Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

تلقى هذا البحث دعما من وزارة التعليم العالي الماليزية في إطار برنامج المنح البحثية طويلة الأجل (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN / F1 / 01/2018) وتمويل برنامج مركز التميز للمؤسسات العليا (HICoE) (MO002-2019). الشكل 3 في هذه الدراسة الذي يوضح سير عمل التلوين لمقايسة تشكيل البؤر مقتبس من "DAB Immunohistochemistry" بواسطة BioRender.com (2022). تم الاسترجاع من https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. انتشار الفيروس
<ol><li>إعداد الخلية<ol><li>تنمو خلايا Vero في دورق زراعة خلايا 75 سم2 يحتوي على 12 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) و 2 مللي متر L-glutamine (انظر جدول المواد). احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.<...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

هناك العديد من المقايسات لتحديد عيار الفيروس. لدى PFA بروتوكول كمي مشابه للفيروس مثل FFA ، حيث يتم تخفيف لقاح الفيروس للسماح بتمييز اللويحات أو البؤر الفردية. بعد تلطيخ ، تشير كل لوحة أو بؤر إلى جسيم معدي واحد في اللقاح19. PFA ملطخ باللون البنفسجي البلوري لتصور تكوين البلاك الناجم ع...

عدوى فيروس زيكا (ZIKV) هي مرض فيروسي ناشئ ينقله البعوض. كانت أول عزلة ل ZIKV في أوغندا في عام 1947 1,2 ؛ ظل مهملا من عام 1947 إلى عام 2007 ، حيث أن الأعراض السريرية هي الأكثر شيوعا بدون أعراض وتتميز بمرض حموي ذاتي الحد. في عام 2007 ، بدأ وباء زيكا في جزر ياب 3,4 ، تلاه أوبئة أكبر في مناطق المحيط الهادئ (بولينيزيا الفرنسية وجزيرة إيستر وجزر كوك وكاليدونيا الجديدة) من 2013 إلى 2014 5،6،7،8 ، حيث تم الإبلاغ عن المضاعفات العصبية الشديدة متلازمة غيلان باريه (GBS) في البالغين لأول مرة9. خلال عامي 2015 و 2016 ، اجتاح أول وباء ZIKV واسع الانتشار الأمريكتين بعد ظهور النمط الجيني الآسيوي ل ZIKV في البرازيل في وقت مبكر من عام 201310. خلال هذه الفاشية ، تم الإبلاغ عن 440,000 إلى 1.3 مليون حالة من صغر الرأس ، واضطرابات عصبية أخرى ، في الأطفال حديثي الولادة11. لا يوجد حاليا علاج أو علاج محدد لعدوى فيروس زيكا. وبالتالي، هناك حاجة طبية ملحة للقاحات فيروس زيكا القادرة على الوقاية من العدوى، لا سيما أثناء الحمل.
القياس الكمي للفيروس هو عملية لتحديد عدد الفيروسات الموجودة في العينة. يلعب دورا مهما في البحث ، وتشمل المختبرات الأكاديمية العديد من المجالات ، مثل الطب وعلوم الحياة. هذه العملية مهمة أيضا في القطاعات التجارية ، مثل إنتاج اللقاحات الفيروسية أو البروتينات المؤتلفة أو المستضدات الفيروسية أو العوامل المضادة للفيروسات. يمكن استخدام العديد من الطرق أو المقايسات لقياس كمية الفيروس12. يعتمد اختيار الطرق أو المقايسات عادة على خصائص الفيروس ومستوى الدقة المطلوب وطبيعة التجربة أو البحث. بشكل عام ، يمكن تقسيم طرق قياس الفيروسات إلى فئتين: المقايسات الجزيئية التي تكشف عن وجود الحمض النووي الفيروسي (DNA أو RNA) والمقايسات التي تقيس عدوى الفيروس في المختبر12. يعد تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR ، للحمض النووي) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR ، للحمض النووي الريبي)13 والقطيرات الرقمية PCR14 أمثلة على التقنيات الجزيئية الشائعة المستخدمة لتحديد كمية الحمض النووي الفيروسي في عينة معينة15. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه التقنيات الجزيئية شديدة الحساسية التمييز بين الفيروسات القابلة للحياة وغير القابلة للحياة15. لذلك ، لا يمكن إكمال البحث الذي يتطلب معلومات عن السمات البيولوجية ، مثل عدوى الفيروس على الخلايا ، باستخدام التقنيات الجزيئية المذكورة أعلاه ؛ هناك حاجة إلى فحوصات يمكنها قياس وتحديد وجود فيروسات قابلة للحياة. تشمل المقايسات التي تقيس عدوى الفيروس مقايسة تكوين البلاك (PFA) ، والجرعة المعدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50٪ (TCID50) ، ومقايسة تركيز الفلورسنت ، والمجهر الإلكتروني الانتقالي (TEM) 12.
يعد PFA ، الذي طوره Renato Dulbecco في عام 1952 ، أحد أكثر الطرق شيوعا لمعايرة الفيروس ، بما في ذلك ZIKV16. يتم استخدامه لتحديد التركيزات الفيروسية مباشرة للفيروسات المعزولة المعدية. تعتمد الطريقة على قدرة الفيروس المحلل على إنتاج تأثيرات اعتلال خلوي (CPEs ؛ مناطق موت الخلايا أو اللويحات ، وهي منطقة عدوى محاطة بخلايا غير مصابة) في طبقة أحادية الخلية الملقحة بعد العدوى الفيروسية. ومع ذلك ، هناك العديد من العيوب للفحص التي تؤثر على فائدتها. تستغرق عملية الفحص وقتا طويلا (تستغرق حوالي 7-10 أيام ، اعتمادا على الفيروسات) ، وتعتمد على CPE ، وعرضة للأخطاء. في هذه الدراسة ، أبلغنا عن تقنية قياس الألوان المناعية ، مقايسة تشكيل التركيز (FFA) ، للكشف عن ZIKV وقياسه في تنسيقات صفيحة 24 بئرا و 96 بئرا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

فيروس زيكا (ZIKV) هو فيروس ينقله البعوض ينتمي إلى جنس Flavivirus. ارتبطت عدوى فيروس زيكا بتشوهات خلقية في الدماغ وربما متلازمة غيلان باريه لدى البالغين. ومن المهم إجراء البحوث المتعلقة بفيروس زيكا لفهم آليات المرض لتيسير تطوير اللقاح والعلاج. طريقة قياس كمية الفيروسات حاسمة وأساسية في مجال علم الفيروسات. مقايسة تشكيل التركيز (FFA) هي مقايسة كمية للفيروس تكتشف المستضد الفيروسي بالأجسام المضادة وتحدد بؤر العدوى للخلايا باستخدام تقنية التلوين المناعي للبيروكسيداز. تصف الدراسة الحالية بروتوكول انتشار الفيروس والقياس الكمي باستخدام كل من تنسيقات 24 بئرا و 96 بئرا (إنتاجية عالية). بالمقارنة مع دراسات أخرى مماثلة ، وصف هذا البروتوكول كذلك تحسين حجم البؤر ، والذي يمكن أن يكون بمثابة دليل لتوسيع استخدام هذا الفحص للفيروسات الأخرى. أولا ، يتم إجراء انتشار ZIKV في خلايا Vero لمدة 3 أيام. يتم حصاد طافية الاستزراع التي تحتوي على ZIKV وقياسها باستخدام FFA. باختصار ، يتم تلقيح ثقافة الفيروس على خلايا Vero وتحضينها لمدة 2-3 أيام. ثم يتم تحديد تكوين البؤر بعد عمليات تلطيخ محسنة ، بما في ذلك تثبيت الخلايا ، والنفاذية ، والحجب ، وربط الأجسام المضادة ، والحضانة مع ركيزة البيروكسيديز. يتم تصور بؤر الفيروس الملطخة باستخدام مجهر ستيريو (العد اليدوي بتنسيق 24 بئرا) أو محلل البرامج (العد الآلي بتنسيق 96 بئرا). يوفر FFA نتائج قابلة للتكرار وسريعة نسبيا (3-4 أيام) وهو مناسب للاستخدام مع فيروسات مختلفة ، بما في ذلك الفيروسات غير المكونة للبلاك. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول مفيد لدراسة عدوى ZIKV ويمكن استخدامه للكشف عن الفيروسات الأخرى المهمة سريريا.

يمكن قياس ZIKV كميا باستخدام FFA ، كما هو موضح بشكل تخطيطي في الشكل 3. بالنسبة للوحة 24 بئرا ، تم تثبيت خلايا Vero المصابة عند 48 ساعة و 60 ساعة و 72 ساعة و 84 ساعة و 96 ساعة بعد الإصابة. أظهرت النتائج أن الخلايا بقيت سليمة (لم يلاحظ أي انفصال خلوي) بعد 96 ساعة (4 أيام) بعد الإصابة (?...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

يصف هذا البروتوكول انتشار فيروس زيكا (ZIKV) في خلايا الكلى القردة الخضراء فيرو الأفريقية والقياس الكمي لفيروس زيكا باستخدام طرق الكشف المناعي اللوني القائمة على الخلايا في شكل 24 بئرا و 96 بئرا (إنتاجية عالية).

انتشار الفيروس والقياس اللوني القائم على الخلايا

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

يتيح هذا البروتوكول تحديد فيروس زيكا وقياسه كميا دون الاعتماد على تأثير الاعتلال الخلوي. ذلك يعتمد على التعرف على الأجسام المضادة لمكون الفيروس. يمكن أن يساعد استخدام الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس في تحديد الأنماط المصلية المختلفة للفيروس في المجموعات السكانية المختلطة.هذه الطريقة لها مزايا على المقايسات الكلاسيكية لتشكيل البلاك. إنه أسرع وممكن للتطبيقات عالية الإنتاجية عند التقديم باستخدام نظام تصوير آلي لعد الخلايا بسرعة. البروتوكول المقترح قابل للتكيف بدرجة كبيرة.مع التعديلات المناسبة ، يمكن تطبيق البروتوكول المقترح على أنواع مختلفة من الخلايا والأهداف الفيروسية. ابدأ بزراعة خلايا Vero في دورق زراعة خلايا 75 مربعا = سنتيمترا يحتوي على 12 ملليلترا من DMEM مكملا ب 10٪ FBS واثنين مليمول من L-glutamine. ضع القارورة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.لإصابة الطبقة الأحادية للخلية ، استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لإزالة وسط النمو من قارورة زراعة الخلية. باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر ، اشطف القارورة بثلاثة ملليلتر من DPBS مرتين. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من DMEM الخالي من المصل و 20 ميكرولترا من لقاح فيروس زيكا في قارورة زراعة الخلايا.دع القارورة تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع هزاز لطيف لتشجيع امتصاص الفيروس. في نهاية الحضانة ، باستخدام ماصة مصلية من خمسة ملليلتر ، قم بإزالة لقاح الفيروس المخفف وتجاهله بعناية من قارورة ثقافة الخلية. شطف قارورة ثقافة الخلية مرتين مع ثلاثة ملليلتر من DPBS.ثم أضف 12 ملليلترا من وسائط الصيانة إلى دورق زراعة الخلايا للحفاظ على الخلايا المصابة. احتضان خلايا فيرو المصابة لمدة ثلاثة أيام في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ثلاثة أيام من الحضانة ، استخدم ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لحصاد طاف زراعة الخلايا الذي يحتوي على فيروس زيكا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر.لتحديد كمية الفيروس ، قم بزرع خلايا Vero في لوحات مخصصة والسماح لها بالنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. قم بإعداد ستة أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 1.5 ملليلتر لكل لوحة لإجراء تخفيف تسلسلي بعشرة أضعاف ، بما في ذلك أنبوب إضافي للتحكم السلبي. لإعداد لوحة 24 بئرا ، أضف 450 ميكرولترا من DMEM الخالي من المصل إلى جميع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الستة.لإعداد لوحة 96 بئرا ، قم بتوزيع 135 ميكرولترا من DMEM الخالي من المصل على ستة أنابيب إضافية. لإجراء التخفيف التسلسلي لتجربة لوحة 24 بئرا ، أضف 50 ميكرولترا من مخزون فيروس زيكا إلى أنبوب واحد 10 إلى ناقص يحتوي على 450 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. بالنسبة لتجربة الصفيحة المكونة من 96 بئرا ، أضف 15 ميكرولترا من مخزون فيروس زيكا إلى أنبوب واحد من 10 إلى ناقص يحتوي على 135 ميكرولترا من DMEM الخالي من المصل.دوامة كل أنبوب لخلط الفيروس والوسط تماما ، مما يضمن توزيعا متساويا لجزيئات الفيروس داخل التخفيف. باستخدام طرف ماصة جديد ، أعد تعليق الأنبوب من 10 إلى ناقص واحد وانقل 50 و 15 ميكرولترا من فيروس زيكا المخفف إلى الأنبوب من 10 إلى ناقص اثنين كتخفيف ثان بعشرة أضعاف للألواح المكونة من 24 و 96 بئرا ، على التوالي. قم بإزالة وتجاهل وسط الحالة لكل بئر من اللوحة المناسبة.شطف كل بئر مع DPBS مرتين لإزالة أي بقايا. بدءا من أعلى تخفيف ، أضف لقاح الفيروس المخفف بشكل متسلسل إلى الآبار ، مع العمل على أقل تخفيف. بعد ساعة واحدة من الحضانة ، قم بإزالة معلق الفيروس والتخلص منه من الآبار ، بدءا من أدنى تركيز إلى أعلى.اغسل الخلايا المصابة باستخدام DPBS مرتين لإزالة أي آثار لتعليق الفيروس. تراكب البئر مع DMEM و 1.5٪ كربوكسي ميثيل سلولوز منخفض اللزوجة. احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد الحضانة ، قم بإزالة وتجاهل وسط التراكب وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. بالنسبة للوحة 96 بئرا ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة وسط التراكب والتخلص منه ، وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 60 ميكرولترا من PBS لكل بئر. أضف 4٪ بارافورمالدهيد لإصلاح الخلايا واحتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.بعد 20 دقيقة ، تخلص من بارافورمالدهايد واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، أضف 3 ، 3'ديامينوبنزيدين بيروكسيديز الركيزة واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد 30 دقيقة ، أوقف التفاعل عن طريق غسل الآبار بالماء.جفف الألواح في الهواء طوال الليل وانتقل إلى تعداد البؤر. احسب البؤر لكل نسخة مكررة من التخفيف المحدد واحسب متوسط عدد البؤر لكل منها. تم إصلاح خلايا فيرو المصابة في نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة.بالنسبة للوحة 2-well ، لوحظ أول ظهور لبؤر الفيروس بعد 48 ساعة من الإصابة ، على الرغم من أن حجم البؤر كان صغيرا جدا بحيث لا يمكن حسابه بدقة. بعد 96 ساعة بعد الإصابة ، لم تكن هناك علامات على انفصال الخلايا. في 60 ساعة بعد الإصابة ، زاد حجم البؤر إلى المستوى الأمثل للعد.بعد ذلك ، مع تقدم الوقت ، أصبحت البؤر أكبر وبدأت في الاندماج أو التداخل مع بعضها البعض في شدتها ، وتشكيل مجموعات نمت بمرور الوقت. لذلك ، تشكلت البؤر بعد 60 ساعة من اختيار العدوى لتحديد عيار فيروس زيكا في لوحة 24 بئرا. بالنسبة للوحة 96 بئرا ، ظلت الخلايا سليمة بعد 72 ساعة بعد الإصابة.لوحظ ظهور بؤر الفيروس لأول مرة بعد 24 ساعة من الإصابة. ومع ذلك ، حتى 36 ساعة بعد الإصابة ، كان حجم البؤر صغيرا جدا. تم تحقيق الحجم الأمثل للبؤر في 48 ساعة بعد الإصابة.في النقاط الزمنية الأخيرة ، لوحظت بؤر متداخلة أو مدمجة ، وزاد عدد البؤر المتداخلة بمرور الوقت. تشكلت البؤر بعد 48 ساعة من اختيار العدوى لتحديد عيار الفيروس من عزلات فيروس زيكا. أضف DPBS برفق أسفل جانب كل بئر وقم بهز الألواح للخلف وللأمام مرة إلى ثلاث مرات لإزالة الحطام الخلوي والوسائط الزائدة.ستفيد هذه التقنية الباحثين بشكل كبير في أبحاث زيكا ، ويمكن أيضا تكييفها على نطاق واسع لتحديد كمية الفيروسات الأخرى المهمة سريريا ، مما يجعلها أداة قيمة لمراقبة الفيروسات وتشخيصها.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX الكشف اللونية على ميكروأري الحمض النووي لمكافحة الأنفلونزا

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

نشر<em&gt; Homalodisca coagulata فيروس-01</em&gt; عبر<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; الثقافة خلية

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

نشر فيروس الانفلونزا في أجنة بيض الدجاج

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

عزل وتحليل العدلة لتحديد ما دورها في الغدد اللمفاوية حساسية الخلية وكلاء العلاجية

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

التحديد الكمي لتعزيز تعتمد على جسم مضاد الفيروس Zika في خلايا الإنسان الأولية

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

عزل وتقدير كمية لفيروس زيكا من أجهزة متعددة في الماوس

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

في اختبار فيترو ELISA لتقييم قوة لقاح داء الكلب

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...