Name: real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry
Uploaded: 2023-02-03T13:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة جزئيا بمنح من: زمالة Fight for Sight Leonard و Robert Weintraub لما بعد الدكتوراه (D.Y.S.) ؛ برنامج زمالة ما بعد الدكتوراه لمؤسسة برايت فوكس في أبحاث التنكس البقعي (M2021010F ، D.Y.S.) ؛ وزارة الدفاع ، برنامج أبحاث الرؤية الشوكية بموجب الجائزة رقم VR180132 (MS-G. و L.A.K.) ؛ المعهد الوطني للعيون التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R01EY027739 (L.A.K.). يتم تقديم شكر وتقدير للمانحين لأبحاث التنكس البقعي M2021010F ، وهو برنامج تابع لمؤسسة BrightFocus ، لدعم هذا البحث. تم إنشاء المخططات باستخدام Biorender.com

<ol>
	<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+impairment+correlates+with+increased+sensitivity+of+aging+RPE+cells+to+oxidative+stress.">Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress.</a> Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).</li><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT+and+EndMT:+Emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration.">EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271 (2020).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).</li><li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxygen+consumption+rate+(OCR)+and+extracellular+acidification+rate+(ECAR)+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism.">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protocol. 8 (10), 2850 (2018).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+PGC-1&#945;+drives+metabolic+dysfunction+in+TGFbeta2-induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells.">Suppression of PGC-1&#945; drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701 (2021).</li><li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786 (2022).</li><li>Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaceutical+induction+of+PGC-1&#945;+promotes+retinal+pigment+epithelial+cell+metabolism+and+protects+against+oxidative+damage.">Pharmaceutical induction of PGC-1&#945; promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640 (2018).</li><li>Ferrington, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+bioenergetics+and+enhanced+resistance+to+oxidative+stress+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells+from+donors+with+age-related+macular+degeneration.">Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 13, 255-265 (2017).</li><li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+identifies+compounds+that+protect+RPE+cells+from+physiological+stressors+present+in+AMD.">High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD.</a> Experimental Eye Research. 185, 107641 (2019).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metabolic+stress+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+sufficient+to+induce+photoreceptor+degeneration.">Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration.</a> Elife. 5, 14319 (2016).</li><li>Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+C3a+receptor+activation+in+oxidatively+stressed+epithelial+cells+reduces+mitochondrial+respiration+and+metabolism.">Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism.</a> Frontiers in Immunology. 12, 628062 (2021).</li><li>Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PGC-1&#945;+in+RPE+induces+mesenchymal+transition+and+promotes+retinal+degeneration.">Loss of PGC-1&#945; in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration.</a> Life Science Alliance. 2 (3), 201800212 (2019).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Huang, T., Long, M., Huo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+to+cuprous+ions+of+protein+and+BCA+in+the+bicinchoninic+acid+protein+assay.">Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay.</a> Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).</li><li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test.">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).</li><li>Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+frames+a+common+drug-binding+site+in+the+ATP+synthase.">Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).</li><li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Demine, S., Renard, P., Arnould, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+uncoupling:+A+key+controller+of+biological+processes+in+physiology+and+diseases.">Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases.</a> Cells. 8 (8), 795 (2019).</li><li>Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+oxygen+consumption+by+mitochondrial+gene+knockout+cells.">Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).</li><li>Pike Winer, L. S., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+glycolytic+and+oxidative+substrate+flux+of+cancer+cells+in+a+microplate.">Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate.</a> PLoS One. 9 (10), 109916 (2014).</li><li>Laussel, C., Leon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+toxicity+of+the+metabolic+inhibitor+2-deoxyglucose+and+associated+resistance+mechanisms.">Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms.</a> Biochemical Pharmacology. 182, 114213 (2020).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Gao, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+mitochondrial+uncoupler+BAM15+induces+ROS+production+for+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia.</a> Biochemical Pharmacology. 198, 114948 (2022).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Ye, F., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+oxidative+phosphorylation+in+human+skin+fibroblasts.">Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).</li><li>Rountree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barofuse+a+novel+pressure-driven,+adjustable-throughput+perfusion+system+for+tissue+maintenance+and+assessment.">Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment.</a> Heliyon. 2 (12), 00210 (2016).</li><li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluidics+system+for+resolving+concentration-dependent+effects+of+dissolved+gases+on+tissue+metabolism.">Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism.</a> Elife. 10, 66716 (2021).</li><li>Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+approaches+to+determine+static+and+dynamic+redox+state-related+parameters.">Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters.</a> Antioxidants. 11 (5), 864 (2022).</li><li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers.">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).</li><li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC+disease+modelling+reveals+functional+and+structural+defects+in+retinal+pigment+epithelial+cells+harbouring+the+m.3243A+&gt;+G+mitochondrial+DNA+mutation.">Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A &gt; G mitochondrial DNA mutation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12320 (2017).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يتضمن هذا البروتوكول المحسن لقياس التنفس عالي الدقة ل H-RPE استخدام BAM15 كأداة فك بدلا من FCCP شائعة الاستخدام. في حين أن الدراسات السابقة حول قياس التنفس عالي الدقة ل RPE استخدمت FCCP 9,24 ، يبدو أن BAM15 يحفز تحريضا أكثر قوة لمستويات التنفس القصوى في H-RPE مقارنة ب FCCP. في حين أن كلا من FCCP و BAM15 آمنان للاستخدام في الخلايا ، فقد تم الإبلاغ عن أن BAM15 له آثار جانبية أقل في الخلايا الطبيعية مقارنة ب FCCP أو الكربونيل سيانيد -3-كلوروفينيلهيدرازون (CCCP) 25. أظهر كينوود وآخرون أن BAM15 يزيل استقطاب الميتوكوندريا دون التأثير على إمكانات غشاء البلازما ، مما يؤدي إلى معدل تنفس أقصى مستدام للميتوكوندريا عند سمية خلويةمنخفضة 26. من ناحية أخرى ، يزيل FCCP استقطاب كل من الميتوكوندريا وغشاء البلازما ويعرض سمية خلوية أعلى26.
هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول ، بما في ذلك ضمان طلاء الخلايا بشكل صحيح في طبقة أحادية متقاربة ومتساوية ومتجانسة من RPE في جميع الآبار التجريبية للصفيحة الدقيقة. تعتمد RPE الناضجة بشكل كبير على OXPHOS لتوليد الطاقة ، وبالتالي يجب السماح للخلايا بالنضوج لمدة 1 شهر على الأقل لضمان أن RPE يولد قراءات OCR أساسية وقصوى مناسبة أثناء الفحص. يعد التخلص من الغازات من لوحة زراعة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في فرن مرطب (بدون ثاني أكسيد الكربون 2) قبل وضعها في الجهاز أمرا بالغ الأهمية لقراءات ECAR الدقيقة ، حيث يمكن أن يؤثر CO2 على الرقم الهيدروجيني لوسائط الفحص. من المهم أن تتذكر ترطيب خرطوشة المستشعر في اليوم السابق للفحص للتأكد من أنها توفر قراءات OCR و ECAR موثوقة في يوم الفحص. وينبغي الحرص على إعادة تكوين العقاقير المراد حقنها على النحو السليم وتحويل مخزونات الأدوية المعاد تشكيلها إلى أحجام أصغر للتخزين الطويل الأجل لتقليل دورات التجميد/الذوبان إلى أدنى حد. من الأهمية بمكان تحضير 10x محاليل دوائية مخففة في وسائط الفحص المعنية (على سبيل المثال ، مخففة في وسائط فحص اختبار Mito Stress لاختبار Mito Stress) لعامل التخفيف من حقن الدواء في كل بئر مملوءة بوسائط الفحص. مع كل حقنة دواء لاحقة ، هناك المزيد من الوسائط في كل بئر ، وبالتالي تزداد أحجام الدواء التي يتم تحميلها مع كل حقنة ، ويجب توخي الحذر لمتابعة الأحجام المحددة في البروتوكول. من المهم إجراء فحوصات الجودة عند الانتهاء من التجربة من خلال فحص خرطوشة المستشعر للتأكد من عدم وجود دواء متبقي واضح ومراقبة لوحة زراعة الخلايا تحت المجهر لضمان بقاء الطبقة الأحادية للخلية المتقاربة والمتجانسة.
تشمل التعديلات على هذا البروتوكول حقن عقاقير مختلفة في الموانئ وتحديد كيفية تأثير هذه الأدوية على قراءات OCR و ECAR. أحد التعديلات الشائعة هو حقن دواء تجريبي من اختيارك مثل Port A قبل حقن أدوية اختبار Mito أو Glycolytic Stress Test المعتادة. يوفر هذا النوع من البروتوكول نظرة ثاقبة حول كيفية تأثير الحقن الحاد للدواء المفضل على OXPHOS اللاحق ومعلمات تحلل السكر. وتشمل التعديلات الأخرى فحص أنواع مختلفة من الخلايا. يتطلب ذلك استكشاف الأخطاء وإصلاحها الأولية لكثافة خلية البذر المثلى وتحسين وسائط الفحص من خلال ضمان أن القراءات القاعدية تتراوح من 50-100 بمول / دقيقة ل OCR و 10-20 ميل في الساعة / دقيقة ل ECAR. يجب تحديد التركيزات المثلى للأدوية المحقونة لكل نوع جديد من الخلايا التي تم فحصها من خلال مراقبة استجابات OCR و ECAR للتخفيف التسلسلي للأدوية.
أحد القيود الرئيسية للبروتوكول هو أن صلاحية الخلية تتضاءل بمرور الوقت ، حيث أن الخلايا ليست في حاضنة CO2 في وسائط نموها الطبيعية ، وبالتالي يجب إكمال الفحص في غضون 3-4 ساعات لضمان أقصى قدر من بقاء الخلية. علاوة على ذلك ، فإن التعرض لسموم الميتوكوندريا المحقونة في كل بئر يمكن أن يقلل من صلاحية الخلية بمرور الوقت. بمجرد اكتمال الفحص ، يجب تحليل الخلايا لتقييم محتوى البروتين لتطبيع قراءات OCR و ECAR ، وبالتالي لا يمكن حصاد نفس الخلايا لفحوصات البيولوجيا الجزيئية اللاحقة.
تشمل بدائل فرس البحر للتوصيف بالطاقة الحيوية Oroboros Oxygraph 2k (O2k) 27 و BaroFuse28،29 و Resipher (Lucid Scientific) 7. Oroboros O2k عبارة عن مقياس تنفس مغلق من غرفتين يستخدم أقطاب الأكسجين البولاروغرافية من نوع S1 Clark. في حين أن Oroboros O2k ينتج قياسات حساسة للغاية للتدفق الأيضي في الوقت الفعلي ، فإن الجهاز كثيف العمالة حيث يطلب من المشغل حقن كل دواء يدويا30. BaroFuse هو نظام جديد متعدد القنوات لنضح الموائع الدقيقة يستخدم ضغط الغاز لتمكين تجارب التروية المتوازية المتعددة ويرتبط بنظام الكشف عن الأكسجين لقياس التعرف الضوئي على الحروف. تتمثل ميزة نظام ثقافة التدفق هذا في الحفاظ على وظيفة الأنسجة وصلاحيتها ، على عكس فرس البحر حيث تتضاءل صلاحية الخلية على مدى مقايسات أطول. يستخدم Resipher مستشعرات أكسجين بصرية حساسة للغاية لقياس التعرف الضوئي على الحروف أثناء وجود الخلايا في لوحة 96 بئرا في الحاضنة ، مما يتيح قياسات OCR المستمرة على مدار عدة أسابيع إلى أشهر. والجدير بالذكر أن هذه الأدوات لا تقيس ECAR ، وبالتالي فإن فرس البحر يتمتع بميزة الاستكشاف المتزامن لكل من OXPHOS وتحلل السكر.
يبرز استجواب ملامح الطاقة الحيوية في الوقت الفعلي ل OXPHOS وتحلل السكر كعامل رئيسي في توصيف صحة RPE ووظيفتها. يتيح قياس التنفس عالي الدقة وسيلة فعالة لمقارنة الحالة الأيضية ل RPE الطبيعي والمريض ، وبالتالي فتح طرق جديدة لفحص فعالية الدواء لأمراض الشبكية مثل AMD و PVR. تشمل الاتجاهات المستقبلية لقياس التنفس عالي الدقة على RPE تحسين بروتوكول لفحص ملامح الطاقة الحيوية لطبقات RPE أحادية الاستقطاب للغاية المزروعة على مرشحات transwell. نجح Calton et al. (2016) في تحقيق ذلك عن طريق قطع مقطع مثلث من الطبقة الأحادية RPE المستقطبة المزروعة على مرشحات transwell31. يشمل التوسع الإضافي في المنهجية فحص ملامح الطاقة الحيوية ل RPE المستحث المشتق من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (iPSC-RPE) ، المعزولة من المرضى الذين يعانون من حالات تنكسية مختلفة في شبكيةالعين 32. يمكن أن يكشف استكشاف كيفية تأثير السيتوكينات المسببة للأمراض المشاركة في AMD و PVR على الطبيعة الديناميكية لعملية التمثيل الغذائي RPE عن نقاط الضعف الأيضية التي يمكن أن تفيد في تحديد أهداف جديدة قابلة للدواء.

توجد الخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) كطبقة أحادية من الخلايا الظهارية المصطبغة الموجودة بشكل استراتيجي بين المستقبلات الضوئية والبطانة المحصورة للشعيرات الدموية. RPE نشطة للغاية في التمثيل الغذائي مع العديد من الوظائف ، بما في ذلك (1) البلعمة لأقراص مستقبلات الضوء ، (2) إعادة تدوير الصباغ البصري للحفاظ على الدورة البصرية ، (3) نقل العناصر الغذائية والمستقلبات والأيونات والماء ، (4) امتصاص الضوء ، (5) الحماية ضد الأكسدة الضوئية ، (6) إفراز العوامل الأساسية لدعم سلامة الشبكية ، و (7) تكوين الحاجز الدموي الشبكي الخارجي1 . يرتبط تنكس RPE بالخلل الوظيفي الأيضي وعيوب الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى أمراض العين المسببة للعمى مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) واعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR)2.
هناك مساران رئيسيان للطاقة الحيوية هما تحلل السكر ، الذي يحدث في السيتوبلازم ، والفسفرة التأكسدية (OXPHOS) ، والتي تحدث في الميتوكوندريا. أثناء تحلل الجلوكوز ، يتم تحويل جزيء واحد من الجلوكوز إلى جزيئين من البيروفات وإنتاج صافي لجزيئين من أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). على عكس تحلل السكر ، ينتج OXPHOS مستويات أعلى بكثير من ATP (~ 32-38 جزيئا من ATP لكل جزيء جلوكوز). والجدير بالذكر أن OXPHOS يستهلك الأكسجين ويتطلب حدوث الميتوكوندريا الوظيفية ، في حين يحدث تحلل السكر في السيتوبلازم ولا يتطلب الأكسجين.
قبل إدخال التقنيات القائمة على التألق أو الفسفرة لفحص تنفس الميتوكوندريا ، تم قياس مستويات الأكسجين في معلقات الخلايا النفاذية في غرف مجهزة بقطب أكسجين من نوع كلارك3. في حين أن قطب كلارك أرخص بكثير من قياس التنفس القائم على التألق ويعمل في الخلايا غير الملتصقة ، إلا أنه منخفض الإنتاجية نسبيا ، حيث تستغرق كل عملية تنفسية حوالي 15-20 دقيقة وتتطلب كميات أكبر بكثير من الخلايا لكل عينة3. وهكذا ، حلت تقنية قياس التنفس القائمة على التألق محل قطب كلارك الكهربائي إلى حد كبير وأصبحت تقنية شائعة في مجالات التمثيل الغذائي وأبحاث الميتوكوندريا.
يصف هذا البروتوكول تقنية قياس التنفس عالية الإنتاجية وعالية الدقة والقائمة على التألق والتي تقيس حركيا OXPHOS وملامح الطاقة الحيوية المحللة للسكر للخلايا الحية. نظرا لأن عملية OXPHOS تستهلك الأكسجين ، يتم إنتاج ملف تعريف الطاقة الحيوية ل OXPHOS عن طريق رسم خرائط للتغيرات في معدل استهلاك الأكسجين (OCR) بمرور الوقت4. في هذه التقنية ، يتم تضمين اثنين من الفلوروفورات في غلاف خرطوشة المستشعر المتصل بحزم الألياف البصرية التي تنبعث منها الضوء ، مما يثير الفلوروفور. يتم قياس التغييرات في انبعاث الفلوروفور بواسطة مستشعرات مضان عالية الحساسية وتنتقل عبر حزمة الألياف البصرية ليتم تحويلها إلى قراءات OCR5. يتم إخماد الفلوروفور بواسطة الأكسجين ، مما يتيح تحديد مستويات الأكسجين خارج الخلية في وسائط الفحص ، والمعروفة باسم تدفق الأكسجين أو OCR. الفلوروفور الآخر هو مسبار مستشعر الأس الهيدروجيني الحساس للتغيرات في تدفق البروتون ، والذي يتم تحويله إلى مقياس لمعدل التحمض خارج الخلية (ECAR). أثناء القياسات ، يتم خفض حزم الألياف الضوئية مع الفلوروفورات المدمجة إلى 200 ميكرومتر فوق الطبقة الأحادية للخلية ، مما يخلق غرفة دقيقة عابرة تتيح قراءات سريعة في الوقت الفعلي. بمجرد اكتشاف تغير بنسبة 10٪ في مستويات الأكسجين أو البروتون ، يتم رفع المستشعرات لأعلى ، مما يسمح لحجم أكبر من الوسائط بالاختلاط مع وسائط الغرفة الدقيقة العابرة ، واستعادة قيم OCR و ECAR مرة أخرى إلى خط الأساس. تم تجهيز كل خرطوشة مستشعر بأربعة منافذ للسماح بالإدارة المتسلسلة لما يصل إلى أربعة مركبات لكل بئر أثناء الفحص. يمكن جمع القياسات قبل وبعد حقن المركبات في كل منفذ ، مما يكشف عن المعلومات الأساسية حول الحالة الأيضية للخلايا.
يمكن أن يؤدي استجواب هذين المسارين الأيضيين المتميزين إلى اكتشافات مهمة فيما يتعلق بالحالة الأيضية ل RPE بعد التعرض لمحفزات مسببة للأمراض مختلفة ، وبالتالي يمكن استخدامها لاختبار فعالية الأدوية في استعادة السلامة الأيضية ل RPE6،7،8. حفز ظهور قياس التنفس عالي الإنتاجية وتوافر مثبطات الميتوكوندريا المحددة المزيد من الأبحاث في تحديد ملامح الطاقة الحيوية ل RPE وتحديد العيوب في التمثيل الغذائي والميتوكوندريا أثناء حالات المرض6،7،8،9،10،11،12،13 . سلط قياس التنفس عالي الدقة الضوء على الدور الرئيسي لإعادة البرمجة الأيضية ل RPE في أمراض الشبكية مثل AMD و PVR. اثنان من السيتوكينات الرئيسية المشاركة في التسبب في AMD و PVR هما تحويل عامل النمو بيتا 2 (TGFβ2) وعامل نخر الورم ألفا (TNFα). يرافق تحريض الانتقال الظهاري الوسيط (EMT) بواسطة TGFβ2 خلل في الميتوكوندريا ، وقمع OXPHOS ، وزيادة تعويضية في قدرة تحلل السكر في RPE6. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن السيتوكين المؤيد للالتهابات ، TNFα ، يحفز تنظيما كبيرا ل OXPHOS القاعدي ويقلل من تحلل السكر في H-RPE7. أدى إعطاء ثنائي ميثيل فومارات إلى تثبيط الالتهاب الناجم عن TNFα بشكل كبير في H-RPE واستعادة مورفولوجيا الميتوكوندريا وملامح الطاقة الحيوية القاعدية7. تحفز الملامح الأيضية المتباينة التي يسببها عاملي النمو هذين أسئلة ميكانيكية مثيرة للاهتمام فيما يتعلق بمشاركة إعادة برمجة التمثيل الغذائي في أمراض الشبكية. يصف البروتوكول التالي خطوات تقييم OXPHOS وملامح الطاقة الحيوية المحللة للسكر في H-RPE باستخدام قياس التنفس عالي الدقة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D8375-5G</td>
			<td>Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>229597</td>
			<td>BCA Assay 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from&#160;Streptomyces&#160;sp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAM15</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1760-5MG</td>
			<td>Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>To determine total protein content in each well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience&#160;</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9803S</td>
			<td>&#160;Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8644-100ML</td>
			<td>Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Cell culture grade</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td>For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td>Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td>Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-RPE &#8211; Human Retinal Pigment Epithelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>194987</td>
			<td>Primary human fetal RPE cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin - CAS 1404-19-9 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>495455-10MG</td>
			<td>ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td>To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc</td>
			<td>50-153-2823</td>
			<td>Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack&#160;Subculture Reagents, 100 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td>Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td>Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit - RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>195409</td>
			<td>Media for primary human fetal RPE cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>High-Resolution Respirometry Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SCGP00525&#160;</td>
			<td>Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium without phenol red&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103335-100</td>
			<td>Base media for running the Seahorse assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry

يعد الخلل الأيضي للخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين (RPE) محركا رئيسيا مسببا للأمراض لأمراض الشبكية مثل التنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) واعتلال الشبكية الزجاجي التكاثري (PVR). نظرا لأن RPE هي خلايا نشطة للغاية في التمثيل الغذائي ، فإن التغيرات في حالتها الأيضية تعكس التغيرات في صحتها ووظيفتها. يسمح قياس التنفس عالي الدقة بالتحليل الحركي في الوقت الفعلي لمساري الطاقة الحيوية الرئيسيين ، تحلل السكر والفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا (OXPHOS) ، من خلال القياس الكمي لمعدل التحمض خارج الخلية (ECAR) ومعدل استهلاك الأكسجين (OCR) ، على التوالي. فيما يلي بروتوكول محسن لإجراء قياس التنفس عالي الدقة على الخلايا الظهارية الصبغية للشبكية البشرية الأولية (H-RPE). يقدم هذا البروتوكول وصفا تفصيليا للخطوات التي ينطوي عليها إنتاج ملامح الطاقة الحيوية ل RPE لتحديد قدرات OXPHOS الأساسية والقصوى وقدرات تحلل السكر. يؤدي تعريض H-RPE لحقن الأدوية المختلفة التي تستهدف آلية الميتوكوندريا وتحلل السكر إلى ملامح طاقة حيوية محددة ، والتي يمكن من خلالها حساب المعلمات الأيضية الرئيسية. يسلط هذا البروتوكول الضوء على الاستجابة المعززة ل BAM15 كعامل فصل مقارنة بسيانيد الكربونيل p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) للحث على قدرة التنفس القصوى في RPE. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة حالة الطاقة الحيوية ل RPE في ظل ظروف مرضية مختلفة واختبار فعالية الأدوية الجديدة في استعادة الحالة الأيضية الأساسية ل RPE.

تقيس الأداة في وقت واحد كلا من OCR و ECAR لكل تشغيل. بالنسبة لاختبار إجهاد ميتو ، تستند حسابات المعلمات إلى قراءات التعرف الضوئي على الحروف (الشكل 3 أ) ، بينما بالنسبة لاختبار الإجهاد المحللة للسكر ، تستند حسابات المعلمات إلى قراءات ECAR (الشكل 3 ب). يوضح الشكل 3 الرسوم البيانية التمثيلية لمنحنى Mito Stress Test OCR بمرور الوقت (الشكل 3C) وحسابات المعلمات في شكل رسوم بيانية شريطية ل H-RPE (الشكل 3D). يتم تمثيل اختبار الإجهاد تحلل السكر كمنحنى ECAR بمرور الوقت (الشكل 3E) ، ويتم عرض حسابات المعلمات في الرسوم البيانية الشريطية ل H-RPE (الشكل 3F).
يوفر التنفس القاعدي فهما للمتطلبات الحيوية للخلايا في ظل الظروف القاعدية17. حقن الدواء الأول ، oligomycin (Oligo) ، هو مثبط ATP synthase ، وبالتالي ، فإن أي انخفاض في OCR بعد حقن الدواء الأول هو مقياس للتنفس المرتبط ب ATP18. يعتبر أي تنفس قاعدي متبقي بعد حقن الدواء اللاحقة تسربا للبروتون لأنه لا يقترن بتخليق ATP. قد تشير زيادة تسرب البروتون إلى زيادة فصل الميتوكوندريا ، والذي يتم تنظيمه عن طريق فصل البروتينات الموجودة من الناحية الفسيولوجية ولكن تم ربطها أيضا بأمراض مثل السمنة والسرطان والسكري من النوع 2 وأمراض القلب والأوعية الدموية19. الحقن الثاني هو عامل فصل ، مثل BAM15 أو FCCP ، لتحديد أقصى جهد تنفس للميتوكوندريا. تعمل عوامل الفصل على انهيار تدرج البروتون وتقليل القوة الدافعة للبروتون عبر الغشاء الداخلي للميتوكوندريا. والنتيجة هي تدفق غير مقيد للإلكترونات عبر سلسلة نقل الإلكترونات (ETC) ، مما يرفع معدل استهلاك الأكسجين ويتسبب في وصول تنفس الميتوكوندريا إلى سعته القصوى20. القدرة التنفسية الاحتياطية (SRC) هي الفرق بين التنفس الأقصى والتنفس القاعدي ، مما يشير إلى قدرة الخلايا على الاستجابة للتغيرات في متطلبات الطاقة عند تحديها ، مما يشير إلى لياقة الخلية. الأهم من ذلك ، بالنسبة لاختبار Mito Stress في H-RPE ، يتفوق BAM15 على FCCP في تعزيز قدرة التنفس الميتوكوندريا (الشكل 4A ، B) ، حيث أن التنفس الأقصى والقدرة التنفسية الاحتياطية أعلى بكثير مع 10 ميكرومتر BAM15 مقارنة ب 500 نانومتر أو 1 ميكرومتر FCCP. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية بين أي من جرعتي FCCP. الحقن الثالث والأخير من الروتينون ومضاد الميسين A (Rot / AA) يثبط مجمعات الميتوكوندريا I و III ، على التوالي ، من ETC ، الذي يغلق التنفس الميتوكوندريا. أي OCR المتبقية يرجع إلى مصادر غير الميتوكوندريا21.
أثناء تحلل السكر ، يتم تحويل جزيء واحد من الجلوكوز إلى جزيئين من اللاكتات في غياب الأكسجين. ويرافق قذف اللاكتات من الخلية تدفق بروتون واحد لكل جزيء اللاكتات ، مما تسبب في تحمض الفضاء خارج الخلية. يتم قياس تدفق إنتاج البروتون في الوسائط من خلال التغيرات في ECAR. يتم تحديد مستويات تحلل السكر القاعدي أولا ، وبعد ذلك يتم حقن الجلوكوز في وسائط الفحص ، والتي تخلو من الجلوكوز ، للحث على تحلل السكر وبالتالي تعزيز مستويات ECAR22. يتم حقن Oligomycin للحث على "أعلى" ECAR لأنه يوقف إنتاج ATP الميتوكوندريا ، مما يجبر الخلية على اشتقاق ATP من خلال تحلل السكر. أخيرا ، يتم إيقاف تحلل السكر بإضافة 2DG ، الذي يثبط الهيكسوكيناز ، وهو أول إنزيم لتحلل السكر23. من المحتمل أن يكون أي ECAR متبق بسبب مصادر أخرى للتحمض ، مثل إنتاج CO2 بواسطة دورة TCA خلال OXPHOS ، ويشار إليه على أنه ECAR غير محلل للسكري. يتم حساب احتياطي تحلل السكر على أنه الفرق بين ECAR "الأعلى" و ECAR في وجود الجلوكوز. قدرة تحلل السكر هي مجموع تحلل السكر واحتياطي تحلل السكر.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64572/64572fig1v2.jpg"> الشكل 1: مكونات اللوحة وخرطوشة المستشعر . (أ) يتم عرض الجهاز وبرنامج تحليل البيانات وواجهة إعداد البروتوكول. في تخطيط لوحة الاستزراع المكونة من 96 بئرا ، يتم طلاء الخلايا في الآبار ذات اللون الأزرق ويتم تمييز الآبار ذات الزوايا الأربع باللون الأسود ، لأنها تعمل كآبار تصحيح خلفية تحتوي على وسائط فقط (ولا تحتوي على خلايا). (ب) توجد أربعة منافذ أدوية لكل بئر من خرطوشة المستشعر حيث يمكن تحميل الأدوية A و B و C و D. يتم سرد الأحجام إلى ماصة في كل منفذ بناء على حسابات الاستعدادات 10x مخزون المخدرات. (ج) تتكون خرطوشة المستشعر من مجسات مستشعر توضع مباشرة في لوحة المرافق المملوءة بالمعايرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64572/64572fig1v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64572/64572fig2v2.jpg"> الشكل 2: الجدول الزمني للفحص. يتم زرع الخلايا في لوحة زراعة الخلايا. بمجرد أن تصبح جاهزا ، يتضمن الفحص إجراء لمدة 2 يوما متبوعا بالقياس الكمي لمحتوى البروتين باستخدام مقايسة BCA وتحليل البيانات اللاحق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64572/64572fig2v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64572/64572fig3v2.jpg"> الشكل 3: التمثيلات البيانية التمثيلية لاختبار الإجهاد التاجي واختبار الإجهاد المحلل . يتم تصوير حسابات (أ) اختبار إجهاد ميتو و (ب) معلمات اختبار الإجهاد تحلل السكر في التخطيط. (C) يتم عرض منحنى استهلاك الأكسجين التمثيلي (OCR) و (D) معلمات اختبار إجهاد ميتو ل H-RPE. (ه) يتم عرض منحنى معدل التحمض خارج الخلية التمثيلي (ECAR) و (F) معلمات اختبار الإجهاد التحلل للسكر ل H-RPE. أشرطة الخطأ تعني ± التسويق عبر محرك البحث. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64572/64572fig3v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64572/64572fig4v2.jpg"> الشكل 4: مقارنة بين BAM15 مقابل FCCP كعامل فصل. اختبار إجهاد ميتو على H-RPE يقارن فعالية تحفيز التنفس الأقصى باستخدام 10 ميكرومتر BAM15 أو 500 نانومتر FCCP أو 1 ميكرومتر FCCP ، مع إظهار منحنى (A) معدل استهلاك الأكسجين (OCR) و (B) معلمات اختبار إجهاد ميتو. أشرطة الخطأ تعني ± SEM. **** p ≤ 0.0001 ؛ NS ، ليست كبيرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64572/64572fig4v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>اختبر</td>
			<td>الجلوكوز (مللي مول)</td>
			<td>جلوتاماكس (مللي مول)</td>
			<td>بيروفات الصوديوم (mM)</td>
			<td>هيبس (مللي أم)</td>
		</tr><tr><td>ميتو اختبار الإجهاد</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>اختبار الإجهاد حال للسكر</td>
			<td>اي</td>
			<td>0.5</td>
			<td>اي</td>
			<td>1</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: تركيز المكملات المضافة إلى وسائط الفحص لاختبارات ميتو والإجهاد المحلل للسكتري.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> اختبر</td>
			<td>المنفذ أ</td>
			<td>المنفذ ب</td>
			<td>المنفذ ج</td>
		</tr><tr><td>ميتو اختبار الإجهاد</td>
			<td>أوليغوميسين 2.5 ميكرومتر</td>
			<td>FCCP 500 نانومتر أو BAM15 10 ميكرومتر</td>
			<td>روتينون 2 ميكرومتر وأنتيمايسين أ 2 ميكرومتر</td>
		</tr><tr><td>اختبار الإجهاد حال للسكر</td>
			<td>الجلوكوز 10 مللي متر</td>
			<td>أوليغوميسين 2 ميكرومتر</td>
			<td>2-ديوكسي جلوكوز 50 مللي متر</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: تركيزات حقن منفذ الدواء لاختبارات ميتو والإجهاد المحلل للسكريا. من المهم ملاحظة أن هذه هي التركيزات النهائية التي تتعرض لها الخلايا بعد حقن الأدوية في كل بئر. يجب تحضير الأدوية أقوى 10 مرات عند تحميل منافذ الدواء.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>مصطلح</td>
			<td colspan="4">تعريف</td>
		</tr><tr><td>كاليبرانت</td>
			<td colspan="4">المعاير هو حل يستخدم لمعايرة خرطوشة المستشعر. صياغته هي الملكية ولها تكوين مماثل ل PBS.</td>
		</tr><tr><td>خرطوشة الاستشعار</td>
			<td colspan="4">تحتوي خرطوشة المستشعر على اثنين من الفلوروفورات المضمنة في غلاف خرطوشة المستشعر المتصلين بحزم الألياف الضوئية التي تنبعث منها الضوء ، مما يثير الفلوروفور. يقيس أحد الفلوروفور تدفق الأكسجين ويقيس الآخر تدفق البروتون. تم تجهيز كل خرطوشة مستشعر أيضا ب 4 منافذ للسماح بالإدارة المتسلسلة لما يصل إلى 4 مركبات لكل بئر أثناء الفحص.</td>
		</tr><tr><td>لوحة المرافق</td>
			<td colspan="4">تستخدم لوحة المرافق (المعروفة أيضا باسم لوحة المعايرة) لمعايرة المستشعرات. يتم وضع محلول Calibrant في لوحة المرافق.</td>
		</tr><tr><td>ميتو اختبار الإجهاد</td>
			<td colspan="4">اختبار Mito Stress هو اسم الفحص الذي يوفر ملف الطاقة الحيوية لتنفس الميتوكوندريا عن طريق رسم التغييرات في التعرف الضوئي على الحروف بمرور الوقت.</td>
		</tr><tr><td>اختبار الإجهاد حال للسكر</td>
			<td colspan="4">اختبار الإجهاد تحلل السكر هو اسم الفحص الذي يوفر ملف تعريف الطاقة الحيوية تحلل السكر عن طريق رسم التغييرات في ECAR بمرور الوقت.</td>
		</tr><tr><td>معدل استهلاك الأكسجين (OCR)</td>
			<td colspan="4">معدل استهلاك الأكسجين هو مقياس لتدفق الأكسجين (pmol / min) ويشير إلى حالة التمثيل الغذائي للميتوكوندريا.</td>
		</tr><tr><td>معدل التحمض خارج الخلية (ECAR)</td>
			<td colspan="4">معدل التحمض خارج الخلية هو مقياس لتدفق البروتون (mpH / min) ويشير إلى حالة التمثيل الغذائي للسكري.</td>
		</tr><tr><td>برنامج الموجة</td>
			<td colspan="4">يستخدم برنامج Wave لبرمجة الفحص وتحليل البيانات اللاحق</td>
		</tr><tr><td>استهلاك الأكسجين غير الميتوكوندريا</td>
			<td colspan="4">الحد الأدنى لقياس المعدل بعد حقن روتينون / أنتيمايسين أ</td>
		</tr><tr><td>التنفس القاعدي</td>
			<td colspan="4">(قياس المعدل الأخير قبل الحقن الأول) - (معدل التنفس غير الميتوكوندريا)</td>
		</tr><tr><td>التنفس الأقصى</td>
			<td colspan="4">(الحد الأقصى لقياس المعدل بعد حقن FCCP) - (التنفس غير الميتوكوندريا)</td>
		</tr><tr><td>تسرب H+ (بروتون)</td>
			<td colspan="4">(الحد الأدنى لقياس المعدل بعد حقن Oligomycin) - (التنفس غير الميتوكوندريا</td>
		</tr><tr><td>إنتاج ATP</td>
			<td colspan="4">(قياس المعدل الأخير قبل حقن أوليغومايسين) - (الحد الأدنى لقياس المعدل بعد حقن أوليغوميسين)</td>
		</tr><tr><td>سعة تنفسية احتياطية</td>
			<td colspan="4">(التنفس الأقصى) – (التنفس القاعدي)</td>
		</tr><tr><td>القدرة التنفسية الاحتياطية كنسبة مئوية</td>
			<td colspan="4">(التنفس الأقصى) / (التنفس القاعدي) × 100</td>
		</tr><tr><td>كفاءة اقتران</td>
			<td colspan="4">معدل إنتاج ATP) / (معدل التنفس القاعدي) × 100</td>
		</tr><tr><td>تحلل</td>
			<td colspan="4">(الحد الأقصى لقياس المعدل قبل حقن Oligomycin) - (قياس المعدل الأخير قبل حقن الجلوكوز)</td>
		</tr><tr><td>قدرة تحلل السكر</td>
			<td colspan="4">(الحد الأقصى لقياس المعدل بعد حقن Oligomycin) - (قياس المعدل الأخير قبل حقن الجلوكوز)</td>
		</tr><tr><td>احتياطي تحلل السكر</td>
			<td colspan="4">(قدرة تحلل السكر) - (تحلل السكر)</td>
		</tr><tr><td>احتياطي حال للسكر كنسبة مئوية</td>
			<td colspan="4">(معدل قدرة تحلل السكر) / (تحلل السكر) × 100</td>
		</tr><tr><td>تحمض غير تحلل السكر</td>
			<td colspan="4">آخر معدل قياس قبل حقن الجلوكوز</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 3: قائمة تعاريف المكونات الرئيسية للفحص.

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry at JoVE.com

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

تعكس الحالة الأيضية للخلايا الظهارية الصبغية في شبكية العين البشرية (H-RPE) صحتها ووظيفتها. يظهر هنا بروتوكول محسن لفحص التدفق الأيضي في الوقت الفعلي ل H-RPE باستخدام قياس التنفس عالي الدقة.

تحليل في الوقت الحقيقي للطاقة الحيوية في الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية الأولية باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...

يبرز استجواب ملامح الطاقة الحيوية في الوقت الفعلي للأوكسفوس وتحلل السكر كعامل رئيسي في توصيف صحة RPE ووظيفتها. يتيح قياس التنفس عالي الدقة طريقة فعالة لمقارنة الحالة الأيضية ل RPE الطبيعي والمريض. تتميز هذه التقنية بالاستكشاف المتزامن لكل من oxphos وتحلل السكر من خلال قياس معدل استهلاك الأكسجين ، OCR ومعدل التحمض خارج الخلية ، ECAR.خلايا RPE هي خلايا نشطة للغاية من الناحية الأيضية وهي واحدة من أولى الخلايا التي تتدهور أثناء AMD. فهم وظيفة التمثيل الغذائي والميتوكوندريا ، يجعل من الممكن تطوير أدوية جديدة. للبدء ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من معلق الخلية في وسط RPE البشري إلى تركيز نهائي يبلغ 20،000 خلية لكل 100 ميكرولتر في كل بئر.وتأكد من ترك آبار الزاوية الأربعة فارغة. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لضمان تعليق خلية متجانسة ، باستخدام ماصة متعددة القنوات لسهولة واتساق. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط فقط إلى آبار الزاوية الأربعة الفارغة لتصحيح الخلفية.اترك لوحة زراعة الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للمساعدة في تقليل تأثيرات الحافة. ثم ضعه في الحاضنة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية وترطيبها. بعد الحضانة الليلية ، افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر للتحقق من مورفولوجيتها ومستوى تصبغها قبل تغيير الوسائط.في أيام الفحص اللاحقة ، تأكد من أن الخلايا متقاربة مع مورفولوجيا مميزة تشبه الحصى وتكتسب تصبغا بمرور الوقت. لضمان ترطيب خرطوشة المستشعر في اليوم السابق للفحص ، املأ كل بئر من لوحة المرافق ب 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات وضع خرطوشة المستشعر المغمورة في الماء على لوحة المرافق. احتفظ بحوالي 20 ملليلترا من محلول المعايرة طوال الليل في فرن مرطب بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون.قم بتشغيل أداة قياس التنفس عالية الدقة وابدأ تشغيل البرنامج للسماح للأداة بالاستقرار عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في يوم الفحص ، استبدل الماء الموجود في لوحة المرافق بحجم متساو من محلول المعايرة الدافئ قبل 45 دقيقة على الأقل من تشغيل الفحص. قم بتسخين 25 ملليلتر من وسائط فحص اختبار الإجهاد Mito المحضرة بدون الفينول الأحمر إلى 37 درجة مئوية وتصفية الوسائط المعدلة بدرجة الحموضة 7.4 ، باستخدام وحدة مرشح أعلى الأنبوب.قم بإزالة وسائط RPE البشرية من لوحة زراعة الخلايا وأضف 100 ميكرولتر من وسائط الفحص المحضرة حديثا. ثم ضع طبق زراعة الخلايا في فرن مرطب بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة قبل بدء الفحص. تحتوي كل خرطوشة مستشعر على أربعة منافذ توصيل كاشف لكل بئر لحقن مركبات الاختبار في آبار لوحة زراعة الخلايا أثناء الفحص.قم بإعداد ثلاثة ملليلتر من محاليل الأدوية Tenex لكل منها ، عن طريق تخفيف مخزون الأدوية في وسائط الفحص الخاصة بها. بعد ذلك ، ماصة 20 ميكرولتر من مخزون أدوية Tenex في المنفذ A ، و 22 ميكرولتر في المنفذ B و 25 ميكرولتر في المنفذ C لتحقيق تركيز الدواء النهائي المحدد في كل بئر. بعد ذلك في برنامج التحليل ، افتح علامة تبويب القوالب ، وحدد اختبار الإجهاد Mito واملأ تعريفات المجموعة.تفاصيل المدخلات حول استراتيجية الحقن لعقاقير اختبار الإجهاد Mito. ثم أدخل تفاصيل عن المجموعات التجريبية المختلفة في الفحص للتحكم أو العلاج. تفاصيل الإدخال على وسائط الفحص لإضافة مكملات مختلفة وتركيزاتها المحددة إلى وسائط الفحص الأساسية.وأخيرا ، أضف نوع الخلية. انقر فوق علامة التبويب التالية ثم على خريطة اللوحة لتعيين مجموعات مختلفة قيد الفحص لموقعها المحدد على لوحة البئر 96. عند الانتهاء من خريطة اللوحة ، انقر فوق علامة تبويب البروتوكول لمراجعة بروتوكول الأداة لبروتوكول اختبار الإجهاد Mito الافتراضي.ثم انقر فوق تشغيل الفحص ، وأدخل خرطوشة المستشعر ، المغمورة في محلول المعايرة في لوحة المرافق للمعايرة. تستغرق هذه العملية حوالي 25 دقيقة ويتم معايرة كل مستشعر حيوي بشكل مستقل ، بناء على خرج المستشعر المقاس في محلول المعايرة بتركيز الأس الهيدروجيني والأكسجين المعروف. عند الانتهاء من المعايرة ، قم بإزالة لوحة المرافق وأدخل لوحة زراعة الخلية.بعد قياس خط الأساس ، تقوم الأداة تلقائيا بحقن محلول الدواء Port A في كل بئر يتبع ثلاث حلقات من الخلط والقياس ، ثلاث دقائق لكل منها. يحدث نفس النمط بعد كل حقن دواء لاحق في المنافذ الأخرى. بمجرد اكتمال التشغيل ، قم بإزالة لوحة زراعة الخلايا وخرطوشة المستشعر.لأغراض مراقبة الجودة ، تأكد من حقن جميع منافذ الدواء وخرطوشة المستشعر عن طريق فحص المنافذ بحثا عن عدم وجود بقايا أدوية متبقية. بعد ذلك ، افحص الخلايا الموجودة في الصفيحة الدقيقة لزراعة الخلايا تحت المجهر للتأكد من تلاقى الطبقة الأحادية للخلايا. ثم تخلص من وسائط الفحص واستبدلها ب 60 ميكرولترا من مخزن مؤقت x تحلل واحد في كل بئر.لف حواف اللوحة في بارافيلم لمنع التبخر ، وضعها في مجمد سالب 80 درجة مئوية للمساعدة في تحلل الخلية طوال الليل قبل تحديد كمية محتوى البروتين ، باستخدام مقايسة BCA. لكل تحليل للبيانات ، قم بتطبيع جميع البيانات بقسمة معدل استهلاك الأكسجين أو OCR ومعدل التحمض خارج الخلية أو قيم ECAR على ميكروغرام من البروتين في كل بئر. ثم قم بتصدير منشئ تقرير اختبار الإجهاد Mito ، والذي يستخدم وحدات ماكرو Excel لحساب معلمات اختبار الإجهاد Mito تلقائيا باستخدام برنامج تحليل البيانات.باتباع نفس الخطوات الموضحة لاختبار إجهاد ميتو ، يمكن إجراء اختبار الإجهاد تحلل السكر ، باستثناء مكملات وسائط الفحص وحقن الأدوية المختلفة كما هو موضح في الجدول الأول والجدول الثاني. تقيس الأداة في وقت واحد كلا من OCR و ECAR لكل تشغيل. بالنسبة لاختبار إجهاد ميتو ، تستند حسابات المحيط إلى قراءات OCAR ، بينما بالنسبة لاختبار الإجهاد المحلل للسكر ، تستند حسابات المعلمات إلى قراءات ECAR.فيما يلي منحنى OCR الناتج عن إجراء اختبار إجهاد Mito على خلايا RPE البشرية الأولية. يتم عرض حسابات معلمات اختبار الإجهاد Mito كرسوم بيانية شريطية وبالمثل ، هذا هو منحنى ECAR ، الناتج عن إجراء اختبار الإجهاد تحلل السكر على خلايا RPE البشرية الأولية ويتم عرض الحسابات كرسوم بيانية شريطيةلتحسين حقن دواء المنفذ B لاختبار إجهاد ميتو ، تمت مقارنة فعالية عاملين منفصلين في زيادة التعرف الضوئي على الحروف في خلايا RPE البشرية الأولية. وجد أن BAM15 يتفوق على FCCP في تعزيز القدرة التنفسية للميتوكوندريا كما يتضح من التنفس الأقصى الأعلى بشكل ملحوظ والقدرة التنفسية الاحتياطية مع BAM15 ، مقارنة ب FCCP. من المهم أن تتذكر ترطيب خرطوشة المستشعر في اليوم السابق لتشغيل الفحص.تسمح هذه التقنية للباحثين بتوصيف ملامح الطاقة الحيوية لخلايا RPE بشكل أفضل وفهم كيف تظهر خلايا RPE مرونة أيضية استجابة للمحفزات المسببة للأمراض المختلفة.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

الإنسان الشعبي الأساسي الخلايا الظهارية نمت من Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

ملامح التعبير microRNA من خلايا الجذع الإنسان، الشبكية المشتقة من الظهارة الصبغية المحفزة، والجنين الظهارة الصبغية الشبكية

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

عالية الدقة قياس التنفس لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في Permeabilized وخلايا سليمة

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

سوبريتينال زرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى نموذج كبير العينين من ضمور الجغرافية

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

الثقافات الخلية الأولية من ظهارة صباغ الشبكية الماوس

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

تشريح فعال وثقافة الخلايا الظهارية صبغة الفأر الأولية

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

قياس التنفس عالي الدقة لتقييم الطاقة الحيوية في الخلايا والأنسجة باستخدام مقاييس التنفس القائمة على الغرفة والصفائح

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

استخدام محلل التدفق الأيضي للخلايا في الوقت الفعلي لمراقبة الطاقة الحيوية لمنطقة العظام

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

الثقافة الأولية للخلايا الظهارية الصبغية الشبكية الخنازير

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...