Name: robust tissue fabrication for long-term culture of ipsc-derived brain organoids for aging research
Uploaded: 2023-05-12T12:20:00
Duration: 8 min 20 s
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这项工作得到了荷兰器官芯片倡议的支持，这是一个由荷兰政府教育、文化和科学部资助的 NWO 引力项目 （024.003.001）。D.C.B.感谢国家科学与技术委员会（CONACyT）以博士奖学金的形式提供的财政支持。

患者研究得到了机构审查委员会的批准。所有参与者都签署了书面知情同意书和存储库同意书，以允许其数据和生物样本被重新利用。iPSC系是根据IRB和机构指南生成的。 图1 显示了该协议工作流程的示意图。
1. iPSC重编程和维护
<ol><li>将 8 mL 受试者的血液（老年或疾病患者;65 岁及以上）收集到带有柠檬酸钠的细胞制备管 （CPT） 中或放入 EDTA 或肝素化管中。</li>
	<li>在室温（RT）下以1，800× g 离心30分钟，以收集仅含有外周血而不含血清15的沉淀。</li>
	<li>根据制造商的方案（参见 材料表）使用专门的重编程载体来获得iPSC16。</li>
	<li>在无饲养层、无乳糖脱氢酶升高病毒 （LDEV） 的低生长因子基底膜基质中培养 iPSC，在 37 °C 的 Essential 8 （E8） 培养基（参见 材料表）中，在含 5% CO2 的潮湿气氛中。</li>
	<li>将 iPSC 在 E8 培养基中维持 3-4 天，以避免过度拥挤或自发分化。</li>
	<li>使用免疫荧光标记物验证iPSC系的多能性（步骤2）并检测支原体（步骤3）。</li>
</ol>2. 多能性染色
<ol><li>为了保存溶液和抗体，在分析前3-4天将细胞接种在包被（步骤1.4）24孔培养板上。用移液管吸出培养基，并在室温下用4%甲醛在磷酸盐缓冲盐水（1x PBS）中固定细胞15-20分钟。</li>
	<li>用1x PBS洗涤细胞3倍，并在PBS中的1%牛血清白蛋白（BSA）中用0.1%Triton-X 100透化至少15分钟，但在室温下不超过1小时。</li>
	<li>用 1x PBS 洗涤 3 次，并在室温下用 5% BSA 在 PBS 中块 30 分钟。</li>
	<li>用1x PBS再次洗涤3x，并加入抗体Sox 2和Oct3 / 4（1：100稀释;参见 材料表）和核染色DAPI在1%BSA（1：4，000稀释）中在4°C下过夜。用铝箔包裹以防止光线照射。</li>
	<li>用 1x PBS 洗涤 3 次，并将细胞留在 PBS 中。用荧光显微镜以10-20倍放大倍率成像。确保多能性标记 Sox2 和 Oct3/4 位于细胞核中 17，18。</li>
</ol>3. 支原体检测
注意：有关详细的测定执行和分析步骤，请参阅检测试剂盒的实验方案（参见 材料表）。检测试剂盒为支原体检测提供试剂、底物和检测缓冲液。
<ol><li>在传代细胞或刷新培养基之前，在离心管中收集2-3mL细胞培养基，并在室温下以200× g 沉淀任何细胞或碎片5分钟。 将上清液在4°C下储存≤5天。将细胞与培养基孵育至少24小时以确保可检测的信号。</li>
	<li>将 100 μL 细胞上清液加入白壁 96 孔板的新鲜管或孔中（建议使用不透明底部，参见 材料表）。在测定缓冲液中重建试剂和底物，并在室温下平衡15分钟。</li>
	<li>向样品中加入 100 μL 试剂并在室温下孵育 5 分钟。 用光度计测量发光（测量#1）。</li>
	<li>向样品中加入 100 μL 底物并在室温下孵育 10 分钟。 测量发光（测量#2）。</li>
	<li>通过测量#2与#1的比率确定支原体污染。请参阅试剂盒的手册以了解结果的解释。</li>
</ol>4.微丝制备
<ol><li>通过用手术刀的钝端磨损缝合线来开始制备聚（乳酸-共乙醇酸）（PLGA，参见 材料表）微丝。用 70% 乙醇轻轻喷洒磨损的纤维。</li>
	<li>在显微镜下并使用尺子开始将PLGA纤维切割成500μm至1mm长的碎片。总共切割约25毫米的纤维。将细丝保存在装有 1 mL 抗生素-抗真菌溶液的 15 mL 管中。<ol><li>在罩中，用 10 mL DMEM/F-12 稀释纤维溶液（表 1）。充分涡旋以混合溶液。 注意：在无菌环境中的细胞培养流动罩中工作。</li>
	</ol></li>
	<li>将 20 μL 纤维溶液添加到形成 96 孔板的三个胚状体 （EB） 中。在明场显微镜下，对每孔的纤维进行计数和平均。稀释或浓缩至平均每孔5-10个PLGA微丝。以这种方式准备每个井。</li>
	<li>孔现在已准备好接种细胞。将板在室温下储存，直到需要或第二天在4°C下储存。</li>
</ol>5. 拟胚体（EB）形成
注意：所有介质和溶液必须加热至室温。
<ol><li>一旦iPSC达到70%-80%汇合度（图2A），它们就可以传代并用于EB形成。用显微镜以10x-20x放大倍率检查细胞。确保菌落显示最小的（<10%）自发分化区域。</li>
	<li>用移液管吸出培养基，并用DPBS洗涤细胞一次。通过加入500μL细胞分离溶液（参见 材料表）或0.5mM乙二胺四乙酸（EDTA）解离菌落，并在37°C孵育3-5分钟。 注意：在无菌环境中的细胞培养流动罩中工作。</li>
	<li>通过向每个孔中加入 1 mL 新鲜 E8 培养基来收集释放的细胞，并轻轻移液直至所有细胞分离。</li>
	<li>将 1.5 mL 细胞悬液转移到 15 mL 管中，再加入 1 mL 新鲜 E8 培养基，以达到 2.5 mL 的总体积。</li>
	<li>在室温下以290× g 离心3分钟。</li>
	<li>用移液管吸出上清液，将细胞沉淀重悬于补充有50μM ROCK抑制剂的1mL基本6（E6，参见 材料表）培养基中，并使用血细胞计数器19计数细胞。</li>
	<li>根据所需的接种密度，在补充有50μMROCK抑制剂的E6培养基中制备60，000-90，000个细胞/ mL的细胞悬液（参见 材料表）。</li>
	<li>将 150 μL 细胞悬液加入 96 孔 ULA 板（或准备好的凹板20）的每个孔中。每孔接种9，000-11，000个细胞。</li>
	<li>离心板以在室温下以290× g 强制聚集细胞1分钟。 将板置于37°C的培养箱中，在含有5%CO2的潮湿气氛中。</li>
</ol>6. 神经上皮诱导
<ol><li>24小时后，用移液管小心吸出120μL培养基。确保不要通过将移液器吸头降低到孔中太远来吸出EB。</li>
	<li>加入 150 μL E6 培养基（室温下），补充 2 μM XAV939 和 SMAD 抑制剂：每孔 10 μM SB431542 和 500 nM LDN 193189（参见 材料表）。</li>
	<li>每天用新鲜制备的E6培养基更换培养基，并补充有2μM的XAV939，10μM的SB431542和500nM的LDN 193189。 注意：到第 6 天 （DIV6），EB 的直径应为 550-600 μm，并准备好进一步分化。</li>
</ol>7. 类器官分化和成熟
注：所有介质都需要预热至室温。
<ol><li>在大约DIV7处，检查所有EB是否达到550-600μm的直径并显示光滑清晰的边缘（图2B）;在这个阶段，它们已准备好嵌入细胞外基质（ECM）中。 注意：在无菌环境中工作。</li>
	<li>通过将薄膜片（约 4 英寸长）放在空的 P200 盒子上，从热塑性密封膜（见 材料表）制备凹陷包埋片。使用 15 mL 锥形管或 500 μL 微量离心管，将薄膜片轻轻压入孔中，形成 12 个酒窝。用70%乙醇喷洒薄膜片，并在UV灯打开的情况下在流罩内干燥至少30分钟。</li>
	<li>在冰上解冻足够量的基底膜基质（基质胶，见 材料表），并将其放入流动罩内。 注意：每个EB需要大约30μL未稀释的膜基质。始终将膜基质保持在4°C以下，以防止其凝胶化。还建议使用预冷移液器吸头，因为它们在移液过程中会减缓基质在吸头中的聚合，从而减少材料损失。</li>
	<li>使用宽口径 P200 吸头，将一个 EB 转移到每个酒窝，并使用普通移液器吸头尽可能多地去除介质。注意不要让EB干燥。使用常规 P200 吸头，向每个类器官添加 ~30 μL 未稀释的膜基质，确保 EB 位于液滴的中心。</li>
	<li>将所有EB嵌入基质中后，将包含EB的薄膜片放入无菌培养皿中。 注意：可选地，可以将装满无菌水的小培养皿放在薄膜片旁边的较大培养皿中以防止蒸发。<ol><li>将培养皿转移到培养箱中，并在37°C下在含有5%CO2 的潮湿气氛中孵育约10分钟，以使膜基质凝固。</li>
	</ol></li>
	<li>对于每组 12 个嵌入的类器官，在 ULA 6 孔板的一个孔中制备 5 mL 含有不含维生素 A 的 B27 的分化培养基（表 1）。在培养箱中将板预热至37°C。</li>
	<li>孵育时间结束后，通过取膜片并从片背面推出凹痕，将嵌入的EB转移到ULA 6孔板中。如有必要，从孔中取出 1 mL 并将其移液到纸上以帮助液滴从薄膜上分离。 注意：嵌入后1天可以看到重要的形态变化;EB从光滑的边缘到形成芽的凸起突起（图2C）。</li>
	<li>2 天后 （DIV9），执行半介质更换。在此过程中注意不要吸出或损坏膜基质液滴。</li>
	<li>再过2天（DIV11），进行完全培养基更换，用3μM的CHIR99021补充培养基（参见 材料表）。</li>
	<li>在DIV14时，将培养基更换为含有维生素A的B27分化培养基（表1），以逐渐增加类器官大小。</li>
	<li>在DIV16，将孔板置于培养箱内以90rpm的速度的轨道振荡器上。每 2 天更换一次介质。</li>
	<li>每 40 DIV，每 50 mL 培养基稀释 500 μL 膜基质，以增加培养基中的营养物质。</li>
</ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+is+required+for+efficient+differentiation+of+isolated,+stem+cell-derived+otic+vesicles+into+inner+ear+organoids.">Matrigel is required for efficient differentiation of isolated, stem cell-derived otic vesicles into inner ear organoids.</a> Stem Cell Research. 53, 102295 (2021).</li><li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+functionally+integrated+human+forebrain+spheroids.">Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids.</a> Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).</li><li>Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+self-organization+and+cortical+plate+formation+in+human+brain+organoids.">Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).</li><li>Tejchman, A., Zn&#243;j, A., Chlebanowska, P., Fr&#261;czek-Szczypta, A., Majka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+fibers+as+a+new+type+of+scaffold+for+midbrain+organoid+development.">Carbon fibers as a new type of scaffold for midbrain organoid development.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 5959 (2020).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

EB的标准化形成是多能干细胞可重复转化为脑类器官的关键步骤。干细胞聚集到奇异组织中的力聚集可以根据凹孔的几何形状、播种密度和孔处理而变化。尽管目前的方法在6天后引用了500-600μm的直径范围，但这些直径并不排除适当类器官形成的其他直径，因为许多其他直径已被证明是成功的。然而，不同的直径已被证明会影响分化率和成功率29。出于重现性的目的，强烈建议直径变化小于50μm20。此外，神经诱导天数可以从6天延长到10天，以允许EB直径增长，因为SMAD抑制剂的使用已被证明可以在暴露30天后有效地产生和维持神经上皮的形成。在没有SMAD抑制剂的情况下，神经诱导会产生不一致的结果，需要更长的诱导期。这项工作中引用的SMAD抑制剂是最有效的，但其他背吗啡和TGF-β小分子可以在其有效浓度下使用。
基底膜基质为生长提供了极好的底物，并且可以以不同的方式施用。基质的早期用途包括基底膜作为孔涂层31。然而，使用基质包埋组织显示出改善这些组织中的分化和成熟32。对于类器官，使用基质已被证明可以改善EB分化为类器官，促进成熟并延长培养期33。虽然类器官仍然可以在没有基质的情况下形成，但正如许多小组努力实现无基质组织培养一样34，35，研究发现，基质包埋的类器官具有更高的延长培养时间的机会，并且需要更少的维护36。凹陷包埋方法提供了类器官表面的均匀覆盖，确保相似的扩散、营养物质的获取和可重复的分化。或者，可以使用圆顶嵌入来完全封装类器官37。
将EB转移到膜基质凹坑中是至关重要的一步。虽然 1 mL 移液器吸头具有足够宽的开口来转移 EB，但为了便于转移，首选 200 μL 吸头。需要切割 200 μL 吸头以形成足够大的开口，确保边缘光滑，以减少移液时的剪切应力。或者，存在宽口径 200 μL 吸头，以便于转移。移液需要缓慢进行，因为快速移液可能会破坏类器官外围并阻碍正常生长。必须特别注意确保转移足够的培养基以提供营养。培养基太少有使类器官干燥的风险，导致坏死。用过多的培养基转移EB会导致基质过于稀释，无法牢固地封装类器官。理想情况下，基质的稀释不得超过50%，以确保其聚合并作为EB的ECM发挥作用。如果嵌入不成功，可以恢复并重新封装EB。可以在任何时候在新鲜基质中进行重新封装，为类器官提供额外的支持。
与用于支架的基质嵌入类似，PLGA 纤维为三维生长提供了额外的支持。最初掺入PLGA纤维是为了生产细长的类器官并增加表面积38，PLGA纤维的掺入已逐渐被确定为改善类器官分化和成熟的附加工具39。随着越来越多的实验室希望减少基质的使用或完全废除它，由掺入纤维支持的类器官的自组织特性为三维组织的创建和分化提供了足够的支架39。在这里，将两种方法结合起来以增加长期培养的机会38，39。在初始聚集期间掺入纤维至关重要，因为这些纤维可能不会在以后的阶段引入。离心后，检查聚集细胞中是否有几根纤维将确保纤维掺入EB中。如果不成功，轻轻抽吸孔并重新离心应确保混合。
类器官维护的另一个关键步骤是引入轨道摇床，以获得更好的培养基灌注。在类器官方案的早期迭代中，使用旋转生物反应器来创建搅拌11。90 rpm的轨道摇床提供足够的搅拌，而不会破坏基质液滴或破坏类器官形态。一些组不使用基质支架，但保留振动台搅拌以提供合适的环境34。与所有协议一样，旋转速度必须根据振动台进行调整，以减少剪切应力。如果选择圆顶嵌入，则可以使用倾斜振动台来减少剪切应力11，34。
综上所述，几种选定技术的整合提供了一种可靠的iPSC衍生类器官形成方法。有几种方法可以创建和维护类器官，但其中许多方法侧重于早期分化轨迹。在这项工作中，将多种不同的技术结合起来，长时间培养类器官，越过分化阶段，进入成熟期，衰老表型可以开始发展。结合这些技术可以延长成熟期，而无需外源性生物因素来维持培养物，保留自我组织和衰老的自然进展。

随着人类预期寿命的持续延长，衰老疾病模型变得越来越重要。大规模的基因组研究揭示了分子过程失调和影响生活质量的遗传变化的老年人群1。衰老过程的特征是生物体功能普遍丧失，包括认知功能丧失，神经退行性疾病风险增加以及许多慢性疾病2。
目前的细胞培养技术不能恰当地代表衰老的多因素性质，因为这些功能障碍不能通过使用突变、毒素或感染来正确复制3。探索衰老过程的动物模型通常与较长的实验时间和高昂的成本有关，但也带来了伦理方面的考虑。使用来自患者的诱导多能干细胞（iPSC）可以阐明疾病进展的分子机制，因为iPSC允许细胞自然发育成成熟组织3。iPSCs已成为许多研究神经退行性疾病的实验室的工作马，因为收获细胞的细胞重编程似乎并没有消除供体的疾病或衰老印记4。这些印记概括了已在人类和动物模型中证明的细胞表型，使iPSCs适用于检查高密度脑组织的单个细胞劣化5，6。IPSC衍生的类器官已成为组织三维培养的卓越模型，可实现更复杂的细胞间相互作用和改进的发育概括。虽然类器官主要用于发育数据，但越来越多地应用于疾病建模，特别是炎症、神经变性和衰老模型7。基于先前的iPSC研究，类器官在组织样网络连接的生理环境中保留疾病表型和细胞表型8，9。然而，培养某些尺寸的三维组织可能具有挑战性，尤其是在长时间内。
这项工作提出了一种可重复生成大脑类器官的详细方法，该方法允许组织在更长的时间内显着成熟。大脑类器官的创建保持相对标准化，采用了几个著名协议的方法10，11。然而，已经提出了一些修改，以改善分化和维护。这些替代方法包括使用神经源性因子来增强神经分化12，使用额外的支架来改善营养交换，促进细胞寿命13，以及使用低纯粹的压力搅拌来延长培养和生长14。这些改进已被纳入该方法，以开发能够表达神经退行性和衰老表型的成熟类器官。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>657185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>136101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46964</td>
			<td>cell detachment solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Suppement (with Vitamin A) (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer&#8482; Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-685-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td>With plate holders</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S2924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoTune Sendai Reprogramming Vector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1378001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR primers | human | MAPT</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>dHsaCPE192234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN)&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>dHsaCPE5052108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doublecortin (DCX)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC-8066</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td>no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf cups, 1.5 mL&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1517001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes, 15 mL, conical</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>37% Stock solution, diluted to 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer cell counter</td>
			<td>Hausser scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDN 193189</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>72147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32454</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer&#160;</td>
			<td>1420</td>
			<td>luminometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuN</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-5279 AF647</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>thermoplastic film sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>42-6600</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet digital PCR system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor (Y27632)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542&#160;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1614/50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>53-9811-80</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synapsin I (SYN)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>574777</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X 100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-80005</td>
			<td>Beta-3-tubulin; 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV939</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>3748</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust tissue fabrication for long-term culture of ipsc-derived brain organoids for aging research

目前可用的动物和细胞模型并不能完全概括衰老人脑中发生的变化的复杂性。最近开发的描述源自人类诱导多能干细胞（iPSCs）的人脑类器官生成的程序有可能从根本上改变模拟和理解人脑衰老和相关致病过程的能力。本文介绍了一种用于生成、维持、老化和表征人 iPSC 来源的脑类器官的优化方案。该协议可以实施以可重复的方式生成脑类器官，并作为分步指南，结合最新技术，从而改善类器官成熟和培养中的衰老。与类器官成熟、坏死、变异性和批次效应相关的具体问题正在得到解决。综上所述，这些技术进步将允许模拟来自各种年轻和老年人类供体的类器官的大脑衰老，以及患有与年龄相关的脑部疾病的个体，从而能够识别人类大脑衰老的生理和致病机制。

整合 PLGA 纤维、酒窝包埋和搅拌可产生稳健的大脑类器官，使 iPSC 衍生的培养物能够长时间维持（图 1）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig01.jpg"> 图 1：此方法的工作流程和时间表的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的大图。</a>
初始神经诱导期与先前发表的程序相当11。胚状体（EB）开始时为圆形聚集体（图2B），边缘为白色或透明。当EB在DIV7处从神经诱导培养基变为神经维持培养基时，突起和出芽在24小时内从圆形组织出现（图2C）。此外，随着类器官的持续生长，PLGA纤维的表面积有助于类器官伸长（图2D）。在成熟过程中，类器官的边缘需要保持完整，因为它是健康细胞和发育的好兆头;否则，必须提供额外的营养物质13 （图2E）。类器官培养物的搅拌进一步促进了类器官的生长，因为这改善了营养物质的灌注。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig02.jpg"> 图2：大脑类器官的分化和成熟 。 （A）70%-80%汇合度的iPSC培养物的代表性图像。（B）产生拟胚体（EBs）并诱导神经上皮形成，直到DIV7。然后将EB嵌入膜基质中，并进一步分化为脑类器官。（C）DIV10处的类器官显示出不同的出芽结构。类器官可以使用（D）凹陷或（E）夹层包埋在膜基质中进一步成熟，此处如DIV30所示。（F）长期培养显示脑类器官生长到显着大小（DIV70）。比例尺 = 500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
类器官的尺寸和外部形态由类器官内部的复杂结构补充。在第一阶段分化后将组织固定在DIV7后，EB的细胞表达SOX2，一种HMG盒转录因子，可作为多能神经干细胞21的标记物，以及配对的蛋白质盒Pax-6，表明神经祖细胞（图3）。已经可以看到由TuJ1（III类β-微管蛋白）22 标记的未成熟神经元分散在整个组织中。
在这个阶段，这些类器官经历的自组织的例子变得明显。称为玫瑰花结的径向结构的组织类似于神经管，玫瑰花结中心21 中的SOX2+细胞和玫瑰花结外围的PAX6。这些玫瑰花结在向外迁移时会产生神经元。这些放射细胞最初对神经干/祖细胞标志物Nestin 23 和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）呈双重阳性，类似于 体内 脑神经源性区域中发现的径向神经胶质细胞。随着这些迁移神经元的成熟，细胞骨架标志物反映了这种变化22。早期神经分化标记物TuJ1 22在玫瑰花结的内圈可见，并转变为微管相关蛋白2（MAP2 ）24，这是外围的神经元特异性成熟标志物。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig03.jpg"> 图 3：DIV7 处的拟胚体显示出结构组织和不成熟的特征。 DIV7 处 EB 的全卡口免疫组织化学图像。（A） EB 的合成图像，显示 （B） SOX2+ 神经玫瑰花结，（C） 分散在整个 EB 中的未成熟神经元 （TUJ1），（D） 神经祖细胞 （PAX6） 和 （E） DAPI 可视化的细胞核。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
随着类器官的老化，发育神经元的组织和标记开始复制生理条件。在DIV30，可以观察到许多玫瑰花结产生相当于发育中的大脑的神经源性区域25。通过DIV60，这些SOX2 +神经源性区域不存在，取而代之的是成熟的MAP2和NeuN26，神经元分化标记物和阳性神经元（图4和图5）。 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig04.jpg"> 图 4：DIV120 处的类器官显示出成熟的神经元特征。 DIV 120处类器官切片的免疫组织化学图像。（A）显示（B）MAP2（紫色）和（C）NeuN（绿色）的成熟神经元标志物的切片的合成图像。（D）细胞核由DAPI可视化。比例尺 = 20 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig05.jpg"> 图 5：DIV120 类器官的数字微滴 PCR。 数字微滴PCR图显示（A）MAP2（顶部，蓝色）和（B）NeuN（底部，绿色）的绝对表达值。斜线的黄线分隔不同的iPSC系（A，B，C等），并且类器官已分批在一起。N = 5。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
这些细胞骨架标志物可以与其他有丝分裂后标志物（如双皮质素27 和突触素 28）结合使用，以探测突触可塑性和其他与年龄相关的衰退（图 6），以及星形胶质细胞和神经胶质细胞等其他脑组织（图 7）。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig06.jpg"> 图 6：突触末端分析示例。 DIV 120处类器官切片的免疫组织化学图像。（A）染色的切片的合成图像，用于（B）MAP2，（C）双皮质素（DCX）和（D）突触蛋白I（SYN）。（E）细胞核由DAPI可视化。比例尺 = 200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64586/64586fig07.jpg"> 图7：神经胶质发育的证据。 DIV 120处类器官切片的免疫组织化学图像。（A） （B） 离子钙结合接头分子 1 （Iba1） 和 （C） NeuN 染色切片的合成图像。（D）细胞核由DAPI可视化。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64586/64586fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>试剂</td>
			<td>最终浓度</td>
			<td>体积（总共 50 mL）</td>
		</tr><tr><td>DMEM-F12</td>
			<td>50%</td>
			<td>25毫升</td>
		</tr><tr><td>神经基础培养基</td>
			<td>50%</td>
			<td>25毫升</td>
		</tr><tr><td>N2 补充剂 （100x）</td>
			<td>1 倍</td>
			<td>0.25毫升</td>
		</tr><tr><td>B27 补充剂 -/+ 维生素 A （50x）</td>
			<td>0.5 倍</td>
			<td>0.5毫升</td>
		</tr><tr><td>胰岛素</td>
			<td>0.25%</td>
			<td>12.5 微升</td>
		</tr><tr><td>谷氨酸最大值 （100x）</td>
			<td>1 倍</td>
			<td>0.5毫升</td>
		</tr><tr><td>MEM-NEAA （100x）</td>
			<td>0.5 倍</td>
			<td>0.25毫升</td>
		</tr><tr><td>HEPES （1 M）</td>
			<td>10 毫米</td>
			<td>0.5毫升</td>
		</tr><tr><td>抗生素/抗真菌药（100x）</td>
			<td>1 倍</td>
			<td>0.5毫升</td>
		</tr><tr><td>2-β-巯基乙醇</td>
			<td>50微米</td>
			<td>17.5 微升</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*注意：某些 DMEM-F12 已经含有谷氨酸，无需添加额外的。</td>
		</tr></tbody></table>表1：本研究中使用的分化培养基的组成。

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Robust Tissue Fabrication for Long-Term Culture of iPSC-Derived Brain Organoids for Aging Research

本协议为源自人诱导多能干细胞（iPSC）的脑类器官的可重复生成，维持和老化提供了一步一步的程序。这种方法能够长时间培养和成熟大脑类器官，这有助于对涉及大脑衰老和年龄相关发病机制的过程进行建模。

用于长期培养iPSC衍生的脑类器官的稳健组织制造，用于衰老研究

The currently available animal and cellular models do not fully recapitulate the complexity of changes that take place in the aging human brain. A recent ...

我们的方案结合了几种技术，这些技术已被证明对长期类器官维护有效。这对于研究临床表现在发育期之外的年龄相关疾病的衰老很有用。该技术的主要优点是不需要任何专用设备或试剂。它主要基于实验室中常见的材料。衰老和神经退行性疾病已成为一个特别有趣的点，因为我们目前的建模方法主要关注已建立的疾病表型，而不是早期发育阶段。胚胎干细胞和iPSC是非常脆弱的细胞。初次使用的用户应该温和并有耐心。由于这些是长期培养，因此从一开始就应该耐心等待 首先，在缝合线上喷洒 70% 乙醇，并通过用手术刀的钝端磨损缝合线来制备 PLGA 微丝。将光纤放在显微镜下。然后使用尺子开始将纤维切割成 500 微米到 1 毫米长的碎片。总共切割约25毫米的纤维，并将细丝加入含有1毫升抗生素 - 抗真菌溶液的15毫升管中。接下来，在引擎盖中，用 10 毫升 DMEM/F-12 稀释纤维溶液并涡旋以充分混合。然后，将20微升纤维溶液加入96孔板的三个孔中。使用明场显微镜，对每孔的纤维进行计数和平均。用纤维溶液稀释或浓缩孔，平均每孔5至10个微丝。一旦先前培养的诱导多能干细胞达到70%至80%汇合度，请在显微镜下以10或20倍放大倍率检查细胞。确保菌落显示小于 10% 的自发分化面积。用移液管吸出培养基，并用DPBS洗涤细胞一次。然后，加入500微升细胞分离溶液或0.5毫摩尔EDTA以解离菌落，并在37摄氏度下孵育三至五分钟。接下来，向每个孔中加入一毫升新鲜的E8培养基，轻轻移液以分离所有细胞。将整个细胞悬液转移到15毫升离心管中，并加入另外一毫升新鲜E8培养基。然后，在室温下以 290 g 离心细胞三分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀重悬于一毫升补充有50微摩尔ROCK抑制剂的E6培养基中，并使用血细胞计数器计数细胞。在补充有ROCK抑制剂的E6培养基中制备所需座位密度的细胞悬液。然后，将150微升细胞悬液添加到96孔超低附着板的每个孔中。接下来，在室温下以290g离心板三分钟以强制聚集细胞。然后，将板在37摄氏度的加湿气氛中与5%二氧化碳孵育以进行拟胚体形成。孵育24小时后，将板转移到罩上，并使用移液管小心地吸出120微升培养基，注意不要通过将移液器尖端降低到孔中太远来吸出胚体。接下来，向每个孔中加入150微升新鲜E6培养基，补充有两微摩尔XAV939和SMAD抑制剂。将板转移回培养箱，每天用补充有抑制剂的新鲜制备的E6替换培养基。在孵育的第 7 天，检查所有拟胚体是否达到 550 至 600 微米的直径并显示光滑、清晰的边缘。在这个阶段，它们已准备好嵌入细胞外基质中。要嵌入类器官，通过将四英寸长的热塑性天花板薄膜板放在空的 P200 盒子上来准备凹陷包埋片。然后，使用15毫升锥形管或500微升微量离心管，轻轻地将薄膜片压入孔中，以产生12个或所需数量的酒窝。接下来，在薄膜片上喷洒 70% 乙醇，让它在紫外线灯打开的情况下在引擎盖内干燥至少 30 分钟。同时，在冰上解冻足量的基底膜基质。然后，使用宽口径P200尖端，将一个胚状体从96孔板转移到每个酒窝。用普通移液器吸头尽可能多地去除培养基，但不要让胚状体干燥。接下来，使用常规的预冷P200尖端，向每个类器官添加约30微升未稀释的膜基质，确保胚胎体尽可能靠近液滴的中心。一旦所有拟胚体嵌入基质中，将薄膜片放入无菌培养皿中。然后，将培养皿在37摄氏度下在含有5%二氧化碳的潮湿气氛中孵育10分钟，以使膜基质凝固。对于类器官分化，将 5 毫升含有不含维生素 A 的 B-27 制备的分化培养基添加到超低附着 6 孔板的一个孔中。在培养箱中将板预热至37摄氏度。膜基质凝固后，通过从薄膜片背面推出凹坑，将嵌入的拟胚体转移到 6 孔板上。如有必要，使用孔中的一毫升培养基并将其粘在薄膜上以将液滴从薄膜片上分离。膜基质中嵌入的拟胚体分化为脑类器官，在体外白天显示出不同的出芽形成10。在体外30日，使用酒窝或夹层包埋进一步成熟类器官。长期培养显示脑类器官生长到显著大小。在体外第七天，拟胚体显示SOX2阳性神经莲座，分散的未成熟神经元和神经祖细胞。而在体外120日，它们表现出成熟的神经元标志物，如MAP2和NeuN。这些细胞骨架标志物可以与其他有丝分裂后标志物（如双皮质素和突触素）结合使用，以探测突触可塑性和其他与年龄相关的衰退，以及星形胶质细胞和神经胶质细胞等其他脑组织。确保组织边缘保持完整至关重要。为了尽量减少有害的剪切力，管道应缓慢完成，例如，在更换介质和类器官嵌入时。类器官生长减慢使我们能够研究早期细胞表现中的疾病进展。类器官的产生为许多疾病的早期检测铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

低聚β-淀粉样蛋白的制备 1-42和突触可塑性损伤诱导海马脑片

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

科研

神经科学

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

抛光和钢筋，颅骨变薄窗口，为长期的小鼠脑成像

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

长期的嗅觉适应性的分子读数<em&gt; C.线虫</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

长时程增强一个非常稳定的和可重复的记录和保存海马鼠标片制备工艺的改进

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

原发性脑多巴胺能神经元的分离，培养和长期维持胚胎脑鼠类

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

琼脂糖微室的长期钙成像<em&gt;秀丽隐杆线虫</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

的简化方法超低密度，长期主要海马神经元文化

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Modified Roller Tube Method for Precisely Localized and Repetitive Intermittent Imaging During Long-term Culture of Brain Slices in an Enclosed System

封闭系统中脑切片长期培养中精确定位和重复间歇成像的改进辊筒法

Cultured rodent brain slices are useful for studying the cellular and molecular behavior of neurons and glia in an environment that maintains many of ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

成人脑切片长期抑郁症诱导评估

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Long-Term, Serum-Free Cultivation of Organotypic Mouse Retina Explants with Intact Retinal Pigment Epithelium

长期，无血清培养有机小鼠视网膜外植与完整的视网膜色素上皮

In ophthalmic research, there is a strong need for in vitro models of the neuroretina. Here, we present a detailed protocol for organotypic culturing of ...