Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
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Diese Forschung wurde vom malaysischen Ministerium für Hochschulbildung im Rahmen des Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) und der Finanzierung des Higher Institution Centre of Excellence (HICoE)-Programms (MO002-2019) unterstützt. Abbildung 3 in dieser Studie, die zeigt, dass der Ablauf der Färbung für den focibildenden Assay aus "DAB Immunohistochemistry" von BioRender.com (2022) übernommen wurde. Abgerufen von https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. Virusvermehrung
<ol><li>Vorbereitung der Zellen<ol><li>Züchten Sie Vero-Zellen in einem 75cm großen 2-Zellkulturkolben, der 12 ml modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco enthält, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 2 mM L-Glutamin (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2.</li>
		<li>Überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop; Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

Es gibt mehrere Assays, um den Virustiter zu bestimmen. Die PFA hat ein ähnliches Protokoll zur Virusquantifizierung wie die FFA, bei der das Virusinokulum verdünnt wird, um die Unterscheidung einzelner Plaques oder Herde zu ermöglichen. Nach der Färbung weist jede Plaque oder jeder Herd auf ein einzelnes infektiöses Partikel im Inokulum19 hin. Das PFA wird mit Kristallviolett gefärbt, um die Plaquebildung durch Zelllyse oder Zelltod sichtbar zu machen. Daher ist die PFA zeitaufwändiger, da...

Die Infektion mit dem Zika-Virus (ZIKV) ist eine neu auftretende, durch Stechmücken übertragene Viruserkrankung. Die erste Isolierung des ZIKV fand 1947 in Uganda statt 1,2; Sie blieb von 1947 bis 2007 vernachlässigt, da die klinischen Symptome meist asymptomatisch und durch eine selbstlimitierende fieberhafte Erkrankung gekennzeichnet sind. Im Jahr 2007 begann die Zika-Epidemie auf den Yap-Inseln 3,4, gefolgt von größeren Epidemien in den pazifischen Regionen (Französisch-Polynesien, Osterinseln, Cookinseln und Neukaledonien) von 2013 bis 2014 5,6,7,8, wo erstmals die schwere neurologische Komplikation Guillain-Barré-Syndrom (GBS) bei Erwachsenen berichtet wurde9. In den Jahren 2015 und 2016 breitete sich die erste weit verbreitete ZIKV-Epidemie über den amerikanischen Kontinent aus, nachdem bereits 2013 der asiatische Genotyp des ZIKV in Brasilien aufgetreten war. Während dieses Ausbruchs wurden 440.000 bis 1,3 Millionen Fälle von Mikrozephalie und anderen neurologischen Erkrankungen bei Neugeborenen gemeldet11. Derzeit gibt es keine spezifische Heilung oder Behandlung für die ZIKV-Infektion. Daher besteht ein dringender medizinischer Bedarf an ZIKV-Impfstoffen, die in der Lage sind, Infektionen insbesondere während der Schwangerschaft zu verhindern.
Die Virusquantifizierung ist ein Verfahren, um die Anzahl der in einer Probe vorhandenen Viren zu bestimmen. Sie spielt eine wichtige Rolle in der Forschung, und akademische Laboratorien umfassen viele Bereiche, wie z. B. Medizin und Biowissenschaften. Dieser Prozess ist auch in kommerziellen Bereichen wichtig, wie z. B. bei der Herstellung von viralen Impfstoffen, rekombinanten Proteinen, viralen Antigenen oder antiviralen Wirkstoffen. Viele Methoden oder Assays können für die Virusquantifizierung verwendet werden12. Die Wahl der Methoden oder Assays hängt in der Regel von den Eigenschaften des Virus, dem gewünschten Genauigkeitsgrad und der Art des Experiments oder der Forschung ab. Im Allgemeinen können Methoden zur Quantifizierung von Viren in zwei Kategorien unterteilt werden: molekulare Assays, die das Vorhandensein von viraler Nukleinsäure (DNA oder RNA) nachweisen, und Assays, die die Virusinfektiosität in vitro messen 12. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR, für DNA) oder die quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR, für RNA)13 und die digitale Tröpfchen-PCR14 sind Beispiele für gängige molekulare Techniken, die zur Quantifizierung der viralen Nukleinsäure in einer bestimmten Probe verwendet werden15. Diese hochempfindlichen molekularen Techniken können jedoch nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Viren unterscheiden15. Daher können Forschungsarbeiten, die Informationen über biologische Merkmale wie die Infektiosität von Viren auf Zellen erfordern, nicht mit den oben genannten molekularen Techniken abgeschlossen werden. Es werden Assays benötigt, die das Vorhandensein lebensfähiger Viren messen und bestimmen können. Zu den Assays, die die Virusinfektiosität messen, gehören der Plaque-bildende Assay (PFA), die infektiöse Dosis von 50 % der Gewebekultur (TCID50), der Fluoreszenz-Fokus-Assay und die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)12.
Die PFA, die 1952 von Renato Dulbecco entwickelt wurde, ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Virustitration, auch für ZIKV16. Es wird verwendet, um die Viruskonzentrationen für infektiöse lytische Virionen direkt zu bestimmen. Die Methode basiert auf der Fähigkeit eines lytischen Virus, zytopathische Effekte (CPEs; Zelltodzonen oder Plaques, ein Infektionsbereich, der von nicht infizierten Zellen umgeben ist) in einer inokulierten Zellmonoschicht nach einer Virusinfektion hervorzurufen. Der Assay hat jedoch mehrere Nachteile, die sich auf seinen Nutzen auswirken. Der Assay ist zeitaufwändig (dauert ca. 7-10 Tage, je nach Viren), CPE-abhängig und fehleranfällig. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine immunkolorimetrische Technik, den Focus Forming Assay (FFA), zum Nachweis und zur Quantifizierung von ZIKV in 24-Well-Platten- und 96-Well-Plattenformaten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein von Stechmücken übertragenes Virus der Gattung Flavivirus. Eine ZIKV-Infektion wurde mit angeborenen Hirnanomalien und möglicherweise dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen in Verbindung gebracht. Die Erforschung des ZIKV zum Verständnis der Krankheitsmechanismen ist wichtig, um die Entwicklung von Impfstoffen und Therapien zu erleichtern. Die Methode zur Quantifizierung von Viren ist im Bereich der Virologie von entscheidender Bedeutung. Der Fokusformungstest (FFA) ist ein Virusquantifizierungstest, der das virale Antigen mit Antikörpern nachweist und die Infektionsherde von Zellen mit Hilfe der Peroxidase-Immunfärbetechnik identifiziert. Die aktuelle Studie beschreibt das Protokoll zur Ausbreitung und Quantifizierung des Virus sowohl im 24-Well- als auch im 96-Well-Format (hoher Durchsatz). Im Vergleich zu anderen ähnlichen Studien hat dieses Protokoll die Optimierung der Foci-Größe weiter beschrieben, was als Leitfaden dienen kann, um die Verwendung dieses Assays auf andere Viren auszuweiten. Zunächst wird die ZIKV-Vermehrung in Vero-Zellen für 3 Tage durchgeführt. Der ZIKV-haltige Kulturüberstand wird geerntet und mit Hilfe der FFA quantifiziert. Kurz gesagt, die Viruskultur wird auf Vero-Zellen inokuliert und für 2-3 Tage inkubiert. Die Foci-Bildung wird dann nach optimierten Färbeprozessen bestimmt, einschließlich Zellfixierung, Permeabilisierung, Blockierung, Antikörperbindung und Inkubation mit Peroxidase-Substrat. Die gefärbten Virusherde werden mit einem Stereomikroskop (manuelle Zählung im 24-Well-Format) oder Software-Analysator (automatische Zählung im 96-Well-Format) visualisiert. Die FFA liefert reproduzierbare, relativ schnelle Ergebnisse (3-4 Tage) und eignet sich für den Einsatz bei verschiedenen Viren, einschließlich nicht-plaquebildender Viren. In der Folge ist dieses Protokoll nützlich für die Untersuchung von ZIKV-Infektionen und könnte zum Nachweis anderer klinisch wichtiger Viren verwendet werden.

ZIKV kann mit Hilfe der FFA quantifiziert werden, wie in Abbildung 3 schematisch dargestellt. Für die 24-Well-Platte wurden die infizierten Vero-Zellen 48 h, 60 h, 72 h, 84 h und 96 h nach der Infektion fixiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen auch 96 h (4 Tage) nach der Infektion intakt blieben (es wurde keine Zellablösung beobachtet) (Abbildung 4 und ergänzende Abbildung 8A-E). Das Auftreten von Virusherden wurde erstmals 48 h (2 Ta...

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Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vermehrung des Zika-Virus (ZIKV) in Nierenzellen von Vero-Afrikanischen Grünen Meerkatzen und die Quantifizierung von ZIKV unter Verwendung zellbasierter kolorimetrischer Immundetektionsmethoden in 24-Well- und 96-Well-Formaten (Hochdurchsatz).

Virusvermehrung und zellbasierte kolorimetrische Quantifizierung

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung des Zika-Virus, ohne auf die zytopathische Wirkung angewiesen zu sein. Es hängt von der Antikörpererkennung der Viruskomponente ab. Die Verwendung von virusspezifischen Antikörpern kann bei der Identifizierung verschiedener Virus-Serotypen in gemischten Populationen helfen.Diese Methode hat Vorteile gegenüber klassischen Plaque-bildenden Assays. Es ist schneller und eignet sich für Anwendungen mit hohem Durchsatz, wenn es mit einem automatisierten Bildgebungssystem für eine schnelle Zellzählung angewendet wird. Das vorgeschlagene Protokoll ist in hohem Maße anpassungsfähig.Mit entsprechenden Modifikationen kann das vorgeschlagene Protokoll auf verschiedene Zelltypen und virale Ziele angewendet werden. Beginnen Sie mit der Züchtung von Vero-Zellen in einer 75 Quadrat=Zentimeter großen Zellkulturflasche, die 12 Milliliter DMEM enthält, ergänzt mit 10% FBS und zwei Millimol L-Glutamin. Den Kolben in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid stellen.Um die Zellmonoschicht zu infizieren, verwenden Sie eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um das Wachstumsmedium aus dem Zellkulturkolben zu entfernen. Spülen Sie den Kolben mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette zweimal mit drei Millilitern DPBS aus. Als nächstes werden zwei Milliliter serumfreies DMEM und 20 Mikroliter Zika-Virus-Inokulum in den Zellkulturkolben gegeben.Lassen Sie den Kolben eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren und dabei leicht schaukeln, um die Adsorption des Virus zu fördern. Am Ende der Inkubation wird mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette das verdünnte Virusinokulum vorsichtig aus dem Zellkulturkolben entnommen und verworfen. Spülen Sie den Zellkulturkolben zweimal mit drei Millilitern DPBS.Geben Sie dann 12 Milliliter Erhaltungsmedien in die Zellkulturflasche, um die infizierten Zellen zu erhalten. Inkubieren Sie die infizierten Vero-Zellen drei Tage lang in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach dreitägiger Inkubation wird der Zellkulturüberstand mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geerntet.Für die Virusquantifizierung werden Vero-Zellen in dafür vorgesehenen Platten ausgesät und über Nacht bei 37 Grad Celsius mit einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid wachsen lassen. Bereiten Sie sechs sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Platte vor, um eine zehnfache serielle Verdünnung durchzuführen, einschließlich eines zusätzlichen Röhrchens für eine Negativkontrolle. Für ein 24-Well-Platten-Setup geben Sie 450 Mikroliter serumfreies DMEM in alle sechs Mikrozentrifugenröhrchen.Für ein 96-Well-Platten-Setup geben Sie 135 Mikroliter serumfreies DMEM in sechs zusätzliche Röhrchen. Um eine serielle Verdünnung für das 24-Well-Plattenexperiment durchzuführen, werden 50 Mikroliter des Zika-Virus-Stamms in das 10 bis minus ein Röhrchen mit 450 Mikrolitern serumfreiem DMEM gegeben. Für das 96-Well-Plattenexperiment werden 15 Mikroliter Zika-Virus-Stamm in das 10 bis minus ein Röhrchen mit 135 Mikrolitern serumfreiem DMEM gegeben.Vortex jedes Röhrchen, um das Virus und das Medium gründlich zu vermischen und eine gleichmäßige Verteilung der Viruspartikel innerhalb der Verdünnung zu gewährleisten. Verwenden Sie eine frische Pipettenspitze, resuspendieren Sie das 10 bis minus ein Röhrchen und überführen Sie 50 und 15 Mikroliter verdünntes Zika-Virus in das 10 bis minus zwei Röhrchen als zweite zehnfache Verdünnung für die 24- bzw. 96-Well-Platten. Entfernen und entsorgen Sie das Konditionsmedium für jede Vertiefung der entsprechenden Platte.Spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit DPBS aus, um Rückstände zu entfernen. Beginnen Sie mit der höchsten Verdünnung und geben Sie das seriell verdünnte Virusinokulum in die Vertiefungen und arbeiten Sie sich auf die niedrigste Verdünnung hin. Nach einer Stunde Inkubation wird die Virussuspension aus den Vertiefungen entfernt und entsorgt, beginnend mit der niedrigsten bis zur höchsten Konzentration.Waschen Sie die infizierten Zellen zweimal mit DPBS, um alle Spuren der Virussuspension zu entfernen. Überlagern Sie die Vertiefung mit DMEM und 1,5 % Carboxymethylcellulose mit niedriger Viskosität. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.Nach der Inkubation wird das Overlay-Medium entfernt und verworfen und die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Verwenden Sie für die 96-Well-Platte eine Mehrkanalpipette, um das Overlay-Medium zu entfernen und zu entsorgen, und waschen Sie die Zellen dreimal mit 60 Mikrolitern PBS pro Well. Fügen Sie 4 % Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen zu fixieren, und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.Nach 20 Minuten entsorgen Sie das Paraformaldehyd und waschen die Zellen dreimal mit PBS. Als nächstes fügen Sie 3, 3'Diaminobenzidinperoxidase-Substrat hinzu und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln. Stoppen Sie die Reaktion nach 30 Minuten, indem Sie die Vertiefungen mit Wasser waschen.Lassen Sie die Platten über Nacht an der Luft trocknen und fahren Sie mit der Zählung der Brennpunkte fort. Zählen Sie die Brennpunkte für jedes Replikat der ausgewählten Verdünnung und berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Brennpunkte für jeden. Die infizierten Vero-Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion fixiert.Bei der 2-Well-Platte wurde das erste Auftreten von Virusherden 48 Stunden nach der Infektion beobachtet, obwohl die Herdegröße zu klein war, um sie genau zu zählen. Nach 96 Stunden nach der Infektion gab es keine Anzeichen einer Zellablösung. 60 Stunden nach der Infektion hatte sich die Größe der Herde auf ein optimales Niveau für die Zählung erhöht.Im Laufe der Zeit wurden die Brennpunkte größer und begannen, in ihrer Intensität miteinander zu verschmelzen oder sich zu überlappen, wodurch sich Cluster bildeten, die im Laufe der Zeit wuchsen. Daher wurden Herde, die sich 60 Stunden nach der Infektion bildeten, ausgewählt, um den Zika-Virus-Titer in einer 24-Well-Platte zu bestimmen. Bei der 96-Well-Platte blieben die Zellen 72 Stunden nach der Infektion intakt.Das Auftreten von Virusherden wurde erstmals 24 Stunden nach der Infektion beobachtet. Bis zu 36 Stunden nach der Infektion waren die Herde jedoch zu klein. Die optimale Herdgröße wurde 48 Stunden nach der Infektion erreicht.Zu letzteren Zeitpunkten wurden überlappende oder verschmolzene Herde beobachtet, und die Anzahl der überlappenden Herde nahm im Laufe der Zeit zu. Die Herde, die sich 48 Stunden nach der Infektion bildeten, wurden ausgewählt, um den Virustiter von Zika-Virus-Isolaten zu bestimmen. Geben Sie vorsichtig DPBS an der Seite jedes Wells hinzu und schwenken Sie die Platten ein- bis dreimal hin und her, um Zelltrümmer und überschüssiges Medium zu entfernen.Diese Technik wird Forschern in der Zika-Forschung sehr zugute kommen und kann auch auf breiter Basis angepasst werden, um andere klinisch wichtige Viren zu quantifizieren, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für die Virusüberwachung und -diagnose macht.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Ausbreitung von<em&gt; Homalodisca coagulata Virus-01</em&gt; Über<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Zellkultur

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Schnelle, sichere und einfache manuelle am Krankenbett Nukleinsäure-Extraktion für den Nachweis des Virus in Vollblut-Proben

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolierung und Quantifizierung des Zika-Virus aus mehreren Organen in einer Maus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwut-Impfstoffen

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...