Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

מחקר זה קיבל תמיכה ממשרד ההשכלה הגבוהה מלזיה במסגרת תוכנית מענקי המחקר לטווח ארוך (LRGS MRUN שלב 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) ומימון לתוכנית מרכז המצוינות של המוסד הגבוה (HICoE) (MO002-2019). איור 3 במחקר זה שמראה את זרימת העבודה של צביעה עבור בדיקת יצירת מוקדים מותאמת מתוך "DAB Immunohistochemistry" על ידי BioRender.com (2022). מקור: https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. התפשטות וירוסים
<ol><li>הכנת תאים<ol><li>לגדל תאי Vero בבקבוק תרבית תאיםבגודל 75 ס"מ המכיל 12 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-2 מילימטר L-גלוטמין (ראה טבלת חומרים). לדגור על התאים באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
		<li>לפקח על התאי...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

ישנן מספר בדיקות כדי לקבוע titer וירוס; ל- PFA יש פרוטוקול כימות וירוסים דומה ל- FFA, שבו החיסון נגד הנגיף מדולל כדי לאפשר הבחנה בין פלאקים או מוקדים בודדים. לאחר הצביעה, כל פלאק או מוקד מצביע על חלקיק זיהומי יחיד בחיסון19. ה- PFA מוכתם בסגול קריסטל כדי לדמיין היווצרות פלאק הנגרמת על ידי ?...

זיהום בנגיף זיקה (ZIKV) הוא מחלה נגיפית מתפתחת המועברת על ידי יתושים. הבידוד הראשון של ZIKV היה באוגנדה בשנת 1947 1,2; היא נותרה מוזנחת מ-1947 עד 2007, שכן הסימפטומים הקליניים הם לרוב א-סימפטומטיים ומאופיינים במחלת חום המגבילה את עצמה. בשנת 2007, מגיפת זיקה החלה באיי יאפ 3,4, ואחריה מגיפות גדולות יותר באזורי האוקיינוס השקט (פולינזיה הצרפתית, אי הפסחא, איי קוק וקלדוניה החדשה) משנת 2013 עד 2014 5,6,7,8, שם הסיבוך הנוירולוגי החמור תסמונת Guillain-Barré (GBS) דווח לראשונה במבוגרים 9. במהלך 2015 ו -2016, מגיפת ZIKV הנרחבת הראשונה שטפה את אמריקה לאחר הופעת הגנוטיפ האסייתי של ZIKV בברזיל כבר בשנת 201310. במהלך התפרצות זו, 440,000 עד 1.3 מיליון מקרים של מיקרוצפליה, והפרעות נוירולוגיות אחרות, דווחו בתינוקות שזה עתה נולדו11. כיום אין תרופה או טיפול ספציפיים לזיהום ZIKV; לפיכך, קיים צורך רפואי דחוף בחיסוני ZIKV המסוגלים למנוע זיהומים, במיוחד במהלך ההריון.
כימות וירוסים הוא תהליך לקביעת מספר הנגיפים הקיימים בדגימה. היא ממלאת תפקיד חשוב במחקר, ומעבדות אקדמיות מערבות תחומים רבים, כגון רפואה ומדעי החיים. תהליך זה חשוב גם במגזרים מסחריים, כגון ייצור חיסונים נגיפיים, חלבונים רקומביננטיים, אנטיגנים נגיפיים או חומרים אנטי-ויראליים. שיטות או בדיקות רבות יכולות לשמש לכימות וירוסים12. בחירת השיטות או הבדיקות תלויה בדרך כלל במאפייני הנגיף, ברמת הדיוק הרצויה ובאופי הניסוי או המחקר. באופן כללי, ניתן לחלק את שיטות הכימות של וירוסים לשתי קטגוריות: בדיקות מולקולריות המזהות נוכחות של חומצת גרעין ויראלית (DNA או RNA) ובדיקות המודדות את ההדבקה בנגיף במבחנה12. תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR, עבור DNA) או תגובת שרשרת כמותית של פולימראז שעתוק לאחור (qRT-PCR, עבור RNA)13 ו- PCR14 טיפתי דיגיטלי הן דוגמאות לטכניקות מולקולריות נפוצות המשמשות לכימות חומצת הגרעין הנגיפית במדגם נתון15. עם זאת, טכניקות מולקולריות רגישות מאוד אלה אינן יכולות להבדיל בין וירוסים בני קיימא ושאינם בני קיימא15. לכן, מחקר הדורש מידע על תכונות ביולוגיות, כגון הדבקה של וירוסים בתאים, אינו יכול להסתיים באמצעות הטכניקות המולקולריות שהוזכרו לעיל; יש צורך בבדיקות שיכולות למדוד ולקבוע את נוכחותם של וירוסים בני קיימא. בדיקות המודדות את ההדבקה בנגיף כוללות את בדיקת יצירת הפלאק (PFA), מינון זיהומי של 50% תרבית רקמה (TCID50), בדיקת מיקוד פלואורסצנטי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)12.
PFA, שפותחה על ידי רנאטו דולבקו בשנת 1952, היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לטיטרציה של וירוסים, כולל עבור ZIKV16. הוא משמש כדי לקבוע ישירות את ריכוזי הנגיפים עבור virions lytic זיהומיות. השיטה מבוססת על יכולתו של וירוס ליטי לייצר השפעות ציטופתיות (CPEs; אזורים של מוות תאי או פלאקים, אזור של זיהום מוקף תאים לא נגועים) בחד-שכבה של תאים מחוסנים לאחר הדבקה ויראלית. עם זאת, ישנם מספר חסרונות לבדיקה המשפיעים על התועלת שלה. הבדיקה גוזלת זמן (אורכת כ-7-10 ימים, תלוי בווירוסים), תלויה ב-CPE ומועדת לשגיאות. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים על טכניקה אימונוקולורימטרית, בדיקת יצירת מיקוד (FFA), לזיהוי וכימות ZIKV בפורמטים של לוחות 24 בארות ולוחות 96 בארות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

נגיף זיקה (ZIKV) הוא נגיף המועבר על ידי יתושים השייך לסוג Flavivirus. זיהום ZIKV נקשר למומים מולדים במוח ואולי לתסמונת Guillain-Barré אצל מבוגרים. מחקר על ZIKV כדי להבין את מנגנוני המחלה חשוב כדי להקל על פיתוח החיסון והטיפול. שיטת כימות הנגיפים היא חיונית ובסיסית בתחום הווירולוגיה. בדיקת יצירת המיקוד (FFA) היא בדיקת כימות וירוסים המזהה את האנטיגן הנגיפי עם נוגדנים ומזהה את מוקדי הזיהום של תאים באמצעות טכניקת הצביעה החיסונית peroxidase. המחקר הנוכחי מתאר את פרוטוקול ההתפשטות והכימות של וירוסים באמצעות פורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה). בהשוואה למחקרים דומים אחרים, פרוטוקול זה תיאר עוד יותר אופטימיזציה של גודל מוקדים, אשר יכול לשמש כמדריך להרחבת השימוש בבדיקה זו עבור וירוסים אחרים. ראשית, התפשטות ZIKV מבוצעת בתאי Vero במשך 3 ימים. סופרנאטנט התרבית המכיל ZIKV נקצר ומכומת באמצעות FFA. בקצרה, תרבית הנגיף מחוסנת על תאי ורו ומודגרת במשך 2-3 ימים. היווצרות מוקדים נקבעת לאחר תהליכי צביעה אופטימליים, כולל קיבוע תאים, חלחול, חסימה, קשירת נוגדנים ודגירת מצע פרוקסידז. מוקדי הנגיף המוכתמים מוצגים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו (ספירה ידנית בפורמט 24 בארות) או מנתח תוכנה (ספירה אוטומטית בפורמט 96 בארות). ה- FFA מספק תוצאות ניתנות לשחזור, מהירות יחסית (3-4 ימים) ומתאים לשימוש עבור וירוסים שונים, כולל וירוסים שאינם יוצרי פלאק. לאחר מכן, פרוטוקול זה שימושי לחקר זיהום ZIKV וניתן להשתמש בו כדי לזהות וירוסים חשובים אחרים מבחינה קלינית.

ניתן לכמת את ZIKV באמצעות FFA, כפי שמתואר באופן סכמטי באיור 3. עבור צלחת 24 בארות, תאי Vero נגועים תוקנו ב 48 שעות, 60 שעות, 72 שעות, 84 שעות, ו 96 שעות לאחר ההדבקה. התוצאות הראו שהתאים נשארו שלמים (לא נצפתה היפרדות תאים) לאחר 96 שעות (4 ימים) לאחר ההדבקה (איור 4 ואיור משלים 8...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התפשטות נגיף הזיקה (ZIKV) בתאי כליות של קוף ירוק אפריקאי ורו ואת הכימות של ZIKV באמצעות שיטות זיהוי חיסוני קולורימטרי מבוססות תאים בפורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה).

התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

פרוטוקול זה מאפשר לזהות ולכמת את נגיף הזיקה מבלי להסתמך על אפקט ציטופתי. זה תלוי בזיהוי נוגדנים של מרכיב הנגיף. השימוש בנוגדנים ספציפיים לנגיף יכול לסייע בזיהוי סרוטיפים שונים של הנגיף באוכלוסיות מעורבות.לשיטה זו יתרונות על פני מבחני יצירת פלאק קלאסיים. הוא מהיר יותר ומופעל עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה בעת הגשת בקשה עם מערכת הדמיה אוטומטית לספירת תאים מהירה. הפרוטוקול המוצע הוא בעל יכולת התאמה גבוהה.עם שינויים מתאימים, הפרוטוקול המוצע יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ומטרות ויראליות. התחילו בגידול תאי Vero בבקבוק תרבית תאים בגודל 75 ריבוע=סנטימטר המכיל 12 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS ושני מילימולים של L-גלוטמין. מניחים את הבקבוק באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.כדי להדביק את חד-שכבתי התא, השתמש בפיפט סרולוגי של 10 מיליליטר כדי להסיר את מדיום הגידול מבקבוק תרבית התא. באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, שטפו את הבקבוק עם שלושה מיליליטר של DPBS פעמיים. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של DMEM ללא סרום ו -20 מיקרוליטר של חיסון נגיף זיקה לבקבוק תרבית התא.תנו לבקבוק לדגור בטמפרטורת החדר במשך שעה עם נדנוד עדין כדי לעודד ספיחת וירוסים. בסוף הדגירה, באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, להסיר בזהירות ולהשליך את החיסון וירוס מדולל מן בקבוק תרבית התא. שטפו את בקבוק תרבית התאים פעמיים עם שלושה מיליליטר של DPBS.לאחר מכן, הוסיפו 12 מיליליטר של אמצעי תחזוקה לבקבוק תרבית התאים כדי לשמור על התאים הנגועים. לדגור על תאי Vero הנגועים במשך שלושה ימים באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר שלושה ימי דגירה, השתמשו בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לקצור את הסופרנאטנט של תרבית התאים המכיל את נגיף הזיקה לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.לצורך כימות הנגיף, זרעו תאי ורו בצלחות ייעודיות ואפשרו להם לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני. הכינו שישה צינורות מיקרו-צנטריפוגות סטריליים של 1.5 מיליליטר לכל צלחת כדי לבצע דילול סדרתי פי עשרה, כולל צינור נוסף לבקרה שלילית. להגדרת צלחת של 24 בארות, הוסף 450 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום לכל ששת צינורות המיקרוצנטריפוגה.להתקנת צלחת של 96 בארות, יש להוציא 135 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום לשש שפופרות נוספות. כדי לבצע דילול סדרתי עבור ניסוי צלחת 24 בארות, להוסיף 50 מיקרוליטר של מלאי וירוס זיקה לתוך 10 עד מינוס צינור אחד המכיל 450 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום. עבור ניסוי צלחת 96 בארות, להוסיף 15 מיקרוליטר של מלאי וירוס זיקה לתוך 10 עד מינוס צינור אחד המכיל 135 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום.מערבלים כל צינור כדי לערבב היטב את הנגיף והמדיום, ומבטיחים פיזור אחיד של חלקיקי הנגיף בתוך הדילול. בעזרת קצה פיפטה טרי, השהה מחדש את הצינור 10 עד מינוס אחד והעבר 50 ו -15 מיקרוליטר של נגיף זיקה מדולל לתוך צינור 10 עד מינוס שניים כדילול שני פי עשרה עבור לוחות 24 ו -96 בארות, בהתאמה. מוציאים ומשליכים את אמצעי ההצבה לכל באר של הצלחת המתאימה.שטפו היטב כל אחד מהם עם DPBS פעמיים כדי להסיר שאריות. מתחילים עם הדילול הגבוה ביותר, מוסיפים את החיסון נגד וירוסים בדילול סדרתי לבארות, ועובדים לקראת הדילול הנמוך ביותר. לאחר שעה של דגירה, להסיר ולהשליך את הנגיף ההשעיה מן הבארות, החל מהריכוז הנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר.לשטוף את התאים הנגועים עם DPBS פעמיים כדי להסיר עקבות של השעיית וירוס. לכסות את הבאר עם DMEM ו 1.5% צמיגות נמוכה carboxymethylcellulose. לדגור על הצלחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה, להסיר ולהשליך את המדיום כיסוי ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. עבור צלחת 96 באר, להשתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר ולהשליך את המדיום כיסוי, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 60 מיקרוליטר של PBS לכל באר. מוסיפים 4% פאראפורמלדהיד כדי לקבע את התאים ולדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.לאחר 20 דקות, להשליך את paraformaldehyde ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, מוסיפים 3, 3'diaminobenzidine peroxidase מצע לדגור את הצלחת במשך 30 דקות בחושך. לאחר 30 דקות, להפסיק את התגובה על ידי שטיפת הבארות עם מים.ייבשו את הצלחות באוויר למשך הלילה והמשיכו לספירת מוקדים. ספרו את המוקדים עבור כל העתק של הדילול שנבחר וחשבו את מספר המוקדים הממוצע עבור כל אחד מהם. תאי ורו הנגועים תוקנו בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה.עבור צלחת 2 בארות, ההופעה הראשונה של מוקדי הנגיף נצפתה 48 שעות לאחר ההדבקה, אם כי גודל המוקדים היה קטן מכדי לספור במדויק. לאחר 96 שעות לאחר ההדבקה, לא היו סימנים לניתוק תאים. לאחר 60 שעות לאחר ההדבקה, גודל המוקדים עלה לרמה אופטימלית לספירה.בהמשך, ככל שהתקדם הזמן, המוקדים גדלו והחלו להתמזג או לחפוף זה עם זה בעוצמתם, ויצרו אשכולות שגדלו עם הזמן. לכן, מוקדים שנוצרו 60 שעות לאחר ההדבקה נבחרו כדי לקבוע את טיטר וירוס זיקה בצלחת 24 באר. עבור צלחת 96 בארות, התאים נותרו שלמים לאחר 72 שעות לאחר ההדבקה.הופעת מוקדי הנגיף נצפתה לראשונה 24 שעות לאחר ההדבקה. עם זאת, עד 36 שעות לאחר ההדבקה, גודל המוקדים היה קטן מדי. גודל המוקדים האופטימלי הושג 48 שעות לאחר ההדבקה.בנקודות הזמן האחרונות נצפו מוקדים חופפים או ממוזגים, ומספר המוקדים החופפים גדל עם הזמן. המוקדים נוצרו 48 שעות לאחר בחירת ההדבקה כדי לקבוע את טיטר הנגיף של נגיף זיקה מבודד. הוסיפו בעדינות DPBS בצד של כל באר ונענעו את הלוחות אחורה וקדימה פעם עד שלוש פעמים כדי להסיר פסולת תאית ועודפי מדיה.טכניקה זו תועיל מאוד לחוקרים במחקר זיקה, וניתן גם להתאים אותה באופן נרחב לכימות וירוסים אחרים בעלי חשיבות קלינית, מה שהופך אותה לכלי רב ערך למעקב ואבחון וירוסים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

רביה של<em&gt; וירוס-01 coagulata Homalodisca</em&gt; דרך<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; תרבות תא

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

כימות של נוגדנים תלויי שיפור של הנגיף Zika בתאי אדם ראשי

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

בידוד וקוונפיקציה של וירוס Zika ממספר איברים בעכבר

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...