Name: real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry
Uploaded: 2023-02-03T13:00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry at JoVE.com

Это исследование было частично поддержано грантами: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); Программа постдокторских стипендий BrightFocus Foundation в области исследований дегенерации желтого пятна (M2021010F, D.Y.S.); Министерство обороны, Программа исследований спинального зрения под номером VR180132 (M.S.-G. и L.A.K.); Национальный глазной институт Национальных институтов здравоохранения под номером R01EY027739 (L.A.K.). Выражаем благодарность донорам программы BrightFocus Foundation «Исследование макулярной дегенерации M2021010F» за поддержку этого исследования. Схемы были созданы с помощью Biorender.com

<ol>
	<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+impairment+correlates+with+increased+sensitivity+of+aging+RPE+cells+to+oxidative+stress.">Mitochondria impairment correlates with increased sensitivity of aging RPE cells to oxidative stress.</a> Journal of Ocular Biology Diseases and Informatics. 3 (3), 92-108 (2010).</li><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT+and+EndMT:+Emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration.">EMT and EndMT: Emerging roles in age-related macular degeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 4271 (2020).</li><li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode.">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 2-16 (2014).</li><li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxygen+consumption+rate+(OCR)+and+extracellular+acidification+rate+(ECAR)+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism.">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protocol. 8 (10), 2850 (2018).</li><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion.">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li><li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+PGC-1&#945;+drives+metabolic+dysfunction+in+TGFbeta2-induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells.">Suppression of PGC-1&#945; drives metabolic dysfunction in TGFbeta2-induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4701 (2021).</li><li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 15, 896786 (2022).</li><li>Satish, S., Philipose, H., Rosales, M. A. B., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaceutical+induction+of+PGC-1&#945;+promotes+retinal+pigment+epithelial+cell+metabolism+and+protects+against+oxidative+damage.">Pharmaceutical induction of PGC-1&#945; promotes retinal pigment epithelial cell metabolism and protects against oxidative damage.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 9248640 (2018).</li><li>Ferrington, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+bioenergetics+and+enhanced+resistance+to+oxidative+stress+in+human+retinal+pigment+epithelial+cells+from+donors+with+age-related+macular+degeneration.">Altered bioenergetics and enhanced resistance to oxidative stress in human retinal pigment epithelial cells from donors with age-related macular degeneration.</a> Redox Biology. 13, 255-265 (2017).</li><li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+identifies+compounds+that+protect+RPE+cells+from+physiological+stressors+present+in+AMD.">High-throughput screening identifies compounds that protect RPE cells from physiological stressors present in AMD.</a> Experimental Eye Research. 185, 107641 (2019).</li><li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metabolic+stress+in+retinal+pigment+epithelial+cells+is+sufficient+to+induce+photoreceptor+degeneration.">Hypoxia-induced metabolic stress in retinal pigment epithelial cells is sufficient to induce photoreceptor degeneration.</a> Elife. 5, 14319 (2016).</li><li>Ishii, M., Beeson, G., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+C3a+receptor+activation+in+oxidatively+stressed+epithelial+cells+reduces+mitochondrial+respiration+and+metabolism.">Mitochondrial C3a receptor activation in oxidatively stressed epithelial cells reduces mitochondrial respiration and metabolism.</a> Frontiers in Immunology. 12, 628062 (2021).</li><li>Rosales, M. A. B., Shu, D. Y., Iacovelli, J., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PGC-1&#945;+in+RPE+induces+mesenchymal+transition+and+promotes+retinal+degeneration.">Loss of PGC-1&#945; in RPE induces mesenchymal transition and promotes retinal degeneration.</a> Life Science Alliance. 2 (3), 201800212 (2019).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Huang, T., Long, M., Huo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+binding+to+cuprous+ions+of+protein+and+BCA+in+the+bicinchoninic+acid+protein+assay.">Competitive binding to cuprous ions of protein and BCA in the bicinchoninic acid protein assay.</a> Open Biomedical Engineering Journal. 4, 271-278 (2010).</li><li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test.">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100245 (2021).</li><li>Symersky, J., Osowski, D., Walters, D. E., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomycin+frames+a+common+drug-binding+site+in+the+ATP+synthase.">Oligomycin frames a common drug-binding site in the ATP synthase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13961-13965 (2012).</li><li>Divakaruni, A. S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+and+physiology+of+mitochondrial+proton+leak.">The regulation and physiology of mitochondrial proton leak.</a> Physiology. 26 (3), 192-205 (2011).</li><li>Demine, S., Renard, P., Arnould, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+uncoupling:+A+key+controller+of+biological+processes+in+physiology+and+diseases.">Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases.</a> Cells. 8 (8), 795 (2019).</li><li>Herst, P. M., Tan, A. S., Scarlett, D. J., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+oxygen+consumption+by+mitochondrial+gene+knockout+cells.">Cell surface oxygen consumption by mitochondrial gene knockout cells.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1656 (2-3), 79-87 (2004).</li><li>Pike Winer, L. S., Wu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+glycolytic+and+oxidative+substrate+flux+of+cancer+cells+in+a+microplate.">Rapid analysis of glycolytic and oxidative substrate flux of cancer cells in a microplate.</a> PLoS One. 9 (10), 109916 (2014).</li><li>Laussel, C., Leon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+toxicity+of+the+metabolic+inhibitor+2-deoxyglucose+and+associated+resistance+mechanisms.">Cellular toxicity of the metabolic inhibitor 2-deoxyglucose and associated resistance mechanisms.</a> Biochemical Pharmacology. 182, 114213 (2020).</li><li>Miyagishima, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+modulation+ameliorates+dominant+disease+phenotypes+of+CTRP5+variant+in+retinal+degeneration.">AMPK modulation ameliorates dominant disease phenotypes of CTRP5 variant in retinal degeneration.</a> Communications Biology. 4 (1), 1360 (2021).</li><li>Gao, Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+mitochondrial+uncoupler+BAM15+induces+ROS+production+for+treatment+of+acute+myeloid+leukemia.">The new mitochondrial uncoupler BAM15 induces ROS production for treatment of acute myeloid leukemia.</a> Biochemical Pharmacology. 198, 114948 (2022).</li><li>Kenwood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+mitochondrial+uncoupler+that+does+not+depolarize+the+plasma+membrane.">Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane.</a> Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).</li><li>Ye, F., Hoppel, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+oxidative+phosphorylation+in+human+skin+fibroblasts.">Measuring oxidative phosphorylation in human skin fibroblasts.</a> Analytical Biochemistry. 437 (1), 52-58 (2013).</li><li>Rountree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barofuse+a+novel+pressure-driven,+adjustable-throughput+perfusion+system+for+tissue+maintenance+and+assessment.">Barofuse a novel pressure-driven, adjustable-throughput perfusion system for tissue maintenance and assessment.</a> Heliyon. 2 (12), 00210 (2016).</li><li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluidics+system+for+resolving+concentration-dependent+effects+of+dissolved+gases+on+tissue+metabolism.">Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism.</a> Elife. 10, 66716 (2021).</li><li>Mas-Bargues, C., Garcia-Dominguez, E., Borras, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+approaches+to+determine+static+and+dynamic+redox+state-related+parameters.">Recent approaches to determine static and dynamic redox state-related parameters.</a> Antioxidants. 11 (5), 864 (2022).</li><li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers.">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).</li><li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+iPSC+disease+modelling+reveals+functional+and+structural+defects+in+retinal+pigment+epithelial+cells+harbouring+the+m.3243A+&gt;+G+mitochondrial+DNA+mutation.">Human iPSC disease modelling reveals functional and structural defects in retinal pigment epithelial cells harbouring the m.3243A &gt; G mitochondrial DNA mutation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12320 (2017).</li></ol>

Авторам раскрывать нечего.

Этот оптимизированный протокол для респирометрии высокого разрешения H-RPE включает использование BAM15 в качестве разъединителя вместо обычно используемого FCCP. В то время как в предыдущих исследованиях по респирометрии РПЭ с высоким разрешением использовался FCCP 9,24, BAM15, по-видимому, индуцирует более надежную индукцию максимальных уровней дыхания в H-RPE по сравнению с FCCP. В то время как FCCP и BAM15 безопасны для использования в клетках, BAM15, как сообщается, имеет меньше побочных эффектов в нормальных клетках по сравнению с FCCP или карбонилцианид-3-хлорфенилгидразоном (CCCP)25. Kenwood et al. показали, что BAM15 деполяризует митохондрии, не влияя на потенциал плазматической мембраны, тем самым индуцируя устойчивую максимальную частоту дыхания митохондрий при низкой цитотоксичности26. FCCP, с другой стороны, деполяризует как митохондрии, так и плазматическую мембрану и проявляет более высокую цитотоксичность26.
В протоколе есть несколько важных шагов, в том числе обеспечение того, чтобы ячейки были должным образом покрыты сливающимся, ровным и однородным монослоем RPE во всех экспериментальных лунках микропланшета. Зрелые RPE сильно зависят от OXPHOS для выработки энергии, и, таким образом, клеткам следует дать созреть в течение не менее 1 месяца, чтобы гарантировать, что RPE генерирует правильные базальные и максимальные показания OCR во время анализа. Дегазация планшета для клеточных культур в течение 1 ч при 37 °C в увлажненной печи (без CO 2) перед помещением его в прибор имеет решающее значение для точных показаний ECAR, поскольку CO2 может влиять на pH анализируемой среды. Важно не забывать увлажнять картридж датчика за день до анализа, чтобы убедиться, что он обеспечивает надежные показания OCR и ECAR в день анализа. Следует позаботиться о том, чтобы надлежащим образом восстановить наркотики, подлежащие инъекционному введению, и аликвотировать восстановленные запасы наркотиков в меньшие объемы для длительного хранения, чтобы свести к минимуму циклы замораживания/оттаивания. Крайне важно приготовить 10-кратные растворы лекарственных средств, которые разбавляются в соответствующих анализирующих средах (например, разбавляются в анализирующих средах стресс-теста Мито для стресс-теста Мито), чтобы учесть разбавление от инъекции лекарственного средства в каждую лунку, заполненную анализирующей средой. С каждой последующей инъекцией лекарственного средства в каждой лунке появляется больше среды, и, таким образом, объемы загружаемого лекарственного средства увеличиваются с каждой инъекцией, и следует следить за объемами, указанными в протоколе. Важно выполнить проверку качества по завершении эксперимента, исследуя сенсорный картридж, чтобы убедиться, что остаточное лекарство не видно, и наблюдая за пластиной для клеточной культуры под микроскопом, чтобы убедиться, что сливающийся и однородный клеточный монослой остается.
Изменения в этом протоколе включают введение различных наркотиков в порты и определение того, как эти наркотики влияют на показания OCR и ECAR. Одной из популярных модификаций является инъекция экспериментального препарата по выбору в качестве порта А перед инъекцией обычных препаратов Mito или гликолитического стресс-теста. Этот тип протокола дает представление о том, как острая инъекция выбранного препарата влияет на последующие параметры OXPHOS и гликолитики. Другие модификации включают изучение различных типов клеток; это требует первоначального устранения неполадок оптимальной плотности посевных ячеек и оптимизации анализируемой среды путем обеспечения того, чтобы базальные показания варьировались от 50-100 пмоль/мин для OCR и 10-20 миль в час / мин для ECAR. Оптимальные концентрации вводимых препаратов необходимо определять для каждого нового исследуемого типа клеток, наблюдая за реакциями OCR и ECAR на серийное разведение лекарств.
Ключевым ограничением протокола является то, что жизнеспособность клеток со временем уменьшается, поскольку клетки не находятся в инкубаторе CO2 в их нормальной питательной среде, и, таким образом, анализ должен быть завершен в течение 3-4 часов, чтобы обеспечить максимальную жизнеспособность клеток. Кроме того, воздействие митохондриальных токсинов, вводимых в каждую лунку, может со временем еще больше снизить жизнеспособность клеток. После завершения анализа клетки должны быть лизированы для оценки содержания белка для нормализации показаний OCR и ECAR, и, таким образом, те же клетки не могут быть собраны для последующих анализов молекулярной биологии.
Альтернативы Seahorse для биоэнергетического профилирования включают Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 и Resipher (Lucid Scientific)7. Oroboros O2k представляет собой закрытый двухкамерный респирометр, в котором используются полярографические кислородные электроды типа S1 Clark. В то время как Oroboros O2k производит высокочувствительные измерения метаболического потока в режиме реального времени, устройство является трудоемким, поскольку оператор должен вручную вводить каждый препарат30. BaroFuse - это новая многоканальная микрофлюидная перфузионная система, которая использует давление газа для проведения нескольких параллельных экспериментов по перфузии и связана с системой обнаружения кислорода для измерения OCR. Преимущество этой системы потокового культивирования заключается в том, что функция и жизнеспособность тканей сохраняются, в отличие от Seahorse, где жизнеспособность клеток уменьшается при более длительных анализах. Resipher использует высокочувствительные оптические датчики кислорода для измерения OCR, когда клетки находятся в 96-луночной пластине в инкубаторе, что позволяет проводить непрерывные измерения OCR в течение нескольких недель или месяцев. Примечательно, что эти приборы не измеряют ECAR, и, таким образом, Seahorse имеет преимущество одновременного исследования как OXPHOS, так и гликолиза.
Изучение биоэнергетических профилей OXPHOS и гликолиза в режиме реального времени становится ключевым фактором в характеристике здоровья и функции RPE. Респирометрия высокого разрешения позволяет эффективно сравнивать метаболический статус нормального и больного РПЭ, тем самым открывая новые возможности скрининга эффективности лекарств при заболеваниях сетчатки, таких как ВМД и ПВР. Будущие направления респирометрии высокого разрешения на РПЭ включают оптимизацию протокола для изучения биоэнергетических профилей высокополяризованных монослоев РПЭ, выращенных на поперечных фильтрах. Calton et al. (2016) успешно достигли этого, разрезав треугольный участок поляризованного монослоя RPE, выращенного на поперечных фильтрах31. Дальнейшее расширение методики включает изучение биоэнергетических профилей индуцированного плюрипотентного РПЭ, полученного из стволовых клеток (iPSC-RPE), выделенного у пациентов с различными дегенеративными заболеваниями сетчатки32. Изучение того, как патогенные цитокины, участвующие в ВМД и PVR, влияют на динамический характер метаболизма RPE, может выявить метаболические уязвимости, которые могут помочь в идентификации новых лекарственных мишеней.

Пигментные эпителиальные клетки сетчатки (RPE) существуют в виде монослоя пигментированных эпителиальных клеток, стратегически расположенных между фоторецепторами и фенестрированным эндотелием хориокапилляра. RPE обладают высокой метаболической активностью и выполняют множество функций, включая (1) фагоцитоз пролитых фоторецепторных дисков, (2) рециркуляцию зрительного пигмента для поддержания зрительного цикла, (3) транспорт питательных веществ, метаболитов, ионов и воды, (4) поглощение света, (5) защиту от фотоокисления, (6) секрецию основных факторов для поддержания целостности сетчатки и (7) формирование наружного гемато-ретинального барьера1 . Дегенерация РПЭ связана с метаболической дисфункцией и митохондриальными дефектами, что приводит к слепоте глазных заболеваний, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и пролиферативная витреоретинопатия (ПВР)2.
Два ключевых биоэнергетических пути включают гликолиз, который происходит в цитоплазме, и окислительное фосфорилирование (OXPHOS), которое происходит в митохондриях. Во время гликолиза одна молекула глюкозы превращается в две молекулы пирувата и чистое производство двух молекул аденозинтрифосфата (АТФ). В отличие от гликолиза, OXPHOS производит гораздо более высокие уровни АТФ (~ 32-38 молекул АТФ на молекулу глюкозы). Примечательно, что OXPHOS потребляет кислород и требует функциональных митохондрий, тогда как гликолиз происходит в цитоплазме и не требует кислорода.
До внедрения методов на основе флуоресценции или фосфоресценции для изучения митохондриального дыхания уровни кислорода измеряли в пермеабилизированных клеточных суспензиях в камерах, оснащенных кислородным электродомтипа Кларка 3. Хотя электрод Кларка намного дешевле, чем респирометрия на основе флуоресценции, и работает в неадгезивных клетках, он имеет относительно низкую пропускную способность, при этом каждый дыхательный ход длится около 15-20 минут и требует гораздо большего количества клеток для каждого образца3. Таким образом, метод респирометрии на основе флуоресценции в значительной степени заменил электрод Кларка и стал популярным методом в области метаболизма и митохондриальных исследований.
Этот протокол описывает высокопроизводительный метод респирометрии на основе флуоресценции с высоким разрешением, который кинетически измеряет OXPHOS и гликолитические биоэнергетические профили живых клеток. Поскольку процесс OXPHOS потребляет кислород, биоэнергетический профиль для OXPHOS создается путем картирования изменений скорости потребления кислорода (OCR) с течением времени4. В этом методе два флуорофора встроены в гильзу картриджа датчика, которая соединена с волоконно-оптическими пучками, которые излучают свет, возбуждая флуорофоры. Изменения в флуорофорном излучении измеряются высокочувствительными флуоресцентными датчиками и передаются через волоконно-оптический пучок для преобразования в показанияOCR 5. Флуорофор гасится кислородом, что позволяет определять уровень внеклеточного кислорода в анализируемой среде, известный как поток кислорода или OCR. Другой флуорофор представляет собой датчик pH, чувствительный к изменениям оттока протонов, который преобразуется в меру скорости внеклеточного подкисления (ECAR). Во время измерений волоконно-оптические пучки со встроенными флуорофорами опускаются на 200 мкм над монослоем ячейки, создавая переходную микрокамеру, которая обеспечивает быстрые показания в режиме реального времени. Как только обнаруживается 10-процентное изменение уровня кислорода или протонов, датчики поднимаются вверх, позволяя большему объему среды смешиваться с переходной микрокамерной средой, восстанавливая значения OCR и ECAR до исходного уровня. Каждый сенсорный картридж оснащен четырьмя портами, позволяющими последовательно вводить до четырех соединений в лунку во время анализа. Измерения могут быть собраны до и после инъекции соединений в каждый порт, раскрывая ключевую информацию о метаболическом статусе клеток.
Изучение этих двух различных метаболических путей может привести к важным открытиям относительно метаболического статуса RPE после воздействия различных патогенных стимулов и, таким образом, может быть использовано для проверки эффективности лекарств в восстановлении метаболической целостности RPE 6,7,8. Появление высокопроизводительной респирометрии и наличие специфических митохондриальных ингибиторов стимулировали больше исследований в определении биоэнергетических профилей RPE и выявлении дефектов метаболизма и митохондрий во время болезненных состояний 6,7,8,9,10,11,12,13 . Респирометрия высокого разрешения выявила ключевую роль метаболического перепрограммирования RPE при патологиях сетчатки, таких как AMD и PVR. Двумя ключевыми цитокинами, участвующими в патогенезе ВМД и ПВР, являются трансформирующий фактор роста-бета-2 (TGFβ2) и фактор некроза опухоли-альфа (TNFα). Индукция эпителиально-мезенхимального перехода (ЕМТ) TGFβ2 сопровождается митохондриальной дисфункцией, подавлением OXPHOS и компенсаторным увеличением гликолитической емкости в RPE6. Совсем недавно было показано, что провоспалительный цитокин, TNFα, индуцирует значительное повышение регуляции базального OXPHOS и снижение гликолиза в H-RPE7. Введение диметилфумарата значительно подавляло TNFα-индуцированное воспаление в H-RPE и восстанавливало морфологию митохондрий и базальные биоэнергетические профили7. Расходящиеся метаболические профили, индуцированные этими двумя факторами роста, стимулируют интригующие механистические вопросы относительно участия метаболического перепрограммирования в заболеваниях сетчатки. В следующем протоколе описаны этапы оценки OXPHOS и гликолитических биоэнергетических профилей в H-RPE с использованием респирометрии высокого разрешения.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D8375-5G</td>
			<td>Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>229597</td>
			<td>BCA Assay 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from&#160;Streptomyces&#160;sp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8674-25MG</td>
			<td>Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAM15</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1760-5MG</td>
			<td>Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Assay</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>23225</td>
			<td>To determine total protein content in each well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibrant Solution</td>
			<td>Seahorse Bioscience&#160;</td>
			<td>100840-000</td>
			<td>Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lysis buffer 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technologies</td>
			<td>9803S</td>
			<td>&#160;Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8644-100ML</td>
			<td>Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO, Cell culture grade</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td>For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920-10MG</td>
			<td>Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887-100ML</td>
			<td>Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-RPE &#8211; Human Retinal Pigment Epithelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>194987</td>
			<td>Primary human fetal RPE cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin - CAS 1404-19-9 - Calbiochem</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>495455-10MG</td>
			<td>ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td>To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor</td>
			<td>Gold Biotechnology Inc</td>
			<td>50-153-2823</td>
			<td>Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReagentPack&#160;Subculture Reagents, 100 mL</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-5034</td>
			<td>Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875-1G</td>
			<td>Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit - RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>195409</td>
			<td>Media for primary human fetal RPE cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 Analyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>High-Resolution Respirometry Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XFe96 FluxPak</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>102416-100</td>
			<td>This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 &#181;m pore size</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>SCGP00525&#160;</td>
			<td>Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy H1 Plate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td>Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium without phenol red&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>103335-100</td>
			<td>Base media for running the Seahorse assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry

Метаболическая дисфункция пигментных эпителиальных клеток сетчатки (РПЭ) является ключевым патогенетическим фактором заболеваний сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация (ВМД) и пролиферативная витреоретинопатия (ПВР). Поскольку RPE являются высокометаболически активными клетками, изменения в их метаболическом статусе отражают изменения в их здоровье и функциях. Респирометрия высокого разрешения позволяет в режиме реального времени проводить кинетический анализ двух основных биоэнергетических путей, гликолиза и митохондриального окислительного фосфорилирования (OXPHOS), путем количественной оценки скорости внеклеточного подкисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR) соответственно. Ниже приведен оптимизированный протокол для проведения респирометрии высокого разрешения на первичных пигментных эпителиальных клетках сетчатки человека (H-RPE). Этот протокол содержит подробное описание этапов создания биоэнергетических профилей РПЭ для определения их базальной и максимальной ОКСФОС и гликолитических способностей. Воздействие H-RPE на различные инъекции лекарств, нацеленных на митохондриальный и гликолитический механизм, приводит к определенным биоэнергетическим профилям, на основе которых можно рассчитать ключевые метаболические параметры. В этом протоколе подчеркивается повышенная реакция BAM15 в качестве разъединяющего агента по сравнению с карбонильным цианидом-трифторметоксифенилгидразоном (FCCP) для индуцирования максимальной дыхательной способности в RPE. Этот протокол может быть использован для изучения биоэнергетического статуса РПЭ при различных состояниях заболевания и проверки эффективности новых препаратов в восстановлении базального метаболического статуса РПЭ.

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry at JoVE.com

Real-Time Analysis of Bioenergetics in Primary Human Retinal Pigment Epithelial Cells Using High-Resolution Respirometry

Метаболический статус пигментных эпителиальных клеток сетчатки человека (H-RPE) отражает их здоровье и функцию. Здесь представлен оптимизированный протокол для изучения метаболического потока H-RPE в режиме реального времени с использованием респирометрии высокого разрешения.

Анализ биоэнергетики в первичных пигментных эпителиальных клетках сетчатки человека в режиме реального времени с использованием респирометрии высокого разрешения

Metabolic dysfunction of retinal pigment epithelial cells (RPE) is a key pathogenic driver of retinal diseases such as age-related macular degeneration ...

Изучение биоэнергетических профилей оксфоса и гликолиза в режиме реального времени становится ключевым фактором в характеристике здоровья и функции RPE. Респирометрия высокого разрешения позволяет эффективно сравнивать метаболический статус нормального и больного РПЭ. Преимущество этого метода заключается в одновременном исследовании как оксфоса, так и гликолиза путем измерения скорости потребления кислорода, OCR и скорости внеклеточного подкисления, ECAR.Клетки RPE являются высокометаболически активными клетками и являются одними из первых клеток, которые дегенерируют во время ВМД. Понимание их метаболической и митохондриальной функции позволяет разрабатывать новые лекарства. Для начала добавьте 100 микролитров на лунку клеточной суспензии в среде RPE человека до конечной концентрации 20 000 клеток на 100 микролитров в каждой лунке.И убедитесь, что четыре угловых колодца пусты. Пипетка поднимается и опускается несколько раз, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию, используя многоканальную пипетку для простоты и согласованности. Добавьте 100 микролитров носителя только в четыре пустые угловые лунки для коррекции фона.Оставьте планшет для культивирования клеток при комнатной температуре на один час, чтобы свести к минимуму эффект краев. Затем помещают его в инкубатор с 5%-ным углекислым газом 37 градусов по Цельсию и увлажняют. После ночной инкубации исследуйте клетки под микроскопом, чтобы проверить их морфологию и уровень пигментации перед сменой среды.В последующие дни обследования убедитесь, что клетки сливаются с характерной морфологией, похожей на булыжник, и со временем приобретают пигментацию. Чтобы обеспечить гидратацию картриджа датчика за день до анализа, заполните каждую скважину технической пластины 200 микролитрами деионизированной воды и поместите картридж датчика, погруженный в воду, на полезную пластину. Храните примерно 20 миллилитров раствора калибранта в течение ночи в увлажненной духовке при температуре 37 градусов Цельсия без углекислого газа.Включите прибор для респирометрии с высоким разрешением и запустите программное обеспечение, чтобы прибор стабилизировался при температуре 37 градусов по Цельсию в течение ночи. В день проведения анализа замените воду в служебной пластине равным объемом подогретого раствора калибранта не менее чем за 45 минут до проведения анализа. Нагрейте 25 миллилитров подготовленной среды для стресс-теста Mito без фенольного красного до 37 градусов Цельсия и вакуумный фильтр фильтрующего материала с температурой pH 7,4 с помощью фильтрующего блока с трубчатой крышкой.Удалите среду RPE человека из планшета для клеточных культур и добавьте 100 микролитров свежеприготовленной пробирной среды. Затем поместите тарелку для клеточных культур в увлажненную печь с температурой 37 градусов Цельсия без углекислого газа на один час перед началом анализа. Каждый сенсорный картридж имеет четыре порта подачи реагентов на лунку для впрыска исследуемых соединений в пластинчатые лунки для клеточных культур во время анализа.Приготовьте по три миллилитра растворов препарата Tenex каждый, разбавив запасы лекарств в соответствующих анализовых средах. Затем пипеткой вводят 20 микролитров лекарственного препарата «Техснабэкспорт» в порт А, 22 микролитра в порт Б и 25 микролитров в порт С для достижения заданной конечной концентрации лекарственного средства в каждой лунке. Затем в программном обеспечении для анализа откройте вкладку шаблонов, выберите стресс-тест Mito и заполните определения групп.Введите подробную информацию о стратегии инъекций препаратов стресс-теста Mito. Затем введите подробную информацию о различных экспериментальных группах в анализе для контроля или лечения. Ввод сведений об анализируемой среде для добавления различных добавок и их конкретных концентраций в базовую анализирующую среду.И, наконец, добавьте тип ячейки. Нажмите на следующую вкладку, а затем на карту плит, чтобы назначить различные исследуемые группы в их конкретное местоположение на 96-скважинной плите. После заполнения карты пластин щелкните вкладку протокола, чтобы просмотреть протокол прибора для протокола стресс-теста Mito по умолчанию.Затем нажмите «Запустить анализ» и вставьте картридж датчика, погруженный в раствор калибра, в полезную пластину для калибровки. Этот процесс занимает около 25 минут, и каждый биосенсор калибруется независимо на выходе датчика, измеренном в растворе калибранта с известной концентрацией pH и кислорода. По завершении калибровки снимите полезную пластину и вставьте пластину для культивирования клеток.После базового измерения прибор автоматически впрыскивает лекарственный раствор порта А в каждую лунку, которая следует за тремя циклами смешивания и измерения по три минуты каждый. Такая же картина происходит после каждой последующей инъекции препарата в другие порты. После завершения прогона извлеките пластину для культивирования клеток и картридж датчика.В целях контроля качества убедитесь, что все порты для лекарств и картридж датчика были введены, проверив порты на отсутствие остатков лекарства. Затем исследуйте клетки в микропланшете клеточной культуры под микроскопом, чтобы убедиться в сливающемся монослое клеток. Затем откажитесь от пробирной среды и замените ее 60 микролитрами одного буфера для лизиса в каждой лунке.Оберните края пластины парапленкой, чтобы предотвратить испарение, и поместите ее в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию, чтобы облегчить лизис клеток в течение ночи перед количественной оценкой содержания белка с помощью анализа BCA. Согласно анализу данных, нормализуйте все данные, разделив скорость потребления кислорода или OCR и скорость внеклеточного подкисления или значения ECAR на микрограммы белка в каждой лунке. Затем экспортируйте генератор отчетов о стресс-тестах Mito, который использует макросы Excel для автоматического расчета параметров стресс-теста Mito с помощью программного обеспечения для анализа данных.Следуя тем же шагам, которые были продемонстрированы для стресс-теста Мито, можно провести гликолитический стресс-тест, за исключением добавок для анализируемых сред и инъекций лекарств, которые отличаются, как показано в таблице один и таблица два. Прибор одновременно измеряет как OCR, так и ECAR для каждого пробега. Для стресс-теста Mito расчеты периметра основаны на показаниях OCAR, тогда как для гликолитического стресс-теста расчеты параметров основаны на показаниях ECAR.Вот кривая OCR, полученная при выполнении стресс-теста Mito на первичных клетках RPE человека. Расчеты параметров стресс-теста Mito отображаются в виде гистограмм. Точно так же это кривая ECAR, полученная в результате выполнения гликолитического стресс-теста на первичных клетках RPE человека, и расчеты показаны в виде гистограмм.Чтобы оптимизировать инъекцию препарата порта B для стресс-теста Mito, сравнивали эффективность двух разъединяющих агентов в увеличении OCR в первичных клетках RPE человека. Было обнаружено, что BAM15 превосходит FCCP в повышении дыхательной способности митохондрий, о чем свидетельствует значительно более высокое максимальное дыхание и резервная дыхательная способность с BAM15 по сравнению с FCCP. Важно не забывать увлажнять картридж датчика за день до проведения анализа.Этот метод позволяет исследователям лучше охарактеризовать биоэнергетические профили клеток RPE и понять, как клетки RPE проявляют метаболическую гибкость в ответ на различные патогенные стимулы.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Первичные человеческие бронхиальные эпителиальные клетки, выращенных из эксплантов

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

Профили микроРНК выражение человеческой плюрипотентных клеток, пигментного эпителия сетчатки, полученных из IPS, и плода пигментного эпителия сетчатки

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Высокое разрешение респирометрии для оценки митохондриальной функции в проницаемыми и неповрежденных клеток

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Субретинальное трансплантации эмбриональных стволовых клеток человека производные сетчатки пигментного эпителиальных клеток в большой eyed модель географической атрофии

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Культуры главной ячейки от мыши пигментный эпителий сетчатки

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Эффективное рассечение и культура первичной мыши сетчатки Пигмент эпителиальных клеток

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

Респирометрия высокого разрешения для оценки биоэнергетики в клетках и тканях с использованием камерных и пластинчатых респирометров

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

Использование анализатора метаболического потока клеток в реальном времени для мониторинга биоэнергетики остеобластов

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

Первичная культура пигментных эпителиальных клеток свиньи свиней

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...