Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
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이 연구는 장기 연구 보조금 제도(LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018)와 고등 기관 우수 센터(HICoE) 프로그램(MO002-2019)에 대한 자금 지원에 따라 말레이시아 고등 교육부의 지원을 받았습니다. 초점 형성 분석을 위한 염색 워크플로우를 보여주는 이 연구의 그림 3은 BioRender.com(2022)의 "DAB Immunohistochemistry"에서 채택한 것입니다. https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry 에서 가져옴.

1. 바이러스 전파
<ol><li>세포 준비<ol><li>10% 소 태아 혈청(FBS) 및 2mM L-글루타민이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM) 12mL가 포함된 75cm2 세포 배양 플라스크에서 Vero 세포를 성장시킵니다( 재료 표 참조). 5 % CO2 로 37 ° C의 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.</li>
		<li>현미경으로 세포를 모니터링하십시오. 세포가 70%-90% 밀도에 도달하면 사용할 ...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

바이러스 역가를 결정하기 위한 몇 가지 분석법이 있습니다. PFA는 FFA와 유사한 바이러스 정량 프로토콜을 가지고 있으며, 바이러스 접종물을 희석하여 개별 플라크 또는 병소를 구별할 수 있습니다. 염색 후, 각 플라크 또는 병소는 접종물(19) 내의 단일 감염 입자를 나타낸다. PFA는 세포 용해 또는 사멸로 인한 플라크 형성을 시각화하기 위해 크리스탈 바이올렛으로 염색됩니다. ...

지카 바이러스(ZIKV) 감염은 모기 매개 바이러스성 질병으로 부상하고 있습니다. ZIKV의 첫 번째 고립은 1947년 우간다에서 이루어졌다 1,2; 1947년부터 2007년까지는 임상 증상이 가장 흔하게 무증상이고 자기 제한적인 열성 질환을 특징으로 하기 때문에 방치되었습니다. 2007년 지카 바이러스는 얍 제도에서 시작되었고3,4 2013년부터 2014년까지 태평양 지역(프랑스령 폴리네시아, 이스터 섬, 쿡 제도, 뉴칼레도니아)에서 더 큰 전염병이 발생했다 5,6,7,8 성인에서 처음으로 심각한 신경학적 합병증인 길랭-바레 증후군(GBS)이 보고되었다 9. 2015년과 2016년 사이에, 2013년 브라질에서 ZIKV의 아시아 유전자형이 출현한 후 처음으로 광범위한 ZIKV 전염병이 아메리카 대륙을 휩쓸었다10. 이 발병 기간 동안 440,000건에서 130만 건의 소두증 및 기타 신경학적 장애가 신생아에게 보고되었다11. 현재 ZIKV 감염에 대한 특별한 치료법은 없습니다. 따라서 특히 임신 중 감염을 예방할 수 있는 ZIKV 백신에 대한 의학적 필요성이 시급합니다.
바이러스 정량화는 샘플에 존재하는 바이러스의 수를 결정하는 프로세스입니다. 그것은 연구에서 중요한 역할을 하며 학술 실험실에는 의학 및 생명 과학과 같은 많은 분야가 포함됩니다. 이 공정은 바이러스 백신, 재조합 단백질, 바이러스 항원 또는 항바이러스제의 생산과 같은 상업 부문에서도 중요합니다. 바이러스 정량화를 위해 많은 방법 또는 분석법을 사용할 수 있다12. 방법 또는 분석법의 선택은 일반적으로 바이러스 특성, 원하는 정확도 수준, 실험 또는 연구의 특성에 따라 달라집니다. 일반적으로, 바이러스를 정량화하는 방법은 두 가지 범주로 나눌 수 있다: 바이러스 핵산(DNA 또는 RNA)의 존재를 검출하는 분자 분석과 시험관 내에서 바이러스 감염성을 측정하는 분석법 12. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR, DNA용) 또는 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR, RNA용)13 및 디지털 액적 PCR(14)은 주어진 샘플에서 바이러스 핵산을 정량화하는 데 사용되는 일반적인 분자 기법의 예이다(15). 그러나, 이러한 고감도 분자 기술은 생존 가능한 바이러스와 생존 불가능한 바이러스를 구별할 수 없다15. 따라서 세포에 대한 바이러스 감염성과 같은 생물학적 특징에 대한 정보가 필요한 연구는 위에서 언급한 분자 기술을 사용하여 완료할 수 없습니다. 생존 가능한 바이러스의 존재를 측정하고 결정할 수 있는 분석이 필요합니다. 바이러스 감염도를 측정하는 분석법에는 플라크 형성 분석법(PFA), 50% 조직 배양 감염선량(TCID50), 형광 초점 분석법 및 투과 전자 현미경(TEM)이 포함됩니다12.
1952년 Renato Dulbecco가 개발한 PFA는 ZIKV16을 포함하여 바이러스 적정에 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나입니다. 감염성 용해 바이러스에 대한 바이러스 농도를 직접 측정하는 데 사용됩니다. 이 방법은 바이러스 감염 후 접종된 세포 단층에서 세포병증 효과(CPE, 세포 사멸 영역 또는 플라크, 감염되지 않은 세포로 둘러싸인 감염 영역)를 생성하는 용해 바이러스의 능력을 기반으로 합니다. 그러나 분석에는 유용성에 영향을 미치는 몇 가지 단점이 있습니다. 분석은 시간이 많이 걸리고(바이러스에 따라 약 7-10일 소요), CPE에 의존하며 오류가 발생하기 쉽습니다. 본 연구에서는 24웰 플레이트 및 96웰 플레이트 형식에서 ZIKV를 검출하고 정량화하기 위한 면역 비색 기법인 초점 형성 분석(FFA)을 보고합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

지카 바이러스(ZIKV)는 플라비바이러스(Flavivirus) 속에 속하는 모기 매개 바이러스입니다. ZIKV 감염은 선천성 뇌 이상 및 성인의 길랭-바레 증후군과 관련이 있습니다. 질병 기전을 이해하기 위한 ZIKV에 대한 연구는 백신 및 치료제 개발을 촉진하는 데 중요합니다. 바이러스를 정량화하는 방법은 바이러스학 분야에서 중요하고 기본적입니다. 초점 형성 분석(FFA)은 항체로 바이러스 항원을 검출하고 과산화효소 면역염색 기술을 사용하여 세포의 감염 병소를 식별하는 바이러스 정량 분석법입니다. 현재 연구에서는 24-well 및 96-well(고처리량) 형식을 모두 사용하는 바이러스 전파 및 정량화 프로토콜을 설명합니다. 다른 유사한 연구와 비교했을 때, 이 프로토콜은 다른 바이러스에 대한 이 분석법의 사용을 확장하기 위한 가이드 역할을 할 수 있는 초점 크기 최적화를 추가로 설명했습니다. 첫째, ZIKV 증식은 Vero 세포에서 3일 동안 수행됩니다. ZIKV를 함유하는 배양 상층액은 FFA를 사용하여 수거하고 정량화합니다. 간단히 말해서, 바이러스 배양을 Vero 세포에 접종하고 2-3일 동안 배양합니다. 그런 다음 병소 형성은 세포 고정, 투과화, 차단, 항체 결합 및 과산화효소 기질을 사용한 배양을 포함한 최적화된 염색 공정 후에 결정됩니다. 염색된 바이러스 병소는 실체 현미경(24-웰 형식의 수동 계수) 또는 소프트웨어 분석기(96-웰 형식의 자동 계수)를 사용하여 시각화됩니다. FFA는 재현 가능하고 비교적 빠른 결과(3-4일)를 제공하며 플라크를 형성하지 않는 바이러스를 포함한 다양한 바이러스에 사용하기에 적합합니다. 결과적으로 이 프로토콜은 ZIKV 감염 연구에 유용하며 다른 임상적으로 중요한 바이러스를 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

ZIKV는 그림 3에 개략적으로 요약된 것처럼 FFA를 사용하여 정량화할 수 있습니다. 24웰 플레이트의 경우, 감염된 Vero 세포는 감염 후 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 및 96시간에 고정되었습니다. 그 결과, 감염 후 96시간(4일) 후에도 세포가 온전한 상태로 유지됨(세포 분리가 관찰되지 않음)하는 것으로 나타났습니다(그림 4 및 보충 그림 8A-E). 바...

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Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

본 프로토콜은 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 지카 바이러스(ZIKV)의 증식과 24웰 및 96웰(고처리량) 형식의 세포 기반 비색 면역검출 방법을 사용한 ZIKV의 정량화에 대해 설명합니다.

바이러스 전파 및 세포 기반 비색 정량화

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

이 프로토콜을 사용하면 세포병증 효과에 의존하지 않고 지카 바이러스를 식별하고 정량화할 수 있습니다. 바이러스 성분의 항체 인식에 달려 있습니다. 바이러스 특이적 항체를 사용하면 혼합된 집단에서 다양한 바이러스 혈청형을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 방법은 기존의 플라크 형성 분석에 비해 장점이 있습니다. 빠른 세포 계수를 위해 자동 이미징 시스템과 함께 적용할 때 더 빠르고 처리량이 많은 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 제안된 프로토콜은 적응력이 뛰어납니다.적절한 수정을 통해 제안된 프로토콜은 다양한 세포 유형 및 바이러스 표적에 적용될 수 있습니다. 10% FBS와 2밀리몰의 L-글루타민이 보충된 12밀리리터의 DMEM이 포함된 75제곱=센티미터 세포 배양 플라스크에서 Vero 세포를 성장시키는 것으로 시작합니다. 플라스크를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.세포 단층을 감염시키려면 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 성장 배지를 제거합니다. 5밀리리터의 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크를 3밀리리터의 DPBS로 두 번 헹굽니다. 다음으로, 무혈청 DMEM 2mL와 Zika 바이러스 접종물 20mL를 세포 배양 플라스크에 넣습니다.플라스크를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 바이러스 흡착을 촉진합니다. 배양이 끝나면 5밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 배양 플라스크에서 희석된 바이러스 접종물을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 세포 배양 플라스크를 3mL의 DPBS로 두 번 헹굽니다.그런 다음 세포 배양 플라스크에 12mL의 유지 배지를 추가하여 감염된 세포를 유지합니다. 감염된 Vero 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 세포 배양 인큐베이터에서 3일 동안 배양합니다. 3일간의 배양 후 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 지카 바이러스가 포함된 세포 배양 상층액을 50밀리리터 원심분리 튜브에 수확합니다.바이러스 정량을 위해 Vero 세포를 지정된 접시에 파종하고 5% 이산화탄소 대기에서 섭씨 37도에서 밤새 자라도록 합니다. 각 플레이트에 대해 6개의 멸균 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하여 음성 대조군을 위한 추가 튜브를 포함하여 10배 연속 희석을 수행합니다. 24웰 플레이트 설정의 경우 6개의 마이크로 원심분리기 튜브 모두에 450마이크로리터의 무혈청 DMEM을 추가합니다.96웰 플레이트 설정의 경우 135마이크로리터의 무혈청 DMEM을 6개의 추가 튜브에 분주합니다. 24웰 플레이트 실험에 대한 연속 희석을 수행하려면 50마이크로리터의 지카 바이러스 스톡을 450마이크로리터의 무혈청 DMEM이 들어 있는 10-마이너스 튜브에 추가합니다. 96웰 플레이트 실험의 경우, 135마이크로리터의 무혈청 DMEM이 들어 있는 튜브 1개에 15마이크로리터의 지카 바이러스 스톡을 추가합니다.각 튜브를 소용돌이쳐 바이러스와 배지를 완전히 혼합하여 희석 내에서 바이러스 입자가 고르게 분포되도록 합니다. 새 피펫 팁을 사용하여 10-마이너스 1개의 튜브를 재현탁하고 50-15마이크로리터의 희석된 지카 바이러스를 10-마이너스 2개의 튜브에 각각 24웰 및 96웰 플레이트에 대한 두 번째 10배 희석액으로 옮깁니다. 적절한 플레이트의 각 웰에 대한 상태 배지를 제거하고 폐기하십시오.DPBS로 각각을 두 번 잘 헹구어 잔여물을 제거합니다. 가장 높은 희석액부터 시작하여 연속적으로 희석된 바이러스 접종물을 웰에 추가하여 가장 낮은 희석액을 향해 작업합니다. 1시간 배양 후 가장 낮은 농도부터 가장 높은 농도까지 웰에서 바이러스 현탁액을 제거하고 폐기합니다.감염된 세포를 DPBS로 두 번 씻어 바이러스 현탁액의 흔적을 제거합니다. DMEM과 1.5% 저점도 카르복시메틸셀룰로오스로 웰을 오버레이합니다. 이산화탄소 5%가 있는 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.배양 후 오버레이 배지를 제거하고 폐기하고 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 96웰 플레이트의 경우 멀티채널 피펫을 사용하여 오버레이 배지를 제거 및 폐기하고 웰당 60마이크로리터의 PBS로 셀을 세 번 세척합니다. 4%의 파라포름알데히드를 첨가하여 세포를 고정하고 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.20분 후 파라포름알데히드를 버리고 PBS로 세포를 세 번 씻습니다. 다음으로, 3, 3'디아미노벤지딘 퍼옥시다제 기질을 첨가하고 어두운 곳에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 30 분 후 우물을 물로 씻어 반응을 중지하십시오.플레이트를 밤새 자연 건조시키고 초점 계수를 진행합니다. 선택한 희석액의 각 반복실험에 대한 병아리를 계산하고 각각에 대한 평균 병소 수를 계산합니다. 감염된 Vero 세포는 감염 후 다른 시점에서 고정되었습니다.2-웰 플레이트의 경우, 바이러스 병소의 첫 출현은 감염 후 48시간 후에 관찰되었지만, 병소 크기가 너무 작아서 정확하게 계산할 수 없었습니다. 감염 후 96시간이 지나도 세포 분리의 징후는 없었다. 감염 후 60시간이 지났을 때, 병소 크기는 계수를 위한 최적의 수준으로 증가했습니다.그 후, 시간이 지남에 따라 초점이 커지고 강도가 서로 합쳐지거나 겹치기 시작하여 시간이 지남에 따라 성장하는 클러스터를 형성했습니다. 따라서 감염 후 60시간 후에 형성된 병소를 선택하여 24웰 플레이트에서 지카 바이러스 역가를 측정했습니다. 96웰 플레이트의 경우, 감염 후 72시간 후에도 세포가 온전하게 유지되었습니다.바이러스 병소의 출현은 감염 후 24시간 후에 처음 관찰되었습니다. 그러나 감염 후 최대 36시간까지는 병소 크기가 너무 작았습니다. 최적의 병소 크기는 감염 후 48시간에 달성되었습니다.후자의 시점에서는 겹치거나 병합된 초점이 관찰되었고, 겹쳐진 초점의 수는 시간이 지남에 따라 증가했다. 감염 후 48시간 후에 형성된 병소는 지카 바이러스 분리체의 바이러스 역가를 결정하기 위해 선택되었습니다. 각 웰의 측면에 DPBS를 부드럽게 추가하고 플레이트를 앞뒤로 1-3회 흔들어 세포 파편과 과도한 매체를 제거합니다.이 기술은 지카 연구 연구자들에게 큰 도움이 될 것이며, 임상적으로 중요한 다른 바이러스를 정량화하는 데에도 광범위하게 적용될 수 있어 바이러스 감시 및 진단에 유용한 도구가 될 것입니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

연구

면역학 및 감염병학

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

의 전파<em&gt; Homalodisca의 coagulata 바이러스-01</em&gt;를 통해<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; 세포 배양

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

인간 백신 닭 계란에 인플루엔자 바이러스 전파

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

전체 혈액 샘플에서 바이러스의 검출, 안전, 신속 하 고 간단한 수동 침대 핵 산 추출

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...