Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
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Cette recherche a reçu le soutien du ministère de l’Enseignement supérieur de Malaisie dans le cadre du programme de subventions de recherche à long terme (LRGS MRUN Phase 1 : LRGS MRUN/F1/01/2018) et un financement du programme Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). La figure 3 de cette étude qui montre le flux de travail de coloration pour le test de formation des foyers est adaptée de « DAB Immunohistochemistry » par BioRender.com (2022). Récupéré de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. Propagation du virus
<ol><li>Préparation des cellules<ol><li>Cultiver des cellules Vero dans un flacon de culture de2 cellules de 75 cm contenant 12 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 2 mM de L-glutamine (voir le tableau des matériaux). Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.</li>
		<li>Surveiller les cellules au microscope ; une fois que les c...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

Il existe plusieurs tests pour déterminer le titre du virus ; le PFA a un protocole de quantification du virus similaire à celui du FFA, dans lequel l’inoculum du virus est dilué pour permettre de distinguer les plaques ou les foyers individuels. Après coloration, chaque plaque ou foyer indique une seule particule infectieuse dans l’inoculum19. Le PFA est coloré avec du violet cristallin pour visualiser la formation de plaque causée par la lyse cellulaire ou la mort. Par conséquent, le...

L’infection par le virus Zika (ZIKV) est une maladie virale émergente transmise par les moustiques. Le premier isolement du virus Zika a eu lieu en Ouganda en 1947 1,2 ; Elle est restée négligée de 1947 à 2007, car les symptômes cliniques sont le plus souvent asymptomatiques et caractérisés par une maladie fébrile spontanément résolutive. En 2007, l’épidémie de Zika a commencé dans les îles Yap 3,4, suivie d’épidémies plus importantes dans les régions du Pacifique (Polynésie française, île de Pâques, îles Cook et Nouvelle-Calédonie) de 2013 à 2014 5,6,7,8, où la complication neurologique sévère du syndrome de Guillain-Barré (SGB) a été signalée chez l’adulte pour la première fois 9. En 2015 et 2016, la première épidémie généralisée de virus Zika a balayé les Amériques après l’émergence du génotype asiatique du virus Zika au Brésil dès 201310. Au cours de cette épidémie, 440 000 à 1,3 million de cas de microcéphalie et d’autres troubles neurologiques ont été signalés chez les nouveau-nés11. À l’heure actuelle, il n’existe pas de remède ou de traitement spécifique pour l’infection par le virus Zika ; Il existe donc un besoin médical urgent de vaccins contre le virus Zika capables de prévenir les infections, en particulier pendant la grossesse.
La quantification virale est un processus permettant de déterminer le nombre de virus présents dans un échantillon. Il joue un rôle important dans la recherche, et les laboratoires académiques impliquent de nombreux domaines, tels que la médecine et les sciences de la vie. Ce processus est également important dans les secteurs commerciaux, tels que la production de vaccins viraux, de protéines recombinantes, d’antigènes viraux ou d’agents antiviraux. De nombreuses méthodes ou tests peuvent être utilisés pour la quantification du virus12. Le choix des méthodes ou des essais dépend normalement des caractéristiques du virus, du niveau de précision souhaité et de la nature de l’expérience ou de la recherche. En général, les méthodes de quantification des virus peuvent être divisées en deux catégories : les tests moléculaires qui détectent la présence d’acide nucléique viral (ADN ou ARN) et les tests qui mesurent l’infectivité virale in vitro12. La réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR, pour l’ADN) ou la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR, pour l’ARN)13 et la PCR par gouttelettes numériques14 sont des exemples de techniques moléculaires couramment utilisées pour quantifier l’acide nucléique viral dans un échantillon donné15. Cependant, ces techniques moléculaires très sensibles ne permettent pas de faire la différence entre les virus viables et non viables15. Par conséquent, les recherches qui nécessitent des informations sur les caractéristiques biologiques, telles que l’infectivité du virus sur les cellules, ne peuvent pas être menées à bien à l’aide des techniques moléculaires susmentionnées ; Des tests permettant de mesurer et de déterminer la présence de virus viables sont nécessaires. Les tests qui mesurent l’infectivité du virus comprennent le test de formation de plaque (PFA), la dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID50), le test de focalisation fluorescente et la microscopie électronique à transmission (MET)12.
Le PFA, mis au point par Renato Dulbecco en 1952, est l’une des méthodes les plus couramment utilisées pour le titrage du virus, y compris pour le virus Zika16. Il est utilisé pour déterminer directement les concentrations virales des virions lytiques infectieux. La méthode est basée sur la capacité d’un virus lytique à produire des effets cytopathiques (CPEs, zones de mort cellulaire ou plaques, zone d’infection entourée de cellules non infectées) dans une monocouche cellulaire inoculée après une infection virale. Cependant, le test présente plusieurs inconvénients qui affectent son utilité. Le test prend du temps (environ 7 à 10 jours, selon les virus), dépend du CPE et est sujet aux erreurs. Dans la présente étude, nous rapportons une technique immunocolorimétrique, le test de formation de foyer (FFA), pour la détection et la quantification du virus Zika dans des formats de plaques à 24 puits et de plaques à 96 puits.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

Le virus Zika (ZIKV) est un virus transmis par les moustiques appartenant au genre Flavivirus. L’infection par le virus Zika a été associée à des anomalies cérébrales congénitales et potentiellement au syndrome de Guillain-Barré chez l’adulte. La recherche sur le virus Zika pour comprendre les mécanismes de la maladie est importante pour faciliter la mise au point d’un vaccin et d’un traitement. La méthode de quantification des virus est cruciale et fondamentale dans le domaine de la virologie. Le test de formation de foyer (FFA) est un test de quantification virale qui détecte l’antigène viral avec des anticorps et identifie les foyers d’infection des cellules à l’aide de la technique d’immunomarquage de la peroxydase. La présente étude décrit le protocole de propagation et de quantification du virus à l’aide de formats à 24 puits et à 96 puits (haut débit). Comparé à d’autres études similaires, ce protocole a décrit plus en détail l’optimisation de la taille des foyers, ce qui peut servir de guide pour étendre l’utilisation de ce test à d’autres virus. Tout d’abord, la propagation du ZIKV est effectuée dans les cellules Vero pendant 3 jours. Le surnageant de culture contenant le virus Zika est récolté et quantifié à l’aide de l’AGL. Brièvement, la culture virale est inoculée sur les cellules Vero et incubée pendant 2 à 3 jours. La formation des foyers est ensuite déterminée après des processus de coloration optimisés, y compris la fixation cellulaire, la perméabilisation, le blocage, la liaison aux anticorps et l’incubation avec un substrat de peroxydase. Les foyers de virus colorés sont visualisés à l’aide d’un stéréomicroscope (comptage manuel au format 24 puits) ou d’un analyseur logiciel (comptage automatisé au format 96 puits). Le FFA fournit des résultats reproductibles et relativement rapides (3-4 jours) et peut être utilisé pour différents virus, y compris les virus non plaques. Par la suite, ce protocole est utile pour l’étude de l’infection par le virus Zika et pourrait être utilisé pour détecter d’autres virus cliniquement importants.

Le virus Zika peut être quantifié à l’aide de l’AFL, comme le montre schématiquement la figure 3. Pour la plaque à 24 puits, les cellules Vero infectées ont été fixées à 48 h, 60 h, 72 h, 84 h et 96 h après l’infection. Les résultats ont montré que les cellules sont restées intactes (aucun détachement cellulaire n’a été observé) 96 h (4 jours) après l’infection (figure 4 et figure supplémentaire 8A-E). L’apparitio...

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Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Le présent protocole décrit la propagation du virus Zika (ZIKV) dans les cellules rénales de singes verts d’Afrique et la quantification du virus Zika à l’aide de méthodes d’immunodétection colorimétrique cellulaires dans des formats à 24 puits et 96 puits (haut débit).

Propagation des virus et quantification colorimétrique cellulaire

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Ce protocole permet d’identifier et de quantifier le virus Zika sans dépendre de l’effet cytopathique. Cela dépend de la reconnaissance par les anticorps du composant du virus. L’utilisation d’anticorps spécifiques au virus peut aider à identifier différents sérotypes de virus dans des populations mixtes.Cette méthode présente des avantages par rapport aux tests classiques de formation de plaques. Il est plus rapide et compatible avec les applications à haut débit lors de l’application avec un système d’imagerie automatisé pour un comptage rapide des cellules. Le protocole proposé est très adaptable.Avec les modifications appropriées, le protocole proposé peut être appliqué à différents types de cellules et cibles virales. Commencez par cultiver des cellules Vero dans un flacon de culture cellulaire de 75 carrés = centimètres qui contient 12 millilitres de DMEM complété par 10% FBS et deux millimoles de L-glutamine. Placez le flacon dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Pour infecter la monocouche cellulaire, utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour retirer le milieu de culture du flacon de culture cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, rincez deux fois le flacon avec trois millilitres de DPBS. Ensuite, ajoutez deux millilitres de DMEM sans sérum et 20 microlitres d’inoculum du virus Zika dans le flacon de culture cellulaire.Laissez le flacon incuber à température ambiante pendant une heure en le balançant doucement pour favoriser l’adsorption du virus. À la fin de l’incubation, à l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, retirez et jetez soigneusement l’inoculum viral dilué du flacon de culture cellulaire. Rincez deux fois le flacon de culture cellulaire avec trois millilitres de DPBS.Ensuite, ajoutez 12 millilitres de milieu d’entretien dans le flacon de culture cellulaire pour maintenir les cellules infectées. Incuber les cellules Vero infectées pendant trois jours dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après trois jours d’incubation, utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour prélever le surnageant de culture cellulaire contenant le virus Zika dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.Pour la quantification du virus, ensemencez les cellules Vero dans des plaques désignées et laissez-les se développer pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec une atmosphère de dioxyde de carbone de 5 %. Préparez six tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 millilitre pour chaque plaque afin d’effectuer une dilution en série dix fois, y compris un tube supplémentaire pour un contrôle négatif. Pour une configuration de plaque à 24 puits, ajoutez 450 microlitres de DMEM sans sérum dans les six tubes de microcentrifugation.Pour une configuration de plaque à 96 puits, distribuez 135 microlitres de DMEM sans sérum dans six tubes supplémentaires. Pour effectuer une dilution en série pour l’expérience sur plaque à 24 puits, ajoutez 50 microlitres de stock de virus Zika dans le tube de 10 à moins un tube contenant 450 microlitres de DMEM sans sérum. Pour l’expérience sur plaque à 96 puits, ajoutez 15 microlitres de bouillon de virus Zika dans le tube de 10 à moins un tube contenant 135 microlitres de DMEM sans sérum.Vortex chaque tube pour bien mélanger le virus et le milieu, assurant une répartition uniforme des particules virales dans la dilution. À l’aide d’un embout de pipette neuf, remettre en suspension le tube de 10 à moins un et transférer 50 et 15 microlitres de virus Zika dilué dans le tube de 10 à moins deux comme deuxième dilution dix fois pour les plaques à 24 et 96 puits, respectivement. Retirez et jetez le milieu d’état pour chaque puits de la plaque appropriée.Rincez chaque puits avec DPBS deux fois pour éliminer les résidus. En commençant par la dilution la plus élevée, ajoutez l’inoculum de virus dilué en série dans les puits, en allant vers la dilution la plus faible. Après une heure d’incubation, retirez et jetez la suspension virale des puits, en commençant par la concentration la plus faible à la plus élevée.Lavez les cellules infectées avec du DPBS deux fois pour éliminer toute trace de suspension virale. Recouvrir le puits de DMEM et de carboxyméthylcellulose à faible viscosité à 1,5 %. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.Après l’incubation, retirez et jetez le milieu de recouvrement et lavez les cellules trois fois avec du PBS. Pour la plaque à 96 puits, utilisez une pipette multicanaux pour retirer et jeter le milieu de recouvrement, et lavez les cellules trois fois avec 60 microlitres de PBS par puits. Ajouter 4% de paraformaldéhyde pour fixer les cellules et incuber la plaque à température ambiante pendant 20 minutes.Après 20 minutes, jetez le paraformaldéhyde et lavez les cellules trois fois avec du PBS. Ensuite, ajoutez 3,3'diaminobenzidine peroxydase substrat et incubez la plaque pendant 30 minutes à l’obscurité. Après 30 minutes, arrêtez la réaction en lavant les puits avec de l’eau.Faites sécher les plaques à l’air libre pendant la nuit et procédez au dénombrement des foyers. Comptez les foyers pour chaque répétition de la dilution sélectionnée et calculez le nombre moyen de foyers pour chacun. Les cellules Vero infectées ont été fixées à différents moments après l’infection.Pour la plaque à 2 puits, la première apparition de foyers viraux a été observée 48 heures après l’infection, bien que la taille des foyers soit trop petite pour être comptée avec précision. Après 96 heures après l’infection, il n’y avait aucun signe de détachement cellulaire. À 60 heures après l’infection, la taille des foyers avait augmenté à un niveau optimal pour le comptage.Par la suite, au fil du temps, les foyers sont devenus plus grands et ont commencé à fusionner ou à se chevaucher les uns avec les autres en intensité, formant des grappes qui se sont agrandies au fil du temps. Par conséquent, les foyers formés 60 heures après l’infection ont été choisis pour déterminer le titre du virus Zika dans une plaque à 24 puits. Pour la plaque à 96 puits, les cellules sont restées intactes 72 heures après l’infection.L’apparition de foyers de virus a été observée pour la première fois 24 heures après l’infection. Cependant, jusqu’à 36 heures après l’infection, la taille des foyers était trop petite. La taille optimale des foyers a été atteinte 48 heures après l’infection.À ces derniers moments, on a observé des foyers qui se chevauchaient ou qui se confondaient, et le nombre de foyers qui se chevauchaient augmentait avec le temps. Les foyers formés 48 heures après l’infection ont été choisis pour déterminer le titre viral des isolats du virus Zika. Ajoutez doucement du DPBS sur le côté de chaque puits et faites basculer les plaques d’avant en arrière une à trois fois pour éliminer les débris cellulaires et l’excès de média.Cette technique profitera grandement aux chercheurs dans la recherche sur le virus Zika et peut également être largement adaptée pour quantifier d’autres virus cliniquement importants, ce qui en fait un outil précieux pour la surveillance et le diagnostic du virus.

Research

JoVE Journal

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Propagation d&#39;<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Par<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Culture Cellulaire

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