Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Denna forskning fick stöd från Malaysias ministerium för högre utbildning inom ramen för Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) och finansiering för programmet Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). Figur 3 i denna studie som visar arbetsflödet för färgning för den foci bildande analysen är anpassad från "DAB Immunohistochemistry" av BioRender.com (2022). Hämtad från https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

1. Spridning av virus
<ol><li>Förberedelse av celler<ol><li>Odla Vero-celler i en75 cm 2-cells odlingskolv innehållande 12 ml Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) och 2 mM L-glutamin (se materialförteckning). Inkubera cellerna i en cellodlingsinkubator vid 37 °C med 5 % CO2 .</li>
		<li>Övervaka cellerna under ett mikroskop; när cellerna når 70%-90% sammanflöde är de redo att användas (<strong class=...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

Det finns flera analyser för att bestämma virustiter; PFA har ett liknande viruskvantifieringsprotokoll som FFA, där virusinokulet späds ut så att enskilda plack eller härdar kan urskiljas. Efter färgning indikerar varje plack eller fokus en enda infektiös partikel i inokulet19. PFA färgas med kristallviolett för att visualisera plackbildning orsakad av celllys eller död. Därför är PFA mer tidskrävande, eftersom det kräver längre tid för viruset att orsaka CPE, och det är endast...

Zikavirusinfektion (ZIKV) är en växande myggburen virussjukdom. Den första isoleringen av ZIKV skedde i Uganda 1947 1,2; Det förblev försummat från 1947 till 2007, eftersom de kliniska symtomen oftast är asymtomatiska och kännetecknas av självbegränsande febersjukdom. År 2007 började zikaepidemin på Yapöarna 3,4, följt av större epidemier i Stillahavsregionerna (Franska Polynesien, Påskön, Cooköarna och Nya Kaledonien) från 2013 till 2014 5,6,7,8, där den allvarliga neurologiska komplikationen Guillain-Barrés syndrom (GBS) rapporterades hos vuxna för första gången9. Under 2015 och 2016 svepte den första utbredda ZIKV-epidemin över Nord- och Sydamerika efter uppkomsten av den asiatiska genotypen ZIKV i Brasilien så tidigt som 201310. Under detta utbrott rapporterades mellan 440 000 och 1,3 miljoner fall av mikrocefali och andra neurologiska sjukdomar hos nyföddabarn. Det finns för närvarande inget specifikt botemedel eller behandling för ZIKV-infektion. Det finns därför ett akut medicinskt behov av ZIKV-vacciner som kan förebygga infektioner, särskilt under graviditet.
Viruskvantifiering är en process för att bestämma antalet virus som finns i ett prov. Det spelar en viktig roll inom forskningen, och akademiska laboratorier involverar många områden, såsom medicin och biovetenskap. Denna process är också viktig inom kommersiella sektorer, såsom produktion av virala vacciner, rekombinanta proteiner, virala antigener eller antivirala medel. Många metoder eller analyser kan användas för kvantifieringav virus 12. Valet av metoder eller analyser beror normalt på virusets egenskaper, önskad noggrannhetsnivå och typen av experiment eller forskning. I allmänhet kan metoder för att kvantifiera virus delas in i två kategorier: molekylära analyser som detekterar närvaron av viral nukleinsyra (DNA eller RNA) och analyser som mäter virusets infektionsförmåga in vitro12. Kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR, för DNA) eller kvantitativ polymeraskedjereaktion med omvänd transkription (qRT-PCR, för RNA)13 och digital dropp-PCR14 är exempel på vanliga molekylära tekniker som används för att kvantifiera virusnukleinsyran i ett givet prov15. Dessa mycket känsliga molekylära tekniker kan dock inte skilja mellan livskraftiga och icke-livskraftiga virus15. Forskning som kräver information om biologiska egenskaper, t.ex. virusets smittsamhet på celler, kan därför inte slutföras med hjälp av de ovan nämnda molekylära teknikerna. Det behövs analyser som kan mäta och bestämma förekomsten av livskraftiga virus. Analyser som mäter virusets smittsamhet inkluderar plackbildande analys (PFA), 50 % vävnadskulturinfektionsdos (TCID50), fluorescerande fokusanalys och transmissionselektronmikroskopi (TEM)12.
PFA, som utvecklades av Renato Dulbecco 1952, är en av de mest använda metoderna för virustitrering, inklusive för ZIKV16. Det används för att direkt bestämma viruskoncentrationerna för infektiösa lytiska virioner. Metoden bygger på ett lytiskt virus förmåga att producera cytopatiska effekter (CPEs; zoner för celldöd eller plack, ett infektionsområde omgivet av oinfekterade celler) i ett inokulerat cellmonolager efter virusinfektion. Det finns dock flera nackdelar med analysen som påverkar dess användbarhet. Analysen är tidskrävande (tar cirka 7-10 dagar, beroende på virus), CPE-beroende och felbenägen. I den aktuella studien redovisar vi en immunokolorimetrisk teknik, focus forming assay (FFA), för att detektera och kvantifiera ZIKV i 24-brunnars plattformat och 96-håls plattformat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

Zikavirus (ZIKV) är ett myggburet virus som tillhör släktet Flavivirus. ZIKV-infektion har associerats med medfödda hjärnabnormiteter och potentiellt Guillain-Barrés syndrom hos vuxna. Forskning om ZIKV för att förstå sjukdomsmekanismerna är viktig för att underlätta utveckling av vaccin och behandling. Metoden att kvantifiera virus är avgörande och grundläggande inom virologiområdet. Focus forming assay (FFA) är en viruskvantifieringsanalys som detekterar virusantigenet med antikroppar och identifierar infektionshärdarna hos celler med hjälp av peroxidasimmunfärgningstekniken. Den aktuella studien beskriver virusföröknings- och kvantifieringsprotokollet med hjälp av både 24-brunnars och 96-brunnars (hög genomströmning) format. Jämfört med andra liknande studier har detta protokoll ytterligare beskrivit optimering av foci size, vilket kan fungera som en guide för att utöka användningen av denna analys för andra virus. För det första utförs ZIKV-förökning i Vero-celler i 3 dagar. Kultursupernatanten som innehåller ZIKV skördas och kvantifieras med hjälp av FFA. Kortfattat inokuleras viruskulturen på Vero-celler och inkuberas i 2-3 dagar. Foci-bildning bestäms sedan efter optimerade färgningsprocesser, inklusive cellfixering, permeabilisering, blockering, antikroppsbindning och inkubation med peroxidassubstrat. De färgade virusfokusen visualiseras med hjälp av ett stereomikroskop (manuell räkning i 24-hålsformat) eller mjukvaruanalysator (automatiserad räkning i 96-hålsformat). FFA ger reproducerbara, relativt snabba resultat (3-4 dagar) och är lämplig att användas för olika virus, inklusive icke-plackbildande virus. Därefter är detta protokoll användbart för studier av ZIKV-infektion och kan användas för att upptäcka andra kliniskt viktiga virus.

ZIKV kan kvantifieras med hjälp av FFA, som beskrivs schematiskt i figur 3. För 24-hålsplattan fixerades de infekterade Vero-cellerna 48 timmar, 60 timmar, 72 timmar, 84 timmar och 96 timmar efter infektion. Resultaten visade att cellerna förblev intakta (ingen cellavlossning observerades) efter 96 timmar (4 dagar) efter infektion (Figur 4 och Supplement Figur 8A-E). Uppkomsten av virushärdar observerades först 48 timmar (2 dagar) efter in...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Detta protokoll beskriver spridningen av zikavirus (ZIKV) i njurceller från afrikanska gröna apor och kvantifieringen av ZIKV med hjälp av cellbaserade kolorimetriska immundetektionsmetoder i format med 24 brunnar och 96 brunnar (hög genomströmning).

Virusförökning och cellbaserad kolorimetrisk kvantifiering

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Detta protokoll gör det möjligt att identifiera och kvantifiera zikaviruset utan att förlita sig på cytopatisk effekt. Det beror på antikroppsigenkänning av viruskomponenten. Användningen av virusspecifika antikroppar kan hjälpa till att identifiera olika virusserotyper i blandade populationer.Denna metod har fördelar jämfört med klassiska plackbildande analyser. Det är snabbare och aktiverat för applikationer med hög genomströmning när det appliceras med ett automatiserat bildsystem för snabb cellräkning. Det föreslagna protokollet är mycket anpassningsbart.Med lämpliga modifieringar kan det föreslagna protokollet tillämpas på olika celltyper och virala mål. Börja med att odla Vero-celler i en 75-kvadrat = centimeter cellodlingskolv som innehåller 12 milliliter DMEM kompletterat med 10%FBS och två millimol L-glutamin. Placera kolven i en cellodlingsinkubator vid 37 grader Celsius och 5 % koldioxid.För att infektera cellmonoskiktet, använd en 10-milliliters serologisk pipett för att avlägsna odlingsmediet från cellodlingskolven. Använd en fem ml serologisk pipett och skölj kolven med tre milliliter DPBS två gånger. Tillsätt sedan två milliliter serumfri DMEM och 20 mikroliter zikavirusinokulat i cellodlingskolven.Låt kolven inkubera i rumstemperatur i en timme med lätt gungning för att uppmuntra virusadsorption. I slutet av inkubationen avlägsnas försiktigt det utspädda virusinokulatet från cellodlingskolven med hjälp av en serologisk pipett på fem ml. Skölj cellodlingskolven två gånger med tre milliliter DPBS.Tillsätt sedan 12 ml underhållsmedia i cellodlingskolven för att underhålla de infekterade cellerna. Inkubera de infekterade Vero-cellerna i tre dagar i en cellodlingsinkubator vid 37 grader Celsius och 5 % koldioxid. Efter tre dagars inkubation, använd en 10-milliliters serologisk pipett för att skörda cellkultursupernatanten som innehåller zikaviruset i ett 50-milliliters centrifugrör.För viruskvantifiering, plantera Vero-celler i utsedda plattor och låt dem växa över natten vid 37 grader Celsius med en atmosfär på 5 % koldioxid. Förbered sex sterila 1,5 milliliter mikrocentrifugrör för varje platta för att utföra en tiofaldig seriespädning, inklusive ett extra rör för en negativ kontroll. För en 24-brunnars plattuppsättning, tillsätt 450 mikroliter serumfri DMEM till alla sex mikrocentrifugrören.För en 96-håls platta, dispensera 135 mikroliter serumfri DMEM till ytterligare sex rör. För att utföra seriell utspädning för 24-hålsplatteexperimentet, tillsätt 50 mikroliter zikavirusstam i 10 till minus ett rör som innehåller 450 mikroliter serumfritt DMEM. För experimentet med 96-hålsplattor, tillsätt 15 mikroliter zikavirusbuljong i 10 till minus ett rör som innehåller 135 mikroliter serumfritt DMEM.Virvla varje rör för att noggrant blanda viruset och mediet, vilket säkerställer en jämn fördelning av viruspartiklar i utspädningen. Använd en ny pipettspets för att återsuspendera 10 till minus ett rör och överför 50 och 15 mikroliter utspätt zikavirus till 10 till minus två rör som en andra tiofaldig utspädning för 24- respektive 96-hålsplattorna. Ta bort och kassera konditionsmediet för varje brunn på lämplig platta.Skölj varje väl med DPBS två gånger för att ta bort eventuella rester. Börja med den högsta utspädningen och tillsätt det serieutspädda virusinokulatet i brunnarna och arbeta mot den lägsta utspädningen. Efter en timmes inkubation avlägsnas och kasseras virussuspensionen från brunnarna, med början med den lägsta till den högsta koncentrationen.Tvätta de infekterade cellerna med DPBS två gånger för att avlägsna eventuella spår av virussuspension. Täck brunnen med DMEM och 1,5 % karboximetylcellulosa med låg viskositet. Inkubera plattan i en cellodlingsinkubator vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid.Efter inkubationen avlägsnas och kasseras överlagringsmediet och cellerna tvättas tre gånger med PBS. För 96-hålsplattan, använd en flerkanalspipett för att ta bort och kassera överlagringsmediet och tvätta cellerna tre gånger med 60 mikroliter PBS per brunn. Tillsätt 4% paraformaldehyd för att fixera cellerna och inkubera plattan i rumstemperatur i 20 minuter.Efter 20 minuter kasseras paraformaldehyden och cellerna tvättas tre gånger med PBS. Tillsätt sedan 3,3'diaminobenzidinperoxidassubstrat och inkubera plattan i 30 minuter i mörker. Efter 30 minuter stoppar du reaktionen genom att tvätta brunnarna med vatten.Lufttorka plattorna över natten och fortsätt med foci enumeration. Räkna härdarna för varje replikat av den valda utspädningen och beräkna det genomsnittliga antalet brännhärdar för varje replikat. De infekterade Vero-cellerna fixerades vid olika tidpunkter efter infektionen.För 2-hålsplattan observerades det första framträdandet av virushärdar 48 timmar efter infektion, även om foci storleken var för liten för att räkna exakt. Efter 96 timmar efter infektionen fanns det inga tecken på cellavlossning. 60 timmar efter infektionen hade foci ökat till en optimal nivå för räkning.Därefter, allt eftersom tiden gick, blev fokusen större och började smälta samman eller överlappa varandra i intensitet och bildade kluster som växte med tiden. Därför valdes de härdar som bildades 60 timmar efter infektionen för att bestämma zikavirusets titer i en platta med 24 brunnar. För plattan med 96 brunnar förblev cellerna intakta efter 72 timmar efter infektionen.Uppkomsten av virushärdar observerades först 24 timmar efter infektion. Men upp till 36 timmar efter infektionen var foci storleken för liten. Den optimala fokusstorleken uppnåddes 48 timmar efter infektion.Vid de senare tidpunkterna observerades överlappande eller sammanslagna fokus, och antalet överlappande fokusområden ökade med tiden. Brännpunkterna bildades 48 timmar efter att infektionen valts för att bestämma virustitern för zikavirusisolat. Tillsätt försiktigt DPBS längs sidan av varje brunn och gunga plattorna bakåt och framåt en till tre gånger för att ta bort cellulärt skräp och överflödigt media.Denna teknik kommer att vara till stor nytta för forskare inom zikaforskningen, och kan också anpassas brett för att kvantifiera andra kliniskt viktiga virus, vilket gör den till ett värdefullt verktyg för virusövervakning och diagnos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX Kolorimetriska Detection på en DNA microarray för influensa

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Förökning av<em&gt; Homalodisca coagulata virus-01</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa viruspropagering i embryonerade hönsägg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Snabb, säker och enkel manuell sängkanten nukleinsyra extraktion för påvisande av Virus i helblod

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Identifiering av kodning och icke-kodande RNA klasser uttryckta i svin helblod

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Kvantifiering av antikroppsberoende förbättring av zikaviruset i primära mänskliga celler

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Isolering och kvantifiering av zikavirus från flera organ i en mus

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Test för att utvärdera rabiesvaccin potens

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...