Name: virus propagation and cell-based colorimetric quantification
Uploaded: 2023-04-07T14:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Bu araştırma, Malezya Yüksek Öğretim Bakanlığı'ndan Uzun Vadeli Araştırma Hibe Programı (LRGS MRUN Faz 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) kapsamında destek almış ve Yüksek Kurum Mükemmeliyet Merkezi (HICoE) programı (MO002-2019) için fon sağlamıştır. Bu çalışmada odak oluşturma testi için boyamanın iş akışını gösteren Şekil 3, BioRender.com (2022) tarafından "DAB İmmünohistokimya" dan uyarlanmıştır. https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry'dan alındı.

1. Virüs yayılımı
<ol><li>Hücre hazırlığı<ol><li>Vero hücrelerini,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 12 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) içeren 75cm'lik 2 hücre kültürü şişesinde büyütün (bkz. Hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.</li>
		<li>Hücreleri mikroskop altında izleyin; hücreler %70-90 birleşmeye ulaştığında kullanıma hazırdır (<st...

<ol>
	<li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+I.+Isolations+and+serological+specificity.">Zika virus. I. Isolations and serological specificity.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).</li><li>Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus.+II.+Pathogenicity+and+physical+properties.">Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).</li><li>Duffy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+outbreak+on+Yap+Island,+Federated+States+of+Micronesia.">Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).</li><li>Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+emerging+Zika+virus+in+the+Pacific+area.">Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).</li><li>Cao-Lormeau, V. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus,+French+polynesia,+South+pacific,+2013.">Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).</li><li>Dupont-Rouzeyrol, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-infection+with+Zika+and+dengue+viruses+in+2+patients,+New+Caledonia,+2014.">Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014.</a> Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).</li><li>Roth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+outbreaks+of+dengue,+chikungunya+and+Zika+virus+infections-an+unprecedented+epidemic+wave+of+mosquito-borne+viruses+in+the+Pacific+2012-2014.">Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014.</a> Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).</li><li>Tognarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+report+on+the+outbreak+of+Zika+virus+on+Easter+Island,+South+Pacific,+2014.">A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014.</a> Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).</li><li>Oehler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+complicated+by+Guillain-Barre+syndrome-case+report,+French+Polynesia,+December+2013.">Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013.</a> Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barr&#233; syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association">https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association</a> (2015)</li><li>Payne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+study+viruses.">Methods to study viruses.</a> Viruses. , 37-52 (2017).</li><li>Bustin, S. A., Mueller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+reverse+transcription+PCR+(qRT-PCR)+and+its+potential+use+in+clinical+diagnosis.">Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis.</a> Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).</li><li>Sedlak, R. H., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+diagnostics+in+the+era+of+digital+polymerase+chain+reaction.">Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).</li><li>Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+yellow+fever+virus:+a+comparison+of+quantitative+real-time+PCR+and+plaque+assay.">Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay.</a> Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).</li><li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+plaques+in+monolayer+tissue+cultures+by+single+particles+of+an+animal+virus.">Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).</li><li>Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+environment+for+high+density+Vero+cell+culture:+effect+of+dissolved+oxygen+and+nutrient+supply+on+cell+growth+and+changes+in+metabolites.">Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites.</a> Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).</li><li>Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus:+quantification,+propagation,+detection,+and+storage.">Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).</li><li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation,+quantification,+detection,+and+storage+of+West+Nile+virus.">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).</li><li>Bol&#237;var-Marin, S., Bosch, I., Narv&#225;ez, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+the+focus-forming+assay+and+digital+automated+imaging+analysis+for+the+detection+of+dengue+and+Zika+viral+loads+in+cultures+and+acute+disease.">Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease.</a> Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).</li><li>Dangsagul, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+isolation,+propagation,+and+quantification+using+multiple+methods.">Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods.</a> PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3.">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Zika+virus+pathogenesis.">A mouse model of Zika virus pathogenesis.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Miner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+infection+during+pregnancy+in+mice+causes+placental+damage+and+fetal+demise.">Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise.</a> Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).</li><li>Kang, W., Shin, E. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+focus-forming+assay+with+automated+focus+counting+by+image+analysis+for+quantification+of+infectious+hepatitis+C+virions.">Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions.</a> PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).</li><li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+quantification+of+Zika+virus+from+multiple+organs+in+a+mouse.">Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse.</a> Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).</li><li>Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+flaviviruses+by+fluorescent+focus+assay.">Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay.</a> Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).</li><li>Moser, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+adaptation+of+Zika+virus+in+mammalian+and+mosquito+cells.">Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).</li><li>Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+micromethod+for+infectivity+assays+and+neutralization+tests+of+dengue+viruses.">An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses.</a> Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).</li><li>Leiva, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+quantitative+immunofluorescence+assays+to+analyze+the+expression+of+cell+contact+proteins+during+Zika+virus+infections.">Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections.</a> Virus Research. 304, 198544 (2021).</li><li>Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Zika+viral+titer+assay+for+rapid+screening+of+antiviral+drugs.">High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).</li></ol>

Virüs titresini belirlemek için birkaç test vardır; PFA, tek tek plakların veya odakların ayırt edilmesine izin vermek için virüs aşısının seyreltildiği FFA ile benzer bir virüs kantitasyon protokolüne sahiptir. Boyamadan sonra, her plak veya odak, aşılamada19 tek bir enfeksiyöz partikülü gösterir. PFA, hücre lizizi veya ölümünün neden olduğu plak oluşumunu görselleştirmek için kristal viyole ile boyanır. Bu nedenle, PFA, virüsün CPE'lere neden olması için daha...

Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonu, sivrisinek kaynaklı viral bir hastalıktır. ZIKV'nin ilk izolasyonu 1947'de Uganda'daydı 1,2; 1947'den 2007'ye kadar ihmal edildi, çünkü klinik semptomlar en sık asemptomatik ve kendi kendini sınırlayan ateşli hastalık ile karakterizedir. 2007 yılında, Zika salgını Yap adalarındabaşladı 3,4, ardından Pasifik bölgelerinde (Fransız Polinezyası, Paskalya Adası, Cook Adaları ve Yeni Kaledonya) 2013'ten 2014'e kadar daha büyük salgınlar 5,6,7,8, burada ciddi nörolojik komplikasyon Guillain-Barré sendromu (GBS) yetişkinlerde ilk kez bildirildi9. 2015 ve 2016 yıllarında, ilk yaygın ZIKV salgını, 2013 gibi erken bir tarihte Brezilya'da ZIKV'nin Asya genotipinin ortaya çıkmasından sonra Amerika'yı kasıp kavurdu10. Bu salgın sırasında, yeni doğan bebeklerde 440.000 ila 1.3 milyon mikrosefali ve diğer nörolojik bozukluklar bildirilmiştir11. Şu anda ZIKV enfeksiyonu için spesifik bir tedavi veya tedavi yoktur; bu nedenle, özellikle hamilelik sırasında enfeksiyonları önleyebilen ZIKV aşılarına acil bir tıbbi ihtiyaç vardır.
Virüs ölçümü, bir numunede bulunan virüslerin sayısını belirleme işlemidir. Araştırmada önemli bir rol oynar ve akademik laboratuvarlar tıp ve yaşam bilimleri gibi birçok alanı içerir. Bu süreç, viral aşıların, rekombinant proteinlerin, viral antijenlerin veya antiviral ajanların üretimi gibi ticari sektörlerde de önemlidir. Virüs ölçümü için birçok yöntem veya tahlil kullanılabilir12. Yöntemlerin veya tahlillerin seçimi normalde virüs özelliklerine, istenen doğruluk düzeyine ve deney veya araştırmanın doğasına bağlıdır. Genel olarak, virüsleri ölçme yöntemleri iki kategoriye ayrılabilir: viral nükleik asidin (DNA veya RNA) varlığını tespit eden moleküler testler ve in vitro12'de virüs enfektivitesini ölçen testler. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR, DNA için) veya kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR, RNA için)13 ve dijital damlacık PCR14 , belirli bir numunedeki viral nükleik asidi ölçmek için kullanılan yaygın moleküler tekniklerin örnekleridir15. Bununla birlikte, bu son derece hassas moleküler teknikler, canlı ve cansız virüsler arasında ayrım yapamaz15. Bu nedenle, hücreler üzerindeki virüs enfektivitesi gibi biyolojik özellikler hakkında bilgi gerektiren araştırmalar, yukarıda belirtilen moleküler teknikler kullanılarak tamamlanamaz; Canlı virüslerin varlığını ölçebilen ve belirleyebilen tahlillere ihtiyaç vardır. Virüs enfektivitesini ölçen testler arasında plak oluşturma testi (PFA), %50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID50), floresan odak testi ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM)12 bulunur.
1952'de Renato Dulbecco tarafından geliştirilen PFA, ZIKV16 da dahil olmak üzere virüs titrasyonu için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir. Enfeksiyöz litik viryonlar için viral konsantrasyonları doğrudan belirlemek için kullanılır. Yöntem, bir litik virüsün, viral enfeksiyondan sonra aşılanmış bir hücre tek tabakasında sitopatik etkiler (CPE'ler; hücre ölümü veya plaklar, enfekte olmamış hücrelerle çevrili bir enfeksiyon alanı) üretme yeteneğine dayanmaktadır. Bununla birlikte, tahlilin faydasını etkileyen birkaç dezavantajı vardır. Test zaman alıcıdır (virüslere bağlı olarak yaklaşık 7-10 gün sürer), CPE'ye bağımlıdır ve hatalara eğilimlidir. Bu çalışmada, 24 oyuklu plaka ve 96 oyuklu plaka formatlarında ZIKV'yi tespit etmek ve ölçmek için bir immünokolorimetrik teknik olan odak oluşturma testi (FFA) bildirilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Polyethersulfone syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>S6534-FMOSK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Nest</td>
			<td>615601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline (dPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Screw cap tube&#160;</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>SCT-200-SS-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Sterile serological pipettes</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C incubator with 5% CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-18AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile serological pipette</td>
			<td>Labserv</td>
			<td>14955155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>LAB352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 tissue culture flask&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430725U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MAB10216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet, Class II</td>
			<td>Holten</td>
			<td>HB2448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer</td>
			<td>ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)</td>
			<td>CTL-S6UNV12</td>
			<td>Commercial software analyzer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12800-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>SFBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>12-349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Laboroptik LTD</td>
			<td>Neubauer improved</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>TELAVAL 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker</td>
			<td>FINEPCR</td>
			<td>CR300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel micropipette (30 - 300 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (10 - 100 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (100 - 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single channel pipettes (20 - 200 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk</td>
			<td>Sunlac Low Fat</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hypochlorite</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>N/A</td>
			<td>To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS10L21G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero African green monkey kidney cells&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>ECACC 88020401</td>
			<td>Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus propagation and cell-based colorimetric quantification

Zika virüsü (ZIKV), Flavivirus cinsine ait sivrisinek kaynaklı bir virüstür. ZIKV enfeksiyonu, yetişkinlerde konjenital beyin anormallikleri ve potansiyel olarak Guillain-Barré sendromu ile ilişkilendirilmiştir. Hastalık mekanizmalarını anlamak için ZIKV ile ilgili araştırmalar, aşı ve tedavi geliştirmeyi kolaylaştırmak için önemlidir. Virüsleri ölçme yöntemi, viroloji alanında çok önemli ve temeldir. Odak oluşturma testi (FFA), viral antijeni antikorlarla tespit eden ve peroksidaz immün boyama tekniğini kullanarak hücrelerin enfeksiyon odaklarını tanımlayan bir virüs miktar tayini testidir. Mevcut çalışma, hem 24 kuyulu hem de 96 kuyulu (yüksek verimli) formatları kullanarak virüs yayılım ve miktar tayini protokolünü açıklamaktadır. Diğer benzer çalışmalarla karşılaştırıldığında, bu protokol, bu testin diğer virüsler için kullanımını genişletmek için bir kılavuz görevi görebilecek odak boyutu optimizasyonunu daha ayrıntılı olarak tanımlamıştır. İlk olarak, 3 gün boyunca Vero hücrelerinde ZIKV yayılımı gerçekleştirilir. ZIKV içeren kültür süpernatanı, FFA kullanılarak hasat edilir ve miktar tayini yapılır. Kısaca virüs kültürü Vero hücrelerine aşılanır ve 2-3 gün inkübe edilir. Odak oluşumu daha sonra hücre fiksasyonu, geçirgenleştirme, blokaj, antikor bağlanması ve peroksidaz substratı ile inkübasyon dahil olmak üzere optimize edilmiş boyama işlemlerinden sonra belirlenir. Boyanmış virüs odakları, bir stereo mikroskop (24 oyuklu formatta manuel sayım) veya yazılım analizörü (96 oyuklu formatta otomatik sayım) kullanılarak görselleştirilir. FFA, tekrarlanabilir, nispeten hızlı sonuçlar (3-4 gün) sağlar ve plak oluşturmayan virüsler de dahil olmak üzere farklı virüsler için kullanılmaya uygundur. Daha sonra, bu protokol ZIKV enfeksiyonunun incelenmesi için yararlıdır ve klinik olarak önemli diğer virüsleri tespit etmek için kullanılabilir.

ZIKV, Şekil 3'te şematik olarak belirtildiği gibi FFA kullanılarak ölçülebilir. 24 oyuklu plaka için, enfekte Vero hücreleri enfeksiyondan 48 saat, 60 saat, 72 saat, 84 saat ve 96 saat sonra sabitlendi. Sonuçlar, enfeksiyondan 96 saat (4 gün) sonra hücrelerin bozulmadan kaldığını (hücre ayrılması gözlenmedi) gösterdi (Şekil 4 ve Ek Şekil 8A-E). Virüs odaklarının ortaya çıkışı ilk olarak enfeksiyondan 48 saat (2 gü...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification at JoVE.com

Virus Propagation and Cell-Based Colorimetric Quantification

Mevcut protokol, Zika virüsünün (ZIKV) Vero Afrika yeşil maymun böbrek hücrelerinde yayılımını ve 24 oyuklu ve 96 oyuklu (yüksek verimli) formatlarda hücre bazlı kolorimetrik immüno-tespit yöntemleri kullanılarak ZIKV'nin miktar tayinini açıklamaktadır.

Virüs Yayılımı ve Hücre Bazlı Kolorimetrik Miktar Tayini

Zika virus (ZIKV) is a mosquito-borne virus belonging to the genus Flavivirus. ZIKV infection has been associated with congenital brain abnormalities and ...

Bu protokol, sitopatik etkiye dayanmadan Zika virüsünün tanımlanmasını ve ölçülmesini sağlar. Virüs bileşeninin antikor tanımasına bağlıdır. Virüse özgü antikorun kullanımı, karışık popülasyonlarda farklı virüs serotiplerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.Bu yöntemin klasik plak oluşturan tahlillere göre avantajları vardır. Daha hızlıdır ve hızlı hücre sayımı için otomatik bir görüntüleme sistemi ile uygulama yaparken yüksek verimli uygulamalar için etkinleştirilmiştir. Önerilen protokol son derece uyarlanabilir.Uygun modifikasyonlarla, önerilen protokol çeşitli hücre tiplerine ve viral hedeflere uygulanabilir. Vero hücrelerini% 10 FBS ve iki milimol L-glutamin ile desteklenmiş 12 mililitre DMEM içeren 75 kare = santimetrelik bir hücre kültürü şişesinde büyüterek başlayın. Şişeyi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Hücre tek tabakasını enfekte etmek için, büyüme ortamını hücre kültürü şişesinden çıkarmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, şişeyi iki kez üç mililitre DPBS ile durulayın. Daha sonra, hücre kültürü şişesine iki mililitre serumsuz DMEM ve 20 mikrolitre Zika virüsü aşısı ekleyin.Şişe, virüs adsorpsiyonunu teşvik etmek için hafifçe sallayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe etmesine izin verin. İnkübasyonun sonunda, beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, seyreltilmiş virüs inokulumunu hücre kültürü şişesinden dikkatlice çıkarın ve atın. Hücre kültürü şişesini üç mililitre DPBS ile iki kez durulayın.Ardından, enfekte olmuş hücreleri korumak için hücre kültürü şişesine 12 mililitre bakım ortamı ekleyin. Enfekte olmuş Vero hücrelerini 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir hücre kültürü inkübatöründe üç gün boyunca inkübe edin. Üç günlük inkübasyondan sonra, Zika virüsünü içeren hücre kültürü süpernatanını 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne toplamak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.Virüs ölçümü için, Vero hücrelerini belirlenmiş plakalarda tohumlayın ve% 5 karbondioksit atmosferi ile 37 santigrat derecede gece boyunca büyümelerine izin verin. Negatif kontrol için ekstra bir tüp de dahil olmak üzere on kat seri seyreltme gerçekleştirmek için her plaka için altı steril 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. 24 oyuklu bir plaka kurulumu için, altı mikrosantrifüj tüpünün tümüne 450 mikrolitre serumsuz DMEM ekleyin.96 oyuklu bir plaka kurulumu için, altı ek tüpe 135 mikrolitre serumsuz DMEM dağıtın. 24 oyuklu plaka deneyi için seri seyreltme yapmak için, 450 mikrolitre serumsuz DMEM içeren 10 ila eksi bir tüpe 50 mikrolitre Zika virüsü stoğu ekleyin. 96 oyuklu plaka deneyi için, 135 mikrolitre serumsuz DMEM içeren 10 ila eksi bir tüpe 15 mikrolitre Zika virüsü stoğu ekleyin.Virüsü ve ortamı iyice karıştırmak için her bir tüpü vorteksleyin ve seyreltme içinde virüs parçacıklarının eşit dağılımını sağlayın. Yeni bir pipet ucu kullanarak, 10 ila eksi bir tüpü yeniden süspanse edin ve 50 ve 15 mikrolitre seyreltilmiş Zika virüsünü, sırasıyla 24 ve 96 oyuklu plakalar için ikinci bir on kat seyreltme olarak 10 ila eksi iki tüpe aktarın. Uygun plakanın her bir oyuğu için koşul ortamını çıkarın ve atın.Kalıntıları gidermek için her bir kuyuyu DPBS ile iki kez durulayın. En yüksek seyreltmeden başlayarak, seri olarak seyreltilmiş virüs aşısını kuyucuklara ekleyin ve en düşük seyreltmeye doğru çalışın. Bir saatlik inkübasyondan sonra, virüs süspansiyonunu en düşük konsantrasyondan en yüksek konsantrasyona kadar kuyulardan çıkarın ve atın.Virüs süspansiyonu izlerini gidermek için enfekte olmuş hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Kuyuyu DMEM ve% 1.5 düşük viskoziteli karboksimetilselüloz ile kaplayın. Plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.İnkübasyondan sonra, kaplama ortamını çıkarın ve atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. 96 oyuklu plaka için, kaplama ortamını çıkarmak ve atmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve hücreleri oyuk başına 60 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri sabitlemek için% 4 paraformaldehit ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.20 dakika sonra paraformaldehiti atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, 3, 3'diaminobenzidin peroksidaz substratı ekleyin ve plakayı karanlıkta 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, kuyucukları suyla yıkayarak reaksiyonu durdurun.Plakaları gece boyunca havayla kurutun ve odak sayımına devam edin. Seçilen seyreltmenin her bir kopyası için odakları sayın ve her biri için ortalama odak sayısını hesaplayın. Enfekte Vero hücreleri, enfeksiyondan sonra farklı zaman noktalarında sabitlendi.2 oyuklu plaka için, virüs odaklarının ilk görünümü enfeksiyondan 48 saat sonra gözlendi, ancak odakların boyutu doğru bir şekilde sayılamayacak kadar küçüktü. Enfeksiyondan 96 saat sonra, hücre dekolmanı belirtisi yoktu. Enfeksiyondan 60 saat sonra, odak boyutu sayım için en uygun seviyeye yükselmiştir.Daha sonra, zaman ilerledikçe, odaklar büyüdü ve yoğunluk olarak birbirleriyle birleşmeye veya üst üste binmeye başladı ve zamanla büyüyen kümeler oluşturdu. Bu nedenle, enfeksiyondan 60 saat sonra oluşan odaklar, 24 oyuklu bir plakada Zika virüsü titresini belirlemek için seçildi. 96 oyuklu plaka için, hücreler enfeksiyondan 72 saat sonra bozulmadan kaldı.Virüs odaklarının görünümü ilk olarak enfeksiyondan 24 saat sonra gözlendi. Bununla birlikte, enfeksiyondan 36 saat sonrasına kadar, odakların boyutu çok küçüktü. Optimal odak büyüklüğü enfeksiyondan 48 saat sonra elde edildi.Daha sonraki zaman noktalarında, üst üste binen veya birleşen odaklar gözlemlendi ve üst üste binen odakların sayısı zamanla arttı. Enfeksiyondan 48 saat sonra oluşan odaklar, Zika virüsü izolatlarının virüs titresini belirlemek için seçildi. DPBS'yi her bir oyuğun kenarına yavaşça ekleyin ve hücresel kalıntıları ve fazla ortamı çıkarmak için plakaları bir ila üç kez ileri ve geri sallayın.Bu teknik, Zika araştırmalarındaki araştırmacılara büyük fayda sağlayacaktır ve ayrıca klinik olarak önemli diğer virüsleri ölçmek için geniş çapta uyarlanabilir, bu da onu virüs gözetimi ve teşhisi için değerli bir araç haline getirir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Yayılması<em&gt; Homalodisca coagulata virüs 01</em&gt; Yoluyla<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Hücre Kültürü

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

Tam kan örneklerinde virüs tespiti için hızlı, güvenli ve basit el ile başucu nükleik asit çıkarma

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Antikor-bağımlı donanýmýn birincil insan hücrelerinde Zika şunun miktar

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Farede Birden Fazla Organdan Zika Virüsünün İzolasyon ve Nicelikselleştirilmesi

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

In Vitro ELISA Testi Kuduz Aşısı Potens Değerlendirmek için

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...