Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Esta investigación recibió el apoyo del Ministerio de Educación Superior de Malasia en el marco del Programa de Becas de Investigación a Largo Plazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) y la financiación del programa del Centro de Excelencia de Instituciones Superiores (HICoE) (MO002-2019). La figura 3 de este estudio, que muestra el flujo de trabajo de tinción para el ensayo de formación de focos, está adaptada de "DAB Immunohistochemistry" de BioRender.com (2022). Recuperado de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. Propagación de virus
<ol><li>Preparación celular<ol><li>Cultivar células Vero en un matraz de cultivo celular de75 cm2 que contenga 12 mL de medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y 2 mM de L-glutamina (ver Tabla de Materiales). Incubar las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.</li>
		<li>Monitorear las células bajo un microscopio; una vez que las células alcanzan el ...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

Existen varios ensayos para determinar el título del virus; la PFA tiene un protocolo de cuantificación del virus similar al de la FFA, en el que el inóculo del virus se diluye para permitir que se distingan placas o focos individuales. Después de la tinción, cada placa o foco indica una sola partícula infecciosa en el inóculo19. El PFA se tiñe con violeta cristalino para visualizar la formación de placa causada por la lisis o muerte celular. Por lo tanto, el PFA requiere más tiempo, ya ...

La infección por el virus del Zika (ZIKV) es una enfermedad viral emergente transmitida por mosquitos. El primer aislamiento del ZIKV fue en Uganda en 1947 1,2; Permaneció desatendida desde 1947 hasta 2007, ya que los síntomas clínicos son más comúnmente asintomáticos y se caracterizan por enfermedad febril autolimitada. En 2007, la epidemia de zika comenzó en las islas Yap 3,4, seguida de epidemias más grandes en las regiones del Pacífico (Polinesia Francesa, Isla de Pascua, Islas Cook y Nueva Caledonia) de 2013 a 2014 5,6,7,8, donde se notificó por primera vez la complicación neurológica grave síndrome de Guillain-Barré (SGB) en adultos 9. Durante 2015 y 2016, la primera epidemia generalizada de ZIKV se extendió por las Américas después de la aparición del genotipo asiático de ZIKV en Brasil en 201310. Durante este brote, se notificaron entre 440.000 y 1,3 millones de casos de microcefalia y otros trastornos neurológicos en recién nacidos11. Actualmente no existe una cura o tratamiento específico para la infección por ZIKV; por lo tanto, existe una necesidad médica urgente de vacunas contra el ZIKV capaces de prevenir infecciones, particularmente durante el embarazo.
La cuantificación de virus es un proceso para determinar el número de virus presentes en una muestra. Desempeña un papel importante en la investigación, y los laboratorios académicos abarcan muchos campos, como la medicina y las ciencias de la vida. Este proceso también es importante en sectores comerciales, como la producción de vacunas virales, proteínas recombinantes, antígenos virales o agentes antivirales. Se pueden utilizar muchos métodos o ensayos para la cuantificación del virus12. La elección de los métodos o ensayos normalmente depende de las características del virus, el nivel de precisión deseado y la naturaleza del experimento o investigación. En general, los métodos de cuantificación de virus se pueden dividir en dos categorías: ensayos moleculares que detectan la presencia de ácido nucleico viral (ADN o ARN) y ensayos que miden la infectividad del virus in vitro12. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR, para el ADN) o la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR, para el ARN)13 y la PCR digital en gotas14 son ejemplos de técnicas moleculares comunes utilizadas para cuantificar el ácido nucleico viral en una muestra determinada15. Sin embargo, estas técnicas moleculares altamente sensibles no pueden diferenciar entre virus viables y no viables15. Por lo tanto, la investigación que requiere información sobre características biológicas, como la infectividad del virus en las células, no puede completarse utilizando las técnicas moleculares antes mencionadas; Se necesitan ensayos que puedan medir y determinar la presencia de virus viables. Los ensayos que miden la infectividad del virus incluyen el ensayo de formación de placa (PFA), la dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50% (TCID50), el ensayo de foco fluorescente y la microscopía electrónica de transmisión (TEM)12.
El PFA, desarrollado por Renato Dulbecco en 1952, es uno de los métodos más utilizados para la titulación de virus, incluido el ZIKV16. Se utiliza para determinar directamente las concentraciones virales de viriones líticos infecciosos. El método se basa en la capacidad de un virus lítico para producir efectos citopáticos (CPEs; zonas de muerte celular o placas, un área de infección rodeada de células no infectadas) en una monocapa celular inoculada después de una infección viral. Sin embargo, existen varios inconvenientes en el ensayo que afectan a su utilidad. El ensayo requiere mucho tiempo (tarda aproximadamente entre 7 y 10 días, dependiendo de los virus), depende de la EPC y es propenso a errores. En el presente estudio, presentamos una técnica inmunocolorimétrica, el ensayo de formación de foco (FFA), para detectar y cuantificar el ZIKV en formatos de placa de 24 pocillos y placa de 96 pocillos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

El virus del Zika (ZIKV) es un virus transmitido por mosquitos que pertenece al género Flavivirus. La infección por ZIKV se ha asociado con anomalías cerebrales congénitas y, potencialmente, con el síndrome de Guillain-Barré en adultos. La investigación sobre el ZIKV para comprender los mecanismos de la enfermedad es importante para facilitar el desarrollo de vacunas y tratamientos. El método de cuantificación de virus es crucial y fundamental en el campo de la virología. El ensayo de formación de foco (FFA) es un ensayo de cuantificación de virus que detecta el antígeno viral con anticuerpos e identifica los focos de infección de las células mediante la técnica de inmunotinción de peroxidasa. El presente estudio describe el protocolo de propagación y cuantificación del virus utilizando formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento). En comparación con otros estudios similares, este protocolo ha descrito además la optimización del tamaño de los focos, lo que puede servir como guía para ampliar el uso de este ensayo para otros virus. En primer lugar, la propagación del ZIKV se realiza en células Vero durante 3 días. El sobrenadante de cultivo que contiene ZIKV se cosecha y cuantifica utilizando el FFA. Brevemente, el cultivo del virus se inocula en células Vero y se incuba durante 2-3 días. La formación de focos se determina después de procesos de tinción optimizados, incluida la fijación celular, la permeabilización, el bloqueo, la unión de anticuerpos y la incubación con sustrato de peroxidasa. Los focos de virus teñidos se visualizan utilizando un microscopio estereoscópico (recuento manual en formato de 24 pocillos) o un analizador de software (recuento automatizado en formato de 96 pocillos). El FFA proporciona resultados reproducibles y relativamente rápidos (3-4 días) y es adecuado para ser utilizado para diferentes virus, incluidos los virus que no forman placa. Posteriormente, este protocolo es útil para el estudio de la infección por ZIKV y podría utilizarse para detectar otros virus clínicamente importantes.

El ZIKV se puede cuantificar utilizando el FFA, como se describe esquemáticamente en la Figura 3. Para la placa de 24 pocillos, las células Vero infectadas se fijaron a las 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h después de la infección. Los resultados mostraron que las células permanecieron intactas (no se observó desprendimiento celular) después de 96 h (4 días) después de la infección (Figura 4 y Figura suplementaria 8A-E). La aparición de f...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

El presente protocolo describe la propagación del virus del Zika (ZIKV) en células de riñón de mono verde africano Vero y la cuantificación del ZIKV utilizando métodos de inmunodetección colorimétrica basados en células en formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento).

Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Este protocolo permite identificar y cuantificar el virus del Zika sin depender del efecto citopático. Depende del reconocimiento de anticuerpos del componente del virus. El uso de anticuerpos específicos del virus puede ayudar a identificar diferentes serotipos de virus en poblaciones mixtas.Este método tiene ventajas sobre los ensayos clásicos de formación de placas. Es más rápido y está habilitado para aplicaciones de alto rendimiento cuando se aplica con un sistema de imágenes automatizado para un recuento rápido de células. El protocolo propuesto es altamente adaptable.Con las modificaciones adecuadas, el protocolo propuesto se puede aplicar a varios tipos de células y dianas virales. Comience cultivando células Vero en un matraz de cultivo celular de 75 cuadrados = centímetros que contiene 12 mililitros de DMEM suplementado con 10% de FBS y dos milimoles de L-glutamina. Coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Para infectar la monocapa celular, utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para eliminar el medio de crecimiento del matraz de cultivo celular. Con una pipeta serológica de cinco mililitros, enjuague el matraz con tres mililitros de DPBS dos veces. A continuación, agregue dos mililitros de DMEM sin suero y 20 microlitros de inóculo del virus del Zika en el matraz de cultivo celular.Deje que el matraz se incube a temperatura ambiente durante una hora con un balanceo suave para estimular la adsorción de virus. Al final de la incubación, utilizando una pipeta serológica de cinco mililitros, retire y deseche cuidadosamente el inóculo del virus diluido del matraz de cultivo celular. Enjuague el matraz de cultivo celular dos veces con tres mililitros de DPBS.A continuación, se añaden 12 mililitros de medios de mantenimiento en el matraz de cultivo celular para mantener las células infectadas. Incubar las células Vero infectadas durante tres días en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de tres días de incubación, use una pipeta serológica de 10 mililitros para recolectar el sobrenadante de cultivo celular que contiene el virus del Zika en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.Para la cuantificación del virus, siembre las células Vero en placas designadas y déjelas crecer durante la noche a 37 grados centígrados con una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Prepare seis tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 mililitros para cada placa para realizar una dilución en serie diez veces, incluido un tubo adicional para un control negativo. Para una configuración de placa de 24 pocillos, agregue 450 microlitros de DMEM sin suero a los seis tubos de microcentrífuga.Para una configuración de placa de 96 pocillos, dispense 135 microlitros de DMEM sin suero a seis tubos adicionales. Para realizar la dilución en serie para el experimento de la placa de 24 pocillos, agregue 50 microlitros de la reserva del virus del Zika en el tubo de 10 a menos uno que contiene 450 microlitros de DMEM sin suero. Para el experimento de la placa de 96 pocillos, agregue 15 microlitros de caldo del virus del Zika en el tubo de 10 a menos un tubo que contenga 135 microlitros de DMEM sin suero.Agite cada tubo para mezclar bien el virus y el medio, asegurando una distribución uniforme de las partículas de virus dentro de la dilución. Con una punta de pipeta nueva, vuelva a suspender el tubo de 10 a menos uno y transfiera 50 y 15 microlitros del virus del Zika diluido al tubo de 10 a menos dos como una segunda dilución de diez veces para las placas de 24 y 96 pocillos, respectivamente. Retire y deseche el medio de condición para cada pocillo de la placa apropiada.Enjuague cada pocillo con DPBS dos veces para eliminar cualquier residuo. Comenzando con la dilución más alta, agregue el inóculo del virus diluido en serie en los pocillos, trabajando hacia la dilución más baja. Después de una hora de incubación, retire y deseche la suspensión del virus de los pocillos, comenzando con la concentración más baja a la más alta.Lave las células infectadas con DPBS dos veces para eliminar cualquier rastro de suspensión del virus. Recubra el pocillo con DMEM y carboximetilcelulosa de baja viscosidad al 1,5%. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.Después de la incubación, retire y deseche el medio de recubrimiento y lave las celdas tres veces con PBS. Para la placa de 96 pocillos, utilice una pipeta multicanal para retirar y desechar el medio de recubrimiento, y lave las células tres veces con 60 microlitros de PBS por pocillo. Agregue un 4% de paraformaldehído para fijar las células e incube la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos.Después de 20 minutos, deseche el paraformaldehído y lave las células tres veces con PBS. A continuación, agregue el sustrato de 3,3'diaminobencidina peroxidasa e incube la placa durante 30 minutos en la oscuridad. Después de 30 minutos, detenga la reacción lavando los pozos con agua.Seque las placas al aire durante la noche y proceda a la enumeración de focos. Cuente los focos para cada réplica de la dilución seleccionada y calcule el número promedio de focos para cada uno. Las células Vero infectadas se fijaron en diferentes momentos después de la infección.Para la placa de 2 pocillos, la primera aparición de focos de virus se observó 48 horas después de la infección, aunque el tamaño de los focos era demasiado pequeño para contarlo con precisión. Después de 96 horas después de la infección, no había signos de desprendimiento celular. A las 60 horas después de la infección, el tamaño de los focos había aumentado a un nivel óptimo para el recuento.Posteriormente, a medida que avanzaba el tiempo, los focos se hicieron más grandes y comenzaron a fusionarse o superponerse entre sí en intensidad, formando grupos que crecieron con el tiempo. Por lo tanto, se eligieron focos formados 60 horas después de la infección para determinar el título del virus del Zika en una placa de 24 pocillos. Para la placa de 96 pocillos, las células permanecieron intactas después de 72 horas después de la infección.La aparición de focos virales se observó por primera vez 24 horas después de la infección. Sin embargo, hasta 36 horas después de la infección, el tamaño de los focos era demasiado pequeño. El tamaño óptimo de los focos se alcanzó a las 48 horas después de la infección.En estos últimos momentos, se observaron focos superpuestos o fusionados, y el número de focos superpuestos aumentó con el tiempo. Los focos se formaron 48 horas después de que se eligió la infección para determinar el título del virus de las cepas aisladas del virus del Zika. Agregue suavemente DPBS por el costado de cada pocillo y mueva las placas hacia atrás y hacia adelante de una a tres veces para eliminar los desechos celulares y el exceso de medios.Esta técnica beneficiará en gran medida a los investigadores en la investigación del zika, y también se puede adaptar ampliamente para cuantificar otros virus clínicamente importantes, lo que la convierte en una herramienta valiosa para la vigilancia y el diagnóstico del virus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX colorimétrico de detección de un microarray de ADN para la influenza

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Investigación

Inmunología e Infección

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagación de<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; A través de<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultivo Celular

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Propagación del virus de la influenza en embrionados de pollo Huevos

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identificación de la codificación y las clases de ARN no codificante expresado en cerdos sangre entera

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Cuantificación de estimulación dependiente de los anticuerpos del Virus Zika en células humanas primarias

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Aislamiento y cuantificación del virus del Zika de múltiples órganos en un ratón

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...