ettikten sonra, plakayı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300g'de santrifüj edin ve hücre kültürü ortamının 170 mikrolitresini yavaşça çıkarın ve kuyunun dibinde 30 mikrolitre bırakın. MTT çözeltisini hazırlayın ve her bir kuyucuğa 70 mikrolitre çözelti ekleyin ve kuyu başına 100 mikrolitrelik son bir hacme getirin.Kuyudaki son MTT konsantrasyonu, 100 mikrolitre başına 0.05 miligram olacaktır. Ek olarak, hücresiz MTT çözeltisi ile boş kuyucuklar hazırlayın. Kuyucuklardaki çözeltinin renginde bir değişiklik gözlenene kadar% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 karbondioksit nemlendirilmiş bir inkübatörde plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.Bir değişiklik gözlendiğinde, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre Stop çözeltisi ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan kuyucukların içeriğini hafifçe karıştırın. Plakanın absorbansını 570 nanometre dalga boyunda ve 630 ila 690 nanometre arka plan dalga boyunda bir parametre ELISA okuyucusunda okuyun. Hücre canlılığını hesaplamak için, her bir kuyucuk için spesifik sinyali hesaplayın.Ardından boş kuyucukların ortalama değerini hesaplayın ve bu değeri her kuyudan çıkarın. Çalışma ilacı ile tedavi edilmeyen hücreleri içeren kontrol kuyularındaki spesifik sinyallerin ortalamasını hesaplayın. Son olarak, her bir kuyucuktaki hücrelerin, işlenmemiş hücrelere sahip kuyucuklara göre yaşayabilirliğini hesaplayın.Birincil kolon kanseri hücre kültüründen zamanla başlangıçta tohumlanan hücrelerin sayısı ile sferoidlerin oluşumu burada gösterilmiştir. Bu şekilden, üretilen sferoidlerin sayısının, başlangıçta her bir kuyucukta tohumlanan hücrelerin sayısına bağlı olduğu görülebilir. Kültürde 10 gün sonra birincil kolon kanseri hücrelerinden gelen sferoidler, kuyu başına 2.000 ilk hücre tohumlaması ile burada gösterilmiştir.Kolon kanseri sferoidlerinin uzun süreli kültürü üzerine, birbirlerine yapışmaya başladılar ve homojen bir kültürü önleyen ve böylece MTT tahlillerinde sferoidlerin kullanımını yasaklayan sferoidler ve üzüm benzeri yapılar kümeleri oluşturdular. Palbociclib, sunitinib ve bunların kombinasyonlarının kolon ve meme kanseri de dahil olmak üzere primer tümör hücrelerinden sferoidler üzerindeki etkileri burada gösterilmiştir. Kolon ve meme kanseri hücrelerinden türetilen sferoidler üzerinde bir MTT testi yapıldı.MTT sinyalleri, DMSO ile tedavi edilen hücrelerden gelen değerlere normalleştirildi. Değerler, dört ila sekiz çoğaltma arasındaki araçları temsil eder. Çeşitli tedavilerin hücre büyümesi üzerindeki etkileri de sıfır günde ve kolon kanseri ve meme kanseri hücrelerinden türetilen sferoidlerin üç günlük tedavisinden sonra mikroskobik olarak değerlendirildi.Trastuzumab artı vinorelbin ve 5 florourasil artı sisplatinin zamanla meme kanserinden türeyen sferoidler üzerindeki etkileri bu şekilde sunulmuştur. Sferoidlerin çapının tedavi süresine göre sıfır gününe göre değişimi burada gösterilmiştir. Her tedavi grubu, her bir kuyucukta bir küre bulunan dört ila altı kuyu içeriyordu.Ortalama değişim burada sunulmaktadır. Sferoidler, anti-kanser tedavisine yanıtın ötesinde birçok çalışma için önemli araçlardır. Bu çalışmalar, örneğin, ilaç dağıtımını ve hatta hücre-hücre etkileşimleri gibi temel biyoloji sorularını ele almaktadır.Tek hücreli bir süspansiyonla küresel üretim sürecini başlatmak çok önemlidir. Ayrıca,% 5 bazik membran metrikleri içeren bir ortama sahip ultra düşük bağlantı plakalarının kullanılması da kritik öneme sahiptir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Tümör Büyüme ve metastaz Çalışmaları İzlenebilir Muhabirleri ile Meme Kanseri Hasta kaynaklı ksenogratflarının Etiketleme

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

High-sensitivity Detection of Micrometastases Generated by GFP Lentivirus-transduced Organoids Cultured from a Patient-derived Colon Tumor

Bir hasta kaynaklı kolon tümöründen kültürlü GFP Lentivirus transduced Organoids tarafından oluşturulan Micrometastases yüksek-duyarlı tespiti

Despite current advances in human colorectal cancer (CRC) treatment, few radical therapies are effective for the late stages of CRC. To overcome this ...

Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

Taklit ve 3 boyutlu hücre kültüründe pankreas Acinar-için-duktal metaplazi manipüle

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Insan Üromotorial Hücre Karsinomu ve kolorektal kanser tümörü büyüme ve spontan Metasrik için hasta türevi Ortootopik xenograft modelleri

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fizyolojik hasta, kanser kök hücrelerini hedef alan anti-neoplastik Ilaç taraması için 3B kürler türetilmiştir

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Spheroidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

3 Boyutlu Spheroid Kültürlerden Kök Benzeri Hücrelerin İzolasyon

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...