Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Denne forskningen mottok støtte fra departementet for høyere utdanning Malaysia under Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN fase 1: LRGS MRUN / F1/01/2018) og finansiering for Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) -programmet (MO002-2019). Figur 3 i denne studien som viser arbeidsflyten for farging for focidannende analyse er tilpasset fra "DAB Immunohistochemistry" av BioRender.com (2022). Hentet fra https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. Virus forplantning
<ol><li>Cell forberedelse<ol><li>Dyrk Vero-celler i en 75 cm2 cellekulturflaske inneholdende 12 ml Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplert med 10% føtal bovint serum (FBS) og 2 mM L-glutamin (se materialfortegnelse). Inkuber cellene i en cellekulturinkubator ved 37 °C med 5% CO2.</li>
		<li>Overvåke cellene under et mikroskop; når cellene når 70% -90% sammenløp, er de klare til bruk (figur 1A) ...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

Det er flere analyser for å bestemme virustiter; PFA har en lignende viruskvantifiseringsprotokoll som FFA, der virusinokulumet fortynnes for å tillate individuelle plakk eller foci å skilles. Etter farging indikerer hver plakk eller foci en enkelt smittsom partikkel i inokulum19. PFA er farget med krystallfiolett for å visualisere plakkdannelse forårsaket av cellelyse eller død. Derfor er PFA mer tidkrevende, da det krever lengre tid for viruset å forårsake CPE, og det er bare begrenset t...

Zikavirus (ZIKV) infeksjon er en fremvoksende myggbåren virussykdom. Den første isolasjonen av ZIKV var i Uganda i 1947 1,2; Den forble neglisjert fra 1947 til 2007, da de kliniske symptomene oftest er asymptomatiske og preget av selvbegrensende febersykdom. I 2007 begynte Zika-epidemien på Yap-øyene 3,4, etterfulgt av større epidemier i Stillehavsregionene (Fransk Polynesia, Påskeøya, Cookøyene og Ny-Caledonia) fra 2013 til 2014 5,6,7,8, hvor den alvorlige nevrologiske komplikasjonen Guillain-Barré syndrom (GBS) ble rapportert hos voksne for første gang9. I løpet av 2015 og 2016 feide den første utbredte ZIKV-epidemien over Amerika etter fremveksten av den asiatiske genotypen av ZIKV i Brasil allerede i 201310. Under dette utbruddet ble det rapportert 440 000 til 1,3 millioner tilfeller av mikrocefali og andre nevrologiske lidelser hos nyfødte barn11. Det er for tiden ingen spesifikk kur eller behandling for ZIKV-infeksjon; Derfor er det et presserende medisinsk behov for ZIKV-vaksiner som kan forhindre infeksjoner, spesielt under graviditet.
Viruskvantifisering er en prosess for å bestemme antall virus som er tilstede i en prøve. Det spiller en viktig rolle i forskning, og akademiske laboratorier involverer mange felt, for eksempel medisin og biovitenskap. Denne prosessen er også viktig i kommersielle sektorer, for eksempel produksjon av virale vaksiner, rekombinante proteiner, virale antigener eller antivirale midler. Mange metoder eller analyser kan brukes til viruskvantifisering12. Valg av metoder eller analyser avhenger normalt av virusets egenskaper, ønsket nøyaktighetsnivå og arten av eksperimentet eller forskningen. Generelt kan metoder for kvantifisering av virus deles inn i to kategorier: molekylære analyser som oppdager tilstedeværelsen av viral nukleinsyre (DNA eller RNA) og analyser som måler virussmittsomhet in vitro12. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR, for DNA) eller kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR, for RNA)13 og digital dråpe PCR14 er eksempler på vanlige molekylære teknikker som brukes til å kvantifisere virusnukleinsyren i en gitt prøve15. Imidlertid kan disse svært følsomme molekylære teknikkene ikke skille mellom levedyktige og ikke-levedyktige virus15. Derfor kan forskning som krever informasjon om biologiske egenskaper, som virussmittsomhet på celler, ikke fullføres ved hjelp av ovennevnte molekylære teknikker; Analyser som kan måle og bestemme tilstedeværelsen av levedyktige virus er nødvendig. Analyser som måler virussmittsomhet inkluderer plakkdannende analyse (PFA), 50% vevskultur infeksiøs dose (TCID50), fluorescerende fokusanalyse og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) 12.
PFA, utviklet av Renato Dulbecco i 1952, er en av de mest brukte metodene for virustitrering, inkludert for ZIKV16. Det brukes til direkte å bestemme virale konsentrasjoner for smittsomme lytiske virioner. Metoden er basert på et lytisk viruss evne til å produsere cytopatiske effekter (CPE, soner av celledød eller plakk, et infeksjonsområde omgitt av uinfiserte celler) i et inokulert cellemonolag etter virusinfeksjon. Det er imidlertid flere ulemper med analysen som påvirker verktøyet. Analysen er tidkrevende (tar omtrent 7-10 dager, avhengig av virus), CPE-avhengig og utsatt for feil. I denne studien rapporterer vi en immunokolorimetrisk teknikk, fokusdannende analyse (FFA), for å oppdage og kvantifisere ZIKV i 24-brønns plate- og 96-brønnplateformater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

Zikavirus (ZIKV) er et myggbårent virus som tilhører slekten Flavivirus. ZIKV-infeksjon har vært assosiert med medfødte hjerneavvik og potensielt Guillain-Barré syndrom hos voksne. Forskning på ZIKV for å forstå sykdomsmekanismene er viktig for å legge til rette for vaksine- og behandlingsutvikling. Metoden for å kvantifisere virus er avgjørende og grunnleggende innen virologi. Fokusdannende analyse (FFA) er en viruskvantifiseringsanalyse som oppdager virusantigenet med antistoffer og identifiserer infeksjonsfokuset til celler ved hjelp av peroksidase-immunfargingsteknikken. Den nåværende studien beskriver virusutbredelsen og kvantifiseringsprotokollen ved bruk av både 24-brønn og 96-brønn (høy gjennomstrømning) formater. Sammenlignet med andre lignende studier har denne protokollen videre beskrevet optimalisering av foci-størrelse, som kan tjene som en veiledning for å utvide bruken av denne analysen for andre virus. For det første utføres ZIKV-forplantning i Vero-celler i 3 dager. Dyrkningssupernatanten som inneholder ZIKV høstes og kvantifiseres ved hjelp av FFA. Kort fortalt blir viruskulturen inokulert på Vero-celler og inkubert i 2-3 dager. Foci-dannelse bestemmes deretter etter optimaliserte fargeprosesser, inkludert cellefiksering, permeabilisering, blokkering, antistoffbinding og inkubasjon med peroksidasesubstrat. De fargede virusfociene visualiseres ved hjelp av et stereomikroskop (manuell telling i 24-brønnformat) eller programvareanalysator (automatisert telling i 96-brønnformat). FFA gir reproduserbare, relativt raske resultater (3-4 dager) og er egnet til bruk for forskjellige virus, inkludert ikke-plakkdannende virus. Deretter er denne protokollen nyttig for studiet av ZIKV-infeksjon og kan brukes til å oppdage andre klinisk viktige virus.

ZIKV kan kvantifiseres ved hjelp av FFA, som skissert skjematisk i figur 3. For 24-brønnsplaten ble de infiserte Vero-cellene festet til 48 timer, 60 timer, 72 timer, 84 timer og 96 timer etter infeksjon. Resultatene viste at cellene forble intakte (ingen celleavløsning ble observert) etter 96 timer (4 dager) etter infeksjon (figur 4 og tilleggsfigur 8A-E). Forekomsten av virusfoci ble først observert 48 timer (2 dager) etter infeksjon (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Den foreliggende protokollen beskriver forplantningen av Zika-virus (ZIKV) i Vero afrikanske grønne ape nyreceller og kvantifisering av ZIKV ved hjelp av cellebaserte kolorimetriske immunodeteksjonsmetoder i 24-brønn og 96-brønn (høy gjennomstrømning) formater.

Virusforplantning og cellebasert kolorimetrisk kvantifisering

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Denne protokollen gjør det mulig å identifisere og kvantifisere Zika-viruset uten å stole på cytopatisk effekt. Det avhenger av antistoffgjenkjenning av viruskomponent. Bruk av virusspesifikke antistoffer kan bidra til å identifisere forskjellige virusserotyper i blandede populasjoner.Denne metoden har fordeler i forhold til klassiske plakkdannende analyser. Den er raskere og aktivert for applikasjoner med høy gjennomstrømning ved påføring med et automatisert bildesystem for rask celletelling. Den foreslåtte protokollen er svært tilpasningsdyktig.Med passende modifikasjoner kan den foreslåtte protokollen brukes på forskjellige celletyper og virale mål. Start med å dyrke Vero-celler i en 75 kvadrat = centimeter cellekulturflaske som inneholder 12 ml DMEM supplert med 10% FBS og to millimol L-glutamin. Plasser kolben i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.For å infisere cellemonolaget, bruk en 10 milliliter serologisk pipette for å fjerne vekstmediet fra cellekulturkolben. Bruk en fem milliliter serologisk pipette, skyll kolben med tre milliliter DPBS to ganger. Deretter tilsettes to milliliter serumfri DMEM og 20 mikroliter Zika-virusinokulum i cellekulturkolben.La kolben ruge ved romtemperatur i en time med forsiktig gynging for å oppmuntre til virusadsorpsjon. På slutten av inkubasjonen, ved hjelp av en fem milliliter serologisk pipette, fjern og kast forsiktig det fortynnede virusinokulumet fra cellekulturkolben. Skyll cellekulturkolben to ganger med tre milliliter DPBS.Deretter legger du til 12 ml vedlikeholdsmedier i cellekulturkolben for å opprettholde de infiserte cellene. Inkuber de infiserte Vero-cellene i tre dager i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Etter tre dager med inkubasjon, bruk en 10 milliliter serologisk pipette for å høste cellekultursupernatanten som inneholder Zika-viruset i et 50 milliliter sentrifugerør.For viruskvantifisering, frø Vero-celler i utpekte plater og la dem vokse over natten ved 37 grader Celsius med en 5% karbondioksidatmosfære. Forbered seks sterile 1,5 milliliter mikrosentrifugerør for hver plate for å utføre en ti ganger seriell fortynning, inkludert et ekstra rør for negativ kontroll. For et 24-brønns plateoppsett, tilsett 450 mikroliter serumfri DMEM til alle seks mikrosentrifugerør.For et 96-brønns plateoppsett, dispenser 135 mikroliter serumfri DMEM til seks ekstra rør. For å utføre seriell fortynning for 24-brønnsplateeksperimentet, tilsett 50 mikroliter Zika-virusbestanden i 10 til minus ett rør som inneholder 450 mikroliter serumfri DMEM. For 96-brønnplateeksperimentet, tilsett 15 mikroliter Zika-virusbestand i 10 til minus ett rør som inneholder 135 mikroliter serumfri DMEM.Vortex hver tube for å blande viruset og mediet grundig, noe som sikrer en jevn fordeling av viruspartikler i fortynningen. Bruk en ny pipettespiss, resuspender 10 til minus ett rør og overfør 50 og 15 mikroliter fortynnet Zika-virus til 10 til minus to rør som en andre ti ganger fortynning for henholdsvis 24- og 96-brønnplatene. Fjern og kast tilstandsmediet for hver brønn på den aktuelle platen.Skyll hver brønn med DPBS to ganger for å fjerne eventuelle rester. Start med den høyeste fortynningen, tilsett det serielt fortynnede virusinokulumet i brønnene, og arbeid mot den laveste fortynningen. Etter en times inkubasjon, fjern og kast virussuspensjonen fra brønnene, og start med den laveste til høyeste konsentrasjonen.Vask de infiserte cellene med DPBS to ganger for å fjerne spor av virussuspensjon. Legg brønnen med DMEM og 1,5% karboksymetylcellulose med lav viskositet. Inkuber platen i en cellekulturinkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Etter inkubering, fjern og kast overleggsmediet og vask cellene tre ganger med PBS. For 96-brønnsplaten, bruk en flerkanals pipette for å fjerne og kaste overleggsmediet, og vask cellene tre ganger med 60 mikroliter PBS per brønn. Tilsett 4% paraformaldehyd for å fikse cellene og inkuber platen ved romtemperatur i 20 minutter.Etter 20 minutter, kast paraformaldehydet og vask cellene tre ganger med PBS. Deretter tilsettes 3, 3'diaminobenzidinperoksidasesubstrat og inkuberer platen i 30 minutter i mørket. Etter 30 minutter, stopp reaksjonen ved å vaske brønnene med vann.Lufttørk platene over natten og fortsett til foci-oppregning. Telle foci for hver replikat av den valgte fortynningen og beregne gjennomsnittlig antall foci for hver. De infiserte Vero-cellene ble fiksert på forskjellige tidspunkter etter infeksjon.For 2-brønnplaten ble det første utseendet av virusfoci observert 48 timer etter infeksjon, selv om focistørrelsen var for liten til å telle nøyaktig. Etter 96 timer etter infeksjon var det ingen tegn til celleløsrivelse. 60 timer etter infeksjon hadde focistørrelsen økt til et optimalt nivå for telling.Etter hvert som tiden gikk, ble fociene større og begynte å fusjonere eller overlappe hverandre i intensitet, og danne klynger som vokste over tid. Derfor ble foci dannet 60 timer etter infeksjonen valgt for å bestemme Zika-virustiteren i en 24-brønnplate. For 96-brønnsplaten forble cellene intakte etter 72 timer etter infeksjon.Utseendet til virusfoci ble først observert 24 timer etter infeksjon. Imidlertid, opptil 36 timer etter infeksjon, var foci-størrelsen for liten. Den optimale focistørrelsen ble oppnådd 48 timer etter infeksjon.Ved sistnevnte tidspunkt ble det observert overlappede eller sammenslåtte foci, og antallet overlappede foci økte over tid. Foci dannet 48 timer etter at infeksjonen ble valgt for å bestemme virustiter av Zika-virusisolater. Legg forsiktig DPBS ned på siden av hver brønn og rock platene bakover og fremover en til tre ganger for å fjerne cellulært rusk og overflødig media.Denne teknikken vil være til stor nytte for forskere i Zika-forskning, og kan også tilpasses bredt for å kvantifisere andre klinisk viktige virus, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for virusovervåking og diagnose.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Utbredelsen av<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa virus Formering i embryon Chicken Egg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nøytrofile Isolering og analyse for å fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhet for Terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering av effekt og toksisitet av RNA Targeting HIV-1 Produksjon for bruk i Gene eller Medikamentell behandling

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Rask, sikker og enkel manuell sengen nukleinsyre utvinning for påvisning av Virus i hele blodprøver

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifikasjon av koding og ikke-koding RNA klasser uttrykt i svin fullblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kvantifisering av antistoff avhengige forsterkning av Zika viruset i primære menneskelige celler

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolering og kvantifisering av Zika virus fra flere organer i en mus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Test for å evaluere Rabies vaksine styrke

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...