Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Dit onderzoek kreeg steun van het Ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië in het kader van de Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) en financiering voor het Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) programma (MO002-2019). Figuur 3 in deze studie die de workflow van kleuring voor de foci-vormende test laat zien, is aangepast van "DAB Immunohistochemistry" door BioRender.com (2022). Opgehaald van https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. Verspreiding van virussen
<ol><li>Cel voorbereiding<ol><li>Kweek Vero-cellen in een 75 cm2-cellige kweekkolf met 12 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 2 mM L-glutamine (zie materiaaltabel). Incubeer de cellen in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2.</li>
		<li>Bewaak de cellen onder een microscoop; zodra de cellen 70%-90% confluentie hebben bereikt, zijn ze klaar voor gebruik (<strong class="...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

Er zijn verschillende tests om de virustiter te bepalen; de PFA heeft een vergelijkbaar protocol voor het kwantificeren van virussen als de FFA, waarbij het virusinoculum wordt verdund om individuele plaques of foci te kunnen onderscheiden. Na kleuring duidt elke plaque of foci op een enkel infectieus deeltje in het entmateriaal19. De PFA is gekleurd met kristalviolet om plaquevorming veroorzaakt door cellyse of dood te visualiseren. Daarom is de PFA tijdrovender, omdat het virus meer tijd nodig h...

Zika-virus (ZIKV)-infectie is een opkomende door muggen overgedragen virale ziekte. De eerste isolatie van ZIKV was in Oeganda in 1947 1,2; Het bleef verwaarloosd van 1947 tot 2007, omdat de klinische symptomen meestal asymptomatisch zijn en worden gekenmerkt door zelfbeperkende koortsziekte. In 2007 begon de Zika-epidemie op de Yap-eilanden 3,4, gevolgd door grotere epidemieën in de Stille Oceaan (Frans-Polynesië, Paaseiland, Cookeilanden en Nieuw-Caledonië) van 2013 tot 2014 5,6,7,8, waar de ernstige neurologische complicatie Guillain-Barré-syndroom (GBS) voor het eerst bij volwassenen werd gemeld 9. In 2015 en 2016 raasde de eerste wijdverspreide ZIKV-epidemie over Noord- en Zuid-Amerika na de opkomst van het Aziatische genotype van ZIKV in Brazilië al in 201310. Tijdens deze uitbraak werden 440.000 tot 1,3 miljoen gevallen van microcefalie en andere neurologische aandoeningen gemeld bij pasgeboren baby's. Er is momenteel geen specifieke remedie of behandeling voor ZIKV-infectie; daarom is er een dringende medische behoefte aan ZIKV-vaccins die infecties kunnen voorkomen, vooral tijdens de zwangerschap.
Viruskwantificering is een proces om het aantal virussen in een monster te bepalen. Het speelt een belangrijke rol in onderzoek en academische laboratoria betrekken veel gebieden, zoals geneeskunde en levenswetenschappen. Dit proces is ook belangrijk in commerciële sectoren, zoals de productie van virale vaccins, recombinante eiwitten, virale antigenen of antivirale middelen. Er kunnen veel methoden of tests worden gebruikt voor de kwantificering van virussen12. De keuze van methoden of tests hangt normaal gesproken af van de viruskenmerken, het gewenste nauwkeurigheidsniveau en de aard van het experiment of onderzoek. Over het algemeen kunnen methoden voor het kwantificeren van virussen worden onderverdeeld in twee categorieën: moleculaire tests die de aanwezigheid van viraal nucleïnezuur (DNA of RNA) detecteren en tests die de besmettelijkheid van virussen in vitro meten 12. Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR, voor DNA) of kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (qRT-PCR, voor RNA)13 en digitale druppel PCR14 zijn voorbeelden van veelgebruikte moleculaire technieken die worden gebruikt om het virale nucleïnezuur in een bepaald monster te kwantificeren15. Deze zeer gevoelige moleculaire technieken kunnen echter geen onderscheid maken tussen levensvatbare en niet-levensvatbarevirussen15. Daarom kan onderzoek waarvoor informatie nodig is over biologische kenmerken, zoals de besmettelijkheid van virussen op cellen, niet worden voltooid met behulp van de bovengenoemde moleculaire technieken; Er zijn tests nodig die de aanwezigheid van levensvatbare virussen kunnen meten en bepalen. Tests die de besmettelijkheid van virussen meten, zijn onder meer de plaquevormende test (PFA), 50% infectieuze dosis weefselkweek (TCID50), de fluorescerende focustest en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)12.
De PFA, ontwikkeld door Renato Dulbecco in 1952, is een van de meest gebruikte methoden voor virustitratie, ook voor ZIKV16. Het wordt gebruikt om de virale concentraties voor infectieuze lytische virionen direct te bepalen. De methode is gebaseerd op het vermogen van een lytisch virus om cytopathische effecten (CPE's; zones van celdood of plaques, een infectiegebied omgeven door niet-geïnfecteerde cellen) te produceren in een geïnoculeerde celmonolaag na virale infectie. Er zijn echter verschillende nadelen aan de test die van invloed zijn op het nut ervan. De test is tijdrovend (duurt ongeveer 7-10 dagen, afhankelijk van virussen), CPE-afhankelijk en foutgevoelig. In de huidige studie rapporteren we een immunocolorimetrische techniek, de focus forming assay (FFA), voor het detecteren en kwantificeren van ZIKV in plaatformaten met 24 putjes en platen met 96 putjes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

Zikavirus (ZIKV) is een door muggen overgedragen virus dat behoort tot het geslacht Flavivirus. ZIKV-infectie is in verband gebracht met aangeboren hersenafwijkingen en mogelijk syndroom van Guillain-Barré bij volwassenen. Onderzoek naar ZIKV om de ziektemechanismen te begrijpen is belangrijk om de ontwikkeling van vaccins en behandelingen te vergemakkelijken. De methode om virussen te kwantificeren is cruciaal en fundamenteel op het gebied van virologie. De focusvormende test (FFA) is een viruskwantificeringstest die het virale antigeen met antilichamen detecteert en de infectiehaarden van cellen identificeert met behulp van de peroxidase-immunokleuringstechniek. De huidige studie beschrijft het protocol voor virusvoortplanting en -kwantificering met behulp van zowel 24-wells als 96-wells (high throughput) formaten. In vergelijking met andere vergelijkbare onderzoeken heeft dit protocol de optimalisatie van de foci-grootte verder beschreven, wat als leidraad kan dienen om het gebruik van deze test voor andere virussen uit te breiden. Eerst wordt de ZIKV-vermeerdering gedurende 3 dagen uitgevoerd in Vero-cellen. Het kweeksupernatans dat ZIKV bevat, wordt geoogst en gekwantificeerd met behulp van de FFA. In het kort wordt de viruskweek geïnoculeerd op Vero-cellen en gedurende 2-3 dagen geïncubeerd. De vorming van foci wordt vervolgens bepaald na geoptimaliseerde kleuringsprocessen, waaronder celfixatie, permeabilisatie, blokkering, antilichaambinding en incubatie met peroxidasesubstraat. De gekleurde virushaarden worden gevisualiseerd met behulp van een stereomicroscoop (handmatig tellen in 24-wells-formaat) of software-analysator (geautomatiseerd tellen in 96-wells-formaat). De FFA geeft reproduceerbare, relatief snelle resultaten (3-4 dagen) en is geschikt om te worden gebruikt voor verschillende virussen, waaronder niet-plaquevormende virussen. Vervolgens is dit protocol nuttig voor de studie van ZIKV-infectie en kan het worden gebruikt om andere klinisch belangrijke virussen te detecteren.

ZIKV kan worden gekwantificeerd met behulp van de FFA, zoals schematisch weergegeven in figuur 3. Voor de plaat met 24 putjes werden de geïnfecteerde Vero-cellen 48 uur, 60 uur, 72 uur, 84 uur en 96 uur na infectie gefixeerd. De resultaten toonden aan dat de cellen intact bleven (er werd geen celloslating waargenomen) na 96 uur (4 dagen) na infectie (Figuur 4 en aanvullende Figuur 8A-E). Het verschijnen van virushaarden werd voor het eerst waar...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Het huidige protocol beschrijft de verspreiding van het Zika-virus (ZIKV) in niercellen van Vero Afrikaanse groene apen en de kwantificering van ZIKV met behulp van celgebaseerde colorimetrische immunodetectiemethoden in formaten met 24 wells en 96 wells (hoge doorvoer).

Virusvoortplanting en celgebaseerde colorimetrische kwantificering

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Dit protocol maakt het mogelijk om het Zika-virus te identificeren en te kwantificeren zonder afhankelijk te zijn van cytopathisch effect. Het hangt af van de antilichaamherkenning van de viruscomponent. Het gebruik van virusspecifieke antilichamen kan helpen bij het identificeren van verschillende virusserotypen in gemengde populaties.Deze methode heeft voordelen ten opzichte van klassieke plaquevormende assays. Het is sneller en geschikt voor toepassingen met een hoge doorvoer wanneer het wordt toegepast met een geautomatiseerd beeldvormingssysteem voor het snel tellen van cellen. Het voorgestelde protocol is in hoge mate aanpasbaar.Met de nodige aanpassingen kan het voorgestelde protocol worden toegepast op verschillende celtypen en virale doelen. Begin met het kweken van Vero-cellen in een celkweekkolf van 75 vierkante = centimeter die 12 milliliter DMEM bevat, aangevuld met 10% FBS en twee millimol L-glutamine. Plaats de kolf in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Om de celmonolaag te infecteren, gebruikt u een serologische pipet van 10 milliliter om het groeimedium uit de celkweekkolf te verwijderen. Spoel de kolf met een serologische pipet van vijf milliliter tweemaal met drie milliliter DPBS. Voeg vervolgens twee milliliter serumvrije DMEM en 20 microliter Zika-virusinoculum toe aan de celkweekkolf.Laat de kolf een uur bij kamertemperatuur incuberen en zachtjes schommelen om de virusadsorptie te bevorderen. Verwijder aan het einde van de incubatie met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter voorzichtig het verdunde virusinoculum uit de celkweekkolf en gooi het weg. Spoel de celkweekkolf twee keer met drie milliliter DPBS.Voeg vervolgens 12 milliliter onderhoudsmedia toe aan de celkweekkolf om de geïnfecteerde cellen te behouden. Incubeer de geïnfecteerde Vero-cellen gedurende drie dagen in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Gebruik na drie dagen incubatie een serologische pipet van 10 milliliter om het supernatans van de celkweek met het Zika-virus in een centrifugebuis van 50 milliliter te oogsten.Voor de kwantificering van het virus zaait u Vero-cellen in daarvoor bestemde platen en laat u ze 's nachts groeien bij 37 graden Celsius met een atmosfeer van 5% koolstofdioxide. Bereid voor elke plaat zes steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor om een tienvoudige seriële verdunning uit te voeren, inclusief een extra buisje voor een negatieve controle. Voor een plaatopstelling met 24 putjes voegt u 450 microliter serumvrije DMEM toe aan alle zes microcentrifugebuisjes.Voor een plaatopstelling met 96 putjes doseert u 135 microliter serumvrije DMEM in zes extra buisjes. Om seriële verdunning uit te voeren voor het plaatexperiment met 24 putjes, voegt u 50 microliter van de Zika-virusvoorraad toe aan de buis van 10 tot min één met 450 microliter serumvrije DMEM. Voeg voor het plaatexperiment met 96 putjes 15 microliter Zika-virusvoorraad toe aan de 10 tot min één buis met 135 microliter serumvrije DMEM.Draai elke buis om het virus en het medium grondig te mengen, zodat de virusdeeltjes gelijkmatig over de verdunning worden verdeeld. Gebruik een verse pipetpunt om de buis van 10 tot min één te resuspenderen en breng 50 en 15 microliter verdund Zika-virus over in het buisje van 10 tot min twee als een tweede tienvoudige verdunning voor respectievelijk de platen met 24 en 96 putjes. Verwijder het conditiemedium voor elk putje van de juiste plaat en gooi het weg.Spoel elk putje twee keer met DPBS om eventuele resten te verwijderen. Begin met de hoogste verdunning en voeg het serieel verdunde virusinoculum toe aan de putjes, werkend naar de laagste verdunning. Verwijder na een uur incubatie de virussuspensie uit de putjes en gooi deze weg, te beginnen met de laagste naar de hoogste concentratie.Was de geïnfecteerde cellen twee keer met DPBS om eventuele sporen van virussuspensie te verwijderen. Bedek het putje met DMEM en 1,5% carboxymethylcellulose met een lage viscositeit. Incubeer de plaat in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Verwijder na incubatie het overlaymedium en gooi het weg en was de cellen drie keer met PBS. Gebruik voor de plaat met 96 putjes een meerkanaalspipet om het overlaymedium te verwijderen en weg te gooien, en was de cellen drie keer met 60 microliter PBS per putje. Voeg 4% paraformaldehyde toe om de cellen te fixeren en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.Gooi na 20 minuten de paraformaldehyde weg en was de cellen driemaal met PBS. Voeg vervolgens 3, 3'diaminobenzidineperoxidasesubstraat toe en incubeer de plaat gedurende 30 minuten in het donker. Stop na 30 minuten de reactie door de putten met water te wassen.Laat de platen een nacht aan de lucht drogen en ga verder met het opsommen van de brandpunten. Tel de brandpunten voor elke replicatie van de geselecteerde verdunning en bereken het gemiddelde aantal brandpunten voor elk. De geïnfecteerde Vero-cellen werden op verschillende tijdstippen na infectie gefixeerd.Voor de plaat met 2 putjes werd de eerste verschijning van virushaarden 48 uur na infectie waargenomen, hoewel de grootte van de brandpunten te klein was om nauwkeurig te tellen. Na 96 uur na infectie waren er geen tekenen van celloslating. 60 uur na infectie was de grootte van de brandpunten toegenomen tot een optimaal niveau om te tellen.Vervolgens, naarmate de tijd vorderde, werden de brandpunten groter en begonnen ze in intensiteit met elkaar samen te smelten of elkaar te overlappen, waardoor clusters werden gevormd die in de loop van de tijd groeiden. Daarom werden 60 uur na de infectie foci gevormd om de Zika-virustiter in een plaat met 24 putjes te bepalen. Voor de plaat met 96 putjes bleven de cellen 72 uur na infectie intact.Het verschijnen van virushaarden werd voor het eerst waargenomen 24 uur na infectie. Tot 36 uur na infectie was de grootte van de brandpunten echter te klein. De optimale foci-grootte werd 48 uur na infectie bereikt.Op de laatste tijdstippen werden overlappende of samengevoegde brandpunten waargenomen en nam het aantal overlappende brandpunten in de loop van de tijd toe. De foci vormden zich 48 uur nadat de infectie was gekozen om de virustiter van Zika-virusisolaten te bepalen. Voeg voorzichtig DPBS toe langs de zijkant van elk putje en schud de platen één tot drie keer heen en weer om celresten en overtollige media te verwijderen.Deze techniek zal onderzoekers in Zika-onderzoek enorm ten goede komen en kan ook breed worden aangepast om andere klinisch belangrijke virussen te kwantificeren, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor virusbewaking en -diagnose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX Colorimetrische Detectie op een DNA Microarray voor Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Voortplanting van<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snelle, veilige en eenvoudige handleiding bed nucleïnezuur extractie voor de opsporing van Virus in monsters van volbloed

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identificatie van de codering en niet-coderende RNA klassen uitgedrukt in varkens volbloed

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kwantificering van antilichaam-afhankelijke versterking van het Zika-Virus in primaire menselijke cellen

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA-test om de potentie van rabiësvaccin te evalueren

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...