Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Questa ricerca ha ricevuto il sostegno del Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia nell'ambito del Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) e il finanziamento del programma Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). La figura 3 di questo studio, che mostra il flusso di lavoro della colorazione per il test di formazione dei focolai, è adattata da "DAB Immunoistochemistry" di BioRender.com (2022). Estratto da https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. Propagazione del virus
<ol><li>Preparazione delle cellule<ol><li>Coltivare le cellule Vero in un matraccio da75 cm contenente 12 mL di terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 2 mM di L-glutammina (vedi Tabella dei materiali). Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .</li>
		<li>Monitorare le cellule al microscopio; una volta che le celle raggiungono il 70%-...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

Esistono diversi test per determinare il titolo del virus; il PFA ha un protocollo di quantificazione del virus simile a quello dell'FFA, in cui l'inoculo virale viene diluito per consentire di distinguere le singole placche o focolai. Dopo la colorazione, ogni placca o focolai indica una singola particella infettiva nell'inoculo19. Il PFA è colorato con cristallo viola per visualizzare la formazione di placca causata dalla lisi o dalla morte cellulare. Quindi, il PFA richiede più tempo, in quan...

L'infezione da virus Zika (ZIKV) è una malattia virale emergente trasmessa dalle zanzare. Il primo isolamento di ZIKV avvenne in Uganda nel 1947 1,2; È rimasta trascurata dal 1947 al 2007, poiché i sintomi clinici sono più comunemente asintomatici e caratterizzati da malattia febbrile autolimitante. Nel 2007, l'epidemia di Zika è iniziata nelle isole Yap 3,4, seguita da epidemie più grandi nelle regioni del Pacifico (Polinesia francese, Isola di Pasqua, Isole Cook e Nuova Caledonia) dal 2013 al 2014 5,6,7,8, dove la grave complicanza neurologica sindrome di Guillain-Barré (GBS) è stata segnalata per la prima volta negli adulti 9. Tra il 2015 e il 2016, la prima epidemia diffusa di ZIKV si è diffusa nelle Americhe dopo l'emergere del genotipo asiatico di ZIKV in Brasile già nel 201310. Durante questa epidemia, sono stati segnalati da 440.000 a 1,3 milioni di casi di microcefalia e altri disturbi neurologici nei neonati. Attualmente non esiste una cura o un trattamento specifico per l'infezione da ZIKV; quindi, c'è un urgente bisogno medico di vaccini ZIKV in grado di prevenire le infezioni, in particolare durante la gravidanza.
La quantificazione dei virus è un processo per determinare il numero di virus presenti in un campione. Svolge un ruolo importante nella ricerca e i laboratori accademici coinvolgono molti campi, come la medicina e le scienze della vita. Questo processo è importante anche in settori commerciali, come la produzione di vaccini virali, proteine ricombinanti, antigeni virali o agenti antivirali. Per la quantificazione dei virus possono essere utilizzati molti metodi o saggi12. La scelta dei metodi o dei saggi dipende normalmente dalle caratteristiche del virus, dal livello di accuratezza desiderato e dalla natura dell'esperimento o della ricerca. In generale, i metodi di quantificazione dei virus possono essere suddivisi in due categorie: saggi molecolari che rilevano la presenza di acido nucleico virale (DNA o RNA) e saggi che misurano l'infettività del virus in vitro12. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR, per il DNA) o la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR, per l'RNA)13 e la PCR a goccia digitale14 sono esempi di tecniche molecolari comuni utilizzate per quantificare l'acido nucleico virale in un dato campione15. Tuttavia, queste tecniche molecolari altamente sensibili non sono in grado di distinguere tra virus vitali e non vitali15. Pertanto, le ricerche che richiedono informazioni sulle caratteristiche biologiche, come l'infettività del virus sulle cellule, non possono essere completate utilizzando le tecniche molecolari sopra menzionate; Sono necessari saggi in grado di misurare e determinare la presenza di virus vitali. I saggi che misurano l'infettività del virus includono il test di formazione della placca (PFA), la dose infettiva di coltura tissutale al 50% (TCID50), il test di focalizzazione fluorescente e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)12.
Il PFA, sviluppato da Renato Dulbecco nel 1952, è uno dei metodi più comunemente utilizzati per la titolazione del virus, anche per ZIKV16. Viene utilizzato per determinare direttamente le concentrazioni virali per i virioni litici infettivi. Il metodo si basa sulla capacità di un virus litico di produrre effetti citopatici (CPE; zone di morte cellulare o placche, un'area di infezione circondata da cellule non infette) in un monostrato di cellule inoculate dopo l'infezione virale. Tuttavia, ci sono diversi inconvenienti nel test che ne influenzano l'utilità. Il test richiede molto tempo (richiede circa 7-10 giorni, a seconda dei virus), dipende da CPE ed è soggetto a errori. Nel presente studio, riportiamo una tecnica immunocolorimetrica, il test di formazione del fuoco (FFA), per rilevare e quantificare ZIKV in formati di piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

Il virus Zika (ZIKV) è un virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus. L'infezione da ZIKV è stata associata ad anomalie cerebrali congenite e potenzialmente alla sindrome di Guillain-Barré negli adulti. La ricerca su ZIKV per comprendere i meccanismi della malattia è importante per facilitare lo sviluppo di vaccini e trattamenti. Il metodo di quantificazione dei virus è cruciale e fondamentale nel campo della virologia. Il focus forming assay (FFA) è un test di quantificazione del virus che rileva l'antigene virale con gli anticorpi e identifica i focolai di infezione delle cellule utilizzando la tecnica di immunocolorazione della perossidasi. L'attuale studio descrive il protocollo di propagazione e quantificazione del virus utilizzando sia i formati a 24 pozzetti che a 96 pozzetti (high throughput). Rispetto ad altri studi simili, questo protocollo ha ulteriormente descritto l'ottimizzazione delle dimensioni dei focolai, che può servire come guida per espandere l'uso di questo test per altri virus. In primo luogo, la propagazione di ZIKV viene eseguita in cellule Vero per 3 giorni. Il surnatante di coltura contenente ZIKV viene raccolto e quantificato utilizzando l'FFA. In breve, la coltura virale viene inoculata su cellule Vero e incubata per 2-3 giorni. La formazione di focolai viene quindi determinata dopo processi di colorazione ottimizzati, tra cui la fissazione cellulare, la permeabilizzazione, il blocco, il legame degli anticorpi e l'incubazione con substrato di perossidasi. I focolai virali colorati vengono visualizzati utilizzando uno stereomicroscopio (conteggio manuale in formato a 24 pozzetti) o un analizzatore software (conteggio automatizzato in formato a 96 pozzetti). L'FFA fornisce risultati riproducibili e relativamente rapidi (3-4 giorni) ed è adatto per essere utilizzato per diversi virus, compresi quelli che non formano placca. Successivamente, questo protocollo è utile per lo studio dell'infezione da ZIKV e potrebbe essere utilizzato per rilevare altri virus clinicamente importanti.

Lo ZIKV può essere quantificato utilizzando l'FFA, come illustrato schematicamente nella Figura 3. Per la piastra a 24 pozzetti, le cellule Vero infette sono state fissate a 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore dopo l'infezione. I risultati hanno mostrato che le cellule sono rimaste intatte (non è stato osservato alcun distacco cellulare) dopo 96 ore (4 giorni) dall'infezione (Figura 4 e Figura 8A-E supplementare). La comparsa di focolai vi...

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Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Il presente protocollo descrive la propagazione del virus Zika (ZIKV) in cellule renali di scimmia verde africana Vero e la quantificazione di ZIKV utilizzando metodi di immunorilevazione colorimetrica basati su cellule nei formati a 24 e 96 pozzetti (high throughput).

Propagazione del virus e quantificazione colorimetrica cellulare

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Questo protocollo consente di identificare e quantificare il virus Zika senza fare affidamento sull'effetto citopatico. Dipende dal riconoscimento anticorpale della componente virale. L'uso di anticorpi virus-specifici può aiutare a identificare diversi sierotipi virali in popolazioni miste.Questo metodo presenta vantaggi rispetto ai classici saggi per la formazione della placca. È più veloce e abilitato per applicazioni ad alta produttività quando si applica con un sistema di imaging automatizzato per un rapido conteggio delle cellule. Il protocollo proposto è altamente adattabile.Con opportune modifiche, il protocollo proposto può essere applicato a vari tipi di cellule e bersagli virali. Inizia coltivando le cellule Vero in un pallone di coltura cellulare di 75 quadrati = centimetri che contiene 12 millilitri di DMEM integrato con il 10% di FBS e due millimoli di L-glutammina. Porre il matraccio in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.Per infettare il monostrato cellulare, utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per rimuovere il terreno di crescita dal pallone di coltura cellulare. Utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, sciacquare il pallone con tre millilitri di DPBS due volte. Successivamente, aggiungere due millilitri di DMEM senza siero e 20 microlitri di inoculo del virus Zika nel pallone di coltura cellulare.Lasciare incubare il matraccio a temperatura ambiente per un'ora con un leggero dondolio per favorire l'adsorbimento del virus. Al termine dell'incubazione, utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri, rimuovere con cautela ed eliminare l'inoculo virale diluito dal pallone di coltura cellulare. Sciacquare due volte il pallone di coltura cellulare con tre millilitri di DPBS.Quindi, aggiungere 12 millilitri di terreno di mantenimento nel pallone di coltura cellulare per mantenere le cellule infette. Incubare le cellule Vero infette per tre giorni in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Dopo tre giorni di incubazione, utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per raccogliere il surnatante della coltura cellulare contenente il virus Zika in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.Per la quantificazione del virus, seminare le cellule Vero in piastre designate e lasciarle crescere durante la notte a 37 gradi Celsius con un'atmosfera di anidride carbonica al 5%. Preparare sei provette sterili per microcentrifuga da 1,5 millilitri per ciascuna piastra per eseguire una diluizione seriale dieci volte, inclusa una provetta aggiuntiva per un controllo negativo. Per una configurazione a piastra a 24 pozzetti, aggiungere 450 microlitri di DMEM senza siero a tutte e sei le provette per microcentrifuga.Per una piastra a 96 pozzetti, erogare 135 microlitri di DMEM senza siero in sei provette aggiuntive. Per eseguire la diluizione seriale per l'esperimento della piastra a 24 pozzetti, aggiungere 50 microlitri della scorta di virus Zika nella provetta da 10 a meno una contenente 450 microlitri di DMEM privo di siero. Per l'esperimento della piastra a 96 pozzetti, aggiungere 15 microlitri di riserva di virus Zika nella provetta da 10 a meno una contenente 135 microlitri di DMEM senza siero.Vorticare ogni provetta per miscelare accuratamente il virus e il terreno, garantendo una distribuzione uniforme delle particelle virali all'interno della diluizione. Utilizzando un puntale di pipetta nuovo, risospendere la provetta da 10 a meno uno e trasferire 50 e 15 microlitri di virus Zika diluito nella provetta da 10 a meno due come seconda diluizione di dieci volte per le piastre da 24 e 96 pozzetti, rispettivamente. Rimuovere ed eliminare il terreno di condizione per ciascun pozzetto della piastra appropriata.Risciacquare ogni pozzetto con DPBS due volte per rimuovere eventuali residui. Partendo dalla diluizione più alta, aggiungere l'inoculo virale diluito in serie nei pozzetti, lavorando fino alla diluizione più bassa. Dopo un'ora di incubazione, rimuovere ed eliminare la sospensione virale dai pozzetti, iniziando dalla concentrazione più bassa a quella più alta.Lavare due volte le cellule infette con DPBS per rimuovere eventuali tracce di sospensione virale. Sovrapporre il pozzetto con DMEM e carbossimetilcellulosa a bassa viscosità all'1,5%. Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Dopo l'incubazione, rimuovere ed eliminare il terreno di sovrapposizione e lavare le cellule tre volte con PBS. Per la piastra a 96 pozzetti, utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ed eliminare il mezzo di sovrapposizione e lavare le cellule tre volte con 60 microlitri di PBS per pozzetto. Aggiungere il 4% di paraformaldeide per fissare le cellule e incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti.Dopo 20 minuti, scartare la paraformaldeide e lavare le cellule tre volte con PBS. Successivamente, aggiungere 3, 3'substrato di diaminobenzidina perossidasi e incubare la piastra per 30 minuti al buio. Dopo 30 minuti, interrompere la reazione lavando i pozzetti con acqua.Asciugare le piastre all'aria per una notte e procedere all'enumerazione dei focolai. Contare i fuochi per ogni replica della diluizione selezionata e calcolare il numero medio di fuochi per ciascuno. Le cellule Vero infette sono state fissate in diversi punti temporali dopo l'infezione.Per la piastra a 2 pozzetti, la prima comparsa di focolai virali è stata osservata 48 ore dopo l'infezione, sebbene la dimensione dei focolai fosse troppo piccola per essere contata con precisione. Dopo 96 ore dall'infezione, non c'erano segni di distacco cellulare. A 60 ore dall'infezione, la dimensione dei focolai era aumentata a un livello ottimale per il conteggio.Successivamente, con il passare del tempo, i focolai sono diventati più grandi e hanno iniziato a fondersi o sovrapporsi l'uno all'altro in intensità, formando cluster che sono cresciuti nel tempo. Pertanto, i focolai formatisi 60 ore dopo l'infezione sono stati scelti per determinare il titolo del virus Zika in una piastra a 24 pozzetti. Per la piastra a 96 pozzetti, le cellule sono rimaste intatte dopo 72 ore dall'infezione.La comparsa di focolai virali è stata osservata per la prima volta 24 ore dopo l'infezione. Tuttavia, fino a 36 ore dopo l'infezione, le dimensioni dei focolai erano troppo piccole. La dimensione ottimale dei focolai è stata raggiunta a 48 ore dopo l'infezione.In questi ultimi punti sono stati osservati focolai sovrapposti o fusi e il numero di fuochi sovrapposti è aumentato nel tempo. I focolai si sono formati 48 ore dopo che l'infezione è stata scelta per determinare il titolo virale degli isolati del virus Zika. Aggiungere delicatamente DPBS lungo il lato di ciascun pozzetto e far oscillare le piastre avanti e indietro da una a tre volte per rimuovere i detriti cellulari e i terreni in eccesso.Questa tecnica sarà di grande beneficio per i ricercatori nella ricerca su Zika e può anche essere ampiamente adattata per quantificare altri virus clinicamente importanti, rendendola uno strumento prezioso per la sorveglianza e la diagnosi dei virus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per l&#39;influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

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Propagazione di<em&gt; Virus-01 Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

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Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

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The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...