Name: assessing changes in synaptic plasticity using an awake closed-head injury model of mild traumatic brain injury
Uploaded: 2023-01-20T12:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury at JoVE.com

Wir danken allen ehemaligen und gegenwärtigen Mitgliedern des Christie Laboratory an der University of Victoria für ihre Beiträge zur Entwicklung dieses Protokolls. Dieses Projekt wurde mit Mitteln der Canadian Institutes for Health Research (CIHR: FRN 175042) und des NSERC (RGPIN-06104-2019) unterstützt. Die Schädelgrafik von Abbildung 1 wurde mit BioRender erstellt.

Die Genehmigung für alle Tierverfahren wurde vom Tierpflegeausschuss der University of Victoria in Übereinstimmung mit den Standards des Canadian Council on Animal Care (CCAC) erteilt. Alle männlichen Long-Evans-Ratten wurden im eigenen Haus gezüchtet oder gekauft (siehe Materialtabelle).
1. Haltungs- und Zuchtbedingungen
<ol><li>Lassen Sie die Tiere 1 Woche lang an ihre Haltungsumgebung gewöhnen, bevor sie am 21. Tag nach der Geburt (PND) entwöhnt wer...

In den meisten präklinischen Forschungen wurden Modelle von mSHT verwendet, die die biomechanischen Kräfte, die in der klinischen Population beobachtet wurden, nicht rekapitulieren. In dieser Arbeit wird gezeigt, wie das ACHI-Modell zur Induktion von r-mTBIs bei juvenilen Ratten eingesetzt werden kann. Dieses geschlossene Modell des r-mSHT hat erhebliche Vorteile gegenüber invasiveren Verfahren. Erstens verursacht das ACHI normalerweise keine Schädelfrakturen, Hirnblutungen oder Todesfälle, die alle Kontraindikation...

Schädel-Hirn-Trauma (SHT) ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem, mit ~2 Millionen Fällen in Kanada und den Vereinigten Staaten pro Jahr 1,2. SHT betrifft alle Altersgruppen und Geschlechter und hat eine höhere Inzidenzrate als jede andere Erkrankung, insbesondere Brustkrebs, AIDS, Parkinson und Multiple Sklerose3. Trotz der Prävalenz des SHT ist die Pathophysiologie nach wie vor nur unzureichend verstanden, und die Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt. Dies liegt zum Teil daran, dass 85 % aller SHT als mild (mSHT) eingestuft werden und bisher angenommen wurde, dass mSHT nur begrenzte und vorübergehende Verhaltensänderungen ohne neuropsychiatrische Langzeitfolgen hervorruft 4,5. Es ist inzwischen bekannt, dass die Genesung von mSHT Wochen bis Jahredauern kann 5,6, schwerwiegendereneurologische Erkrankungen auslösen kann 4 und dass selbst wiederholte "sub-erschütternde" Stöße das Gehirn beeinträchtigen7. Dies ist alarmierend, da Sportler in Sportarten wie Hockey/Fußball >10 sub-erschütternde Stöße pro Spiel/Trainingseinheit haben 7,8,9,10.
Jugendliche haben die höchste Inzidenz von mSHT, und in Kanada wird jährlich etwa einer von 10 Teenagern wegen einer sportbedingten Gehirnerschütterung ärztliche Hilfe in Anspruch nehmen11,12. In der Realität kann jeder sub-erschütternde Kopfaufprall oder mSHT diffuse Schäden am Gehirn verursachen, was auch zu einem anfälligeren Zustand für nachfolgende Verletzungen und/oder schwerwiegendere neurologische Erkrankungen führen könnte 13,14,15,16,17. In Kanada ist es durch das Rowan'sche Gesetz rechtlich anerkannt, dass eine frühere Verletzung die Anfälligkeit des Gehirns für weitere Verletzungen erhöhen kann18, aber das mechanistische Verständnis von r-mSHT ist nach wie vor völlig unzureichend. Es ist jedoch klar, dass einzelne und r-mSHT die Lernfähigkeit während der Schulzeitbeeinflussen können 19,20, geschlechtsspezifische Ergebnissehaben 21,22,23,2 4 und die kognitive Leistungsfähigkeit im späteren Lebenbeeinträchtigen können 16,25,26. In der Tat assoziieren Kohortenanalysen r-mSHT früh im Leben stark mit einer späteren Demenz27,28. r-mSHT ist möglicherweise auch mit chronischer traumatischer Enzephalopathie (CTE) assoziiert, die durch die Akkumulation von hyperphosphoryliertem Tau-Protein und progressiver kortikaler Atrophie gekennzeichnet ist und durch eine signifikante Entzündung ausgelöst wird 27,29,30,31. Obwohl die Zusammenhänge zwischen r-mSHT und CTE derzeit umstritten sind32, wird dieses Modell es ermöglichen, sie in einem präklinischen Umfeld genauer zu untersuchen.
Ein mSHT wird oft als "unsichtbare Verletzung" bezeichnet, da es in einem geschlossenen Schädel auftritt und selbst mit modernen bildgebenden Verfahren schwer zu erkennen ist33,34. Ein genaues experimentelles Modell von mSHT sollte zwei Grundsätzen folgen. Zunächst sollten die biomechanischen Kräfte rekapituliert werden, die normalerweise in der klinischen Population beobachtet werden35. Zweitens sollte das Modell heterogene Verhaltensergebnisse induzieren, was auch in klinischen Populationen weit verbreitet ist36,37,38. Derzeit sind die meisten präklinischen Modelle tendenziell schwerwiegender und umfassen Kraniotomie, stereotaktische Kopfstütze, Anästhesie und kontrollierte kortikale Auswirkungen (CCI), die erhebliche strukturelle Schäden und umfangreichere Verhaltensdefizite verursachen, als normalerweise klinisch beobachtet werden33. Ein weiteres Problem bei vielen präklinischen Modellen von Gehirnerschütterungen, die Kraniotomien beinhalten, besteht darin, dass dieses Verfahren selbst eine Entzündung im Gehirn hervorruft, was die Symptome eines mSHT und die Neuropathologie durch eine spätere Verletzung verschlimmern kann39,40. Die Anästhesie führt auch zu mehreren komplexen Störfaktoren, darunter die Verringerung der Entzündung 41,42,43, die Modulation der Mikrogliafunktion 44, die Freisetzung von Glutamat45, den Eintritt von Ca2+ durch NMDA-Rezeptoren 46, den intrakraniellen Druck und den zerebralen Stoffwechsel 47. Die Anästhesie führt außerdem zu Störfaktoren, indem sie die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BHS), die Tau-Hyperphosphorylierung und den Kortikosteroidspiegel erhöht und gleichzeitig die kognitive Funktion verringert 48,49,50,51. Darüber hinaus machen diffuse, geschlossene Verletzungen die überwiegende Mehrheit der klinischen mSHT aus52. Sie ermöglichen es auch, die Vielzahl von Faktoren besser zu untersuchen, die Verhaltensergebnisse beeinflussen können, darunter Geschlecht21, Alter 53, Inter-Verletzungsintervall15, Schweregrad54 und die Anzahl der Verletzungen23.
Die Richtung der Beschleunigungs-/Verzögerungskräfte (vertikal oder horizontal) ist ebenfalls ein wichtiger Faktor für das Verhalten und die molekularen Ergebnisse. Untersuchungen von Mychasiuk und Kollegen haben zwei Modelle von diffusen mSHT mit geschlossenem Kopf verglichen: Gewichtsabfall (vertikale Kräfte) und seitlicher Aufprall (horizontale Kräfte)55. Sowohl die Verhaltens- als auch die molekularen Analysen zeigten heterogene modell- und geschlechtsabhängige Ergebnisse nach mSHT. Tiermodelle, die helfen, chirurgische Eingriffe zu vermeiden und gleichzeitig lineare und Rotationskräfte einzubeziehen, sind daher repräsentativer für die physiologischen Bedingungen, unter denen diese Verletzungen normalerweise auftreten33,56. Das ACHI-Modell wurde als Reaktion auf diesen Bedarf entwickelt und ermöglicht die schnelle und reproduzierbare Induktion von mSHT bei Ratten bei gleichzeitiger Vermeidung von Verfahren (d. h. Anästhesie), von denen bekannt ist, dass sie Geschlechtsunterschiede verzerren57.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed helment&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific (BioReagents)</td>
			<td>BP160500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia chamber</td>
			<td>Home Made</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plexiglass Container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Heater Controller</td>
			<td>Warner Electric</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axon Digidata</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1440A</td>
			<td>Low-noise Data Acquisition System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance beam&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bio Basic Canada Inc.&#160;</td>
			<td>CD0050</td>
			<td>For aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Dage MTI</td>
			<td>NC-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>MM OXCD5C-K</td>
			<td>Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Clampex 10.5 Version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compresstome Vibrating Microtome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>VF 310-0Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concentric Bipolar Electrode</td>
			<td>FHC Inc.</td>
			<td>CBAPC75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific (Chemical)</td>
			<td>D16-3</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Stimulus Isolation Amplifier&#160;&#160;</td>
			<td>Getting Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td>Model 4D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific (Chemical)</td>
			<td>S373-500</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather Double Edge Blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman 1</td>
			<td>1001-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair Claw Clip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Can be obtained from any department store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Home and Recovery Cages</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Normal rat cages from animal care unit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hum Bug Noise Eliminator</td>
			<td>Quest Scientific&#160;</td>
			<td>726300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane USP</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 215 Digital Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>15-462-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Impact One CCI unit</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long-Evans rats, male</td>
			<td colspan="3">Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-Density Foam Pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3&#34; polyurethane foam sheet&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific (Chemical)</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Long Evans Rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiClamp 700B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Model 700B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Test Strips</td>
			<td>VWR Chemicals BDH</td>
			<td>BDH83931.601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific (Chemical)</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>aCSF, PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push Button Controller</td>
			<td>Siskiyou Corporation&#160;</td>
			<td>MC1000e</td>
			<td>Four-axis Closed Loop Controller Push-Button</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Discs</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>SS-033</td>
			<td>For use with Vapor Pressure Osmometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small towel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Scientific (Chemical)</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific (Chemical)</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>For aCSF, PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate</td>
			<td>Fisher Scientific (Chemical)</td>
			<td>S369-500</td>
			<td>aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft Plastic Restraint Cones</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>model DC-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stopwatch</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Many lab members use their iPhone for this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table or large cart with raised edges&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For NAP and ACHI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament)</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-110-10</td>
			<td>Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus BX5OWI</td>
			<td>5x MPlan 0.10 NA Objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vapor Pressure Osmometer</td>
			<td>Vapro</td>
			<td>Model 5600</td>
			<td>aCSF should be 300-310 mOSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibraplane Vibration Isolation Table</td>
			<td>Kinetic Systems</td>
			<td>9101-01-45</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing changes in synaptic plasticity using an awake closed-head injury model of mild traumatic brain injury

Leichtes Schädel-Hirn-Trauma (mSHT) ist ein weit verbreitetes Gesundheitsproblem in Nordamerika. Es besteht ein zunehmender Druck, ökologisch valide Modelle von mSHT mit geschlossenem Kopf im präklinischen Umfeld zu verwenden, um die Übertragbarkeit auf die klinische Bevölkerung zu erhöhen. Das ACHI-Modell (Awake Closed-Head-Injury) verwendet einen modifizierten kontrollierten kortikalen Impaktor, um eine geschlossene Kopfverletzung zu verursachen und klinisch relevante Verhaltensdefizite zu induzieren, ohne dass eine Kraniotomie oder der Einsatz eines Anästhetikums erforderlich ist.
Diese Technik führt normalerweise nicht zu Todesfällen, Schädelbrüchen oder Hirnblutungen und ist eher mit einer leichten Verletzung vereinbar. Die milde Natur des ACHI-Verfahrens macht es ideal für Studien, die repetitive mSHT (r-mSHT) untersuchen. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass r-mSHT zu einer kumulativen Verletzung führen kann, die Verhaltenssymptome, neuropathologische Veränderungen und Neurodegeneration hervorruft. r-mSHT tritt häufig bei Jugendlichen auf, die Sport treiben, und diese Verletzungen treten während einer Phase robuster synaptischer Reorganisation und Myelinisierung auf, was die jüngere Bevölkerung besonders anfällig für die langfristigen Einflüsse von r-mSHT macht.
Darüber hinaus tritt r-mSHT in Fällen von Gewalt in der Partnerschaft auf, eine Erkrankung, für die es nur wenige objektive Screening-Maßnahmen gibt. In diesen Experimenten wurde die synaptische Funktion im Hippocampus von juvenilen Ratten, die ein r-mSHT erlebt hatten, mit Hilfe des ACHI-Modells untersucht. Nach den Verletzungen wurde ein Gewebeschneider verwendet, um Hippocampusschnitte zu machen, um die bidirektionale synaptische Plastizität im Hippocampus entweder 1 oder 7 Tage nach dem r-mSHT zu bewerten. Insgesamt bietet das ACHI-Modell den Forschern ein ökologisch valides Modell, um Veränderungen der synaptischen Plastizität nach mSHT und r-mSHT zu untersuchen.

Das Awake Closed-Head-Verletzungsmodell ist eine praktikable Methode zur Induktion von r-mSHT bei juvenilen Ratten. Ratten, die mit dem ACHI-Modell r-mSHT ausgesetzt waren, zeigten keine offensichtlichen Verhaltensdefizite. Die Probanden in diesen Experimenten zeigten zu keinem Zeitpunkt während des r-mSHT-Verfahrens eine Latenz nach rechts oder Apnoe, was darauf hindeutet, dass es sich tatsächlich um ein mildes SHT-Verfahren handelte. Im NAP zeigten sich subtile Verhaltensunterschiede; Wie oben beschrieben, wurden die...

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Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

In dieser Arbeit wird gezeigt, wie ein waches geschlossenes Kopfverletzungsmodell verwendet werden kann, um die Auswirkungen eines wiederholten leichten Schädel-Hirn-Traumas (r-mSHT) auf die synaptische Plastizität im Hippocampus zu untersuchen. Das Modell repliziert wichtige Merkmale des r-mSHT bei Patienten und wird in Verbindung mit der in vitro Elektrophysiologie eingesetzt.

Beurteilung von Veränderungen in der synaptischen Plastizität unter Verwendung eines wachen geschlossenen Kopfverletzungsmodells für ein leichtes Schädel-Hirn-Trauma

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...

Dieses Protokoll bietet eine eindeutige Methode zur Herstellung hochwertiger transversaler Hippocampusschnitte von Tieren, die mit r-mTBI verabreicht wurden, mit dem ACHI-Modell. Das ACHI-Modell führt zu leichten Verletzungen. Es handelt sich nicht um Schädelfrakturen oder -blutungen, Kraniotomien oder die Verwendung von Anästhetika.Darüber hinaus ermöglicht es stabile elektrophysiologische Aufzeichnungen. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung der Veränderungen der synaptischen Plastizität nach wiederholter MTBI, deren Ätiologie weitgehend unbekannt ist, mit dem Potenzial, therapeutische Wege zu eröffnen. Das Verfahren wird von Allyson Gross, einer Masterstudentin meines Labors, und Dr. Eric Eyolfson, einem Postdoktoranden, demonstriert.Beginnen Sie damit, die Ratte in einen Rückhaltekegel zu legen und stellen Sie sicher, dass sich die Schnauze und die Nasenlöcher in der Nähe der kleinen Öffnung der Zapfen befinden, um eine ausreichende Belüftung zu ermöglichen. Verhindern Sie die Rattenbewegung, indem Sie den Kegel am kaudalen Ende mit einer Plastikhaarspange geschlossen halten. Positionieren Sie den Helm manuell über der Mittellinie der gefesselten Ratte mit der Zielscheibe über dem linken Parietallappen.Legen Sie als Nächstes die Ratte auf das Schaumstoffpolster, bevor Sie den Impaktor manuell in die Ausfahrposition bringen. Senken Sie die Impaktorspitze manuell ab, um die Zielscheibe am Helm zu berühren. Stellen Sie dann den Impaktor in die Einziehposition, damit sich der Impaktor 10 Millimeter über dem Helm zurückzieht.Senken Sie mit dem Drehknopf am stereotaktischen Arm die Aufprallspitze um 10 Millimeter ab, um die Zielscheibe am Helm erneut zu berühren. Legen Sie dann den Schlagschalter um, so dass der Kopf des Tieres mit sechs Metern pro Sekunde für 10 Millimeter beschleunigt wird. Sobald das Gerät aktiviert ist, entfernen Sie das Tier sofort aus dem Rückhaltekegel, um ein sofortiges neurologisches Untersuchungsprotokoll (NAP) durchzuführen.Nachdem Sie die Maus eingeschläfert haben, sezieren Sie das Gehirn und legen Sie es auf ein benetztes Filterpapier auf eine umgedrehte Petrischale. Entfernen Sie mit einem scharfen Skalpell das Kleinhirn und den präfrontalen Kortex, um das Gehirn abzutupfen. Trennen Sie die beiden Hemisphären, indem Sie die Mittellinie des Gehirns abschneiden.Um transversale Hippocampusschnitte zu erstellen, legen Sie eine Hemisphäre auf die mediale Oberfläche, kippen Sie das Skalpell um etwa 30 Grad nach innen und entfernen Sie eine dünne Scheibe von der dorsalen Oberfläche des Gehirns, um eine ebene Oberfläche für die Montage am Kolben zu schaffen. Drehen Sie das Gehirn auf die dorsale Oberfläche und tupfen Sie das Gehirngewebe vorsichtig auf trockenes Filterpapier, um überschüssiges ACSF zu entfernen. Befestigen Sie dann die dorsale Oberfläche des Gehirns mit Cyanacrylatkleber am Kolben und lassen Sie die ventrale Oberfläche aufrecht.Verlängern Sie das äußere Rohr des Kolbens über das Gehirn und gießen Sie die flüssige Agarose in das Rohr, bis das Gehirn vollständig bedeckt ist. Verfestigen Sie die Agarose schnell, indem Sie einen Kühlblock über das Kolbenrohr klemmen. Positionieren Sie den Kolben in der Kammer der Aufschnittmaschine und sichern Sie die Kammer mit einer Schraube.Nachdem Sie die Klinge befestigt haben, geben Sie eiskaltes, sauerstoffhaltiges ACSF in die Schneidekammer. Stellen Sie am Slicer die Schnittgeschwindigkeit auf vier, die Oszillation auf sechs ein und schalten Sie den Schalter für kontinuierliches Einzelschneiden auf Kontinuierlich. Drücken Sie dann auf Start, um mit der Durchtrennung des Gehirns bei 400 Mikrometern zu beginnen.Wenn der Slicer das Gehirn durchtrennt, verwenden Sie eine Pasteurpipette mit großem Durchmesser, um jede Scheibe in das Rückgewinnungsbad mit sauerstoffreichem ACSF zu übertragen. Lassen Sie die Scheiben 30 Minuten bei 32 Grad Celsius erholen und lassen Sie sie dann weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Wiederholen Sie diese Schritte, um Scheiben aus der zweiten Hemisphäre zu erstellen.Ziehen Sie mit einem handelsüblichen Mikropipettenzieher Ein- bis Zwei-Megaohm-Aufzeichnungselektroden aus 10 Zentimeter großen Borosilikatglaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 1,5 Millimetern und einem Innendurchmesser von 1,1 Millimetern. Verwenden Sie eine Pasteurpipette und übertragen Sie eine Hippocampus-Scheibe aus dem Auffangbad in die Kammer, die mit karbogeniertem ACSF perfundiert und bei 30 Grad Celsius gehalten wird. Richten Sie den Hirnschnitt so aus, dass der Gyrus dentatus und die Körnerzellschicht im Sichtfeld sichtbar sind.Verwenden Sie ein aufrechtes Mikroskop, um den Gyrus dentatus mit schräger Optik zu visualisieren. Positionieren Sie eine konzentrische bipolare Stimulationselektrode, um den medialen perforenten Pfad oder die MPP-Fasern im mittleren Drittel der Molekülschicht zu aktivieren. Positionieren Sie dann eine mit ACSF gefüllte Glasmikropipette im MPP.Beginnen Sie mit den Elektroden, die weiter voneinander entfernt sind, da das Berühren des Gewebes die Fasern schädigt. Sobald die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden positioniert sind, visualisieren Sie die evozierten Feldantworten mit einem Verstärker, einem Digitizer und einer Aufzeichnungssoftware. Finden Sie ein geeignetes feldexzitatorisches postsynaptisches Potential oder Feld-EPSP, indem Sie das Gewebe mit Stromimpulsen stimulieren und eine minimale Amplitude von 0,7 Millivolt mit einer klaren Fasersalve sicherstellen, die kleiner als das Feld-EPSP ist.Erhöhen und stellen Sie die Simulationsintensität ein, bis das Feld EPSP bei 70% der maximalen Amplitude liegt. Legen Sie als Nächstes eine stabile Vorkonditionierungs-Baseline für 20 Minuten mit 0,12-Millisekunden-Impulsen fest, die mit 0,067 Hertz abgegeben werden. Für einen stabilen Schnitt sollte die anfängliche Steigung des fEPSP weniger als 10 % Variabilität betragen und die Steigung der Linie der besten Anpassung durch die dargestellten Feld-EPSP-Steigungen sollte kleiner als 0,5 sein.Bestimmen Sie die Änderungen der grundlegenden synaptischen Eigenschaften mithilfe von gepaarten Pulsstimuli und der Konstruktion von Stimulus-/Antwort-Input-/Output-Kurven. Legen Sie für den Paired-Puls-Test eine Reihe von Paired-Puls-Pulsen mit einem Interpulsintervall von 50 Millisekunden bei 0,033 Hertz an. Wenden Sie für die Eingabe-/Ausgangskurven eine Reihe steigender Stimulusintensitäten von 0,0 bis 0,24 Millisekunden bei 0,033 Hertz an, um die Änderung der EPSP-Antwortgröße im Feld darzustellen.Um langfristige Depressionen zu untersuchen, die in erster Linie von der Aktivierung des CB1-Rezeptors abhängen, werden 6.000 Impulse bei 10 Hertz verwendet. Für Aufnahmen nach der Konditionierung setzen Sie die Aufnahmen für weitere 60 Minuten mit Einzelimpulsstimulationen von 0,12 Millisekunden bei einer Frequenz von 0,067 Hertz fort. Verabreichen Sie nach der Aufzeichnung nach der Konditionierung die gepaarten Pulsstimuli, gefolgt von einer Eingangs-/Ausgangskurve.Vergleichen Sie diese mit Baseline-Aufzeichnungen, um beobachtete Veränderungen der präsynaptischen Freisetzungseigenschaften zu beobachten und den Zustand der Scheibe für Langzeitaufzeichnungen zu beurteilen. Halten Sie sich bei der Analyse an die Ausschlusskriterien zur Bestimmung der Datenretention von einzelnen Schichten im Datensatz zur präsynaptischen Plastizität. Schließen Sie Ausschnitte aus, die eine große Neigung in einer Linie mit der besten Anpassung der Feld-EPSP-Neigungen während der Basislinie vor der Konditionierung, Instabilität in der Basislinie für die Vorkonditionierung und Instabilität in der Periode nach der Konditionierung aufweisen.Zu Beginn der Studie zeigte das neurologische Beurteilungsprotokoll (NAP-Score) keinen Unterschied zwischen Schein- und wiederholten mSHT-Ratten. Nach allen wachen Sitzungen mit geschlossenen Kopfverletzungen zeigten die wiederholten mSHT-Ratten signifikante Beeinträchtigungen innerhalb der NAP-Aufgaben im Vergleich zu Scheinaufgaben, was darauf hindeutet, dass subtile, aber signifikante Verhaltensdefizite hervorgerufen wurden. Es wurde eine Reihe von gepaarten Pulsen verabreicht und das Verhältnis der Größe des zweiten Feldes EPSP relativ zum ersten Feld-EPSP berechnet.Die Paar-Puls-Verhältnisse unterschieden sich nicht zwischen Schein- und wiederholten mSHT-Ratten, was zeigt, dass wiederholte mSHT-Ratten die grundlegende synaptische Physiologie im MPP-Eingang zum Gyrus dentatus nicht veränderten. Wenn ein 10-Hertz-Protokoll verabreicht wurde, um eine langfristige Depression zu induzieren, kam es zu einer vorübergehenden, aber signifikanten Abnahme der Kapazität des MPP-Eingangs in den Gyrus dentatus, am ersten Tag nach der Verletzung eine langfristige Depression aufrechtzuerhalten. Am siebten Tag nach der Verletzung zeigten Schichten von Scheintieren und Tieren mit wiederholtem mSHT jedoch eine äquivalente Langzeitdepression, obwohl es einen leichten Trend gab, dass Tiere mit wiederholtem mSHT eine Zunahme der Langzeitdepression aufwiesen.Die Planung des Präparier- und Schneideprozesses im Voraus ist entscheidend für die erfolgreiche Herstellung lebensfähiger Hippocampusschnitte und die Erzielung stabiler elektrophysiologischer Aufzeichnungen. Mit diesem Verfahren wird eine stabile experimentelle Plattform geschaffen, mit der die Pathophysiologie von SHT untersucht und neue Therapieansätze entwickelt werden können. Die Bewegung von der Entnahme des Gehirns bis zur Positionierung zum Einschneiden des komprimierten Films für transversale Hippocampusschnitte ist wichtig, ebenso wie die genaue Platzierung der Elektroden im Gyrus dentatus.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Untersuchungen über Veränderungen der hippokampalen Schaltung Funktion Nach Mild Traumatic Brain Injury

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Eine Methode, um geschlossene Kopftraumatische Hirnverletzung in Verursacht<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

A Novel In Vitro Model of Blast Traumatic Brain Injury

Eine neuartige In-vitro- Modell von traumatischen Hirnverletzungen Blast

Traumatic brain injury is a leading cause of death and disability in military and civilian populations. Blast traumatic brain injury results from the ...

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Untersuchung von Veränderungen in Caecum Microbiota nach traumatischen Hirnverletzungen bei Mäusen

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Advanced Diffusion Imaging im Hippocampus von Ratten mit leichter traumatischer Hirnverletzung

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Murine Model of Controlled Cortical Impact for the Induction of Traumatic Brain Injury

Murine Modell der kontrollierten kortikalen Auswirkungen für die Induktion von traumatischen Hirnverletzungen

The Centers for Disease Control and Injury Prevention estimate that almost 2 million people sustain a traumatic brain injury (TBI) every year in the ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Low-Intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-Head Mild Traumatic Brain Injury bei Nagetieren

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

A Metric Test for Assessing Spatial Working Memory in Adult Rats Following Traumatic Brain Injury

Ein metrischer Test zur Beurteilung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses bei erwachsenen Ratten nach traumatischer Hirnverletzung

Impairments to sensory, short-term, and long-term memory are common side effects after traumatic brain injury (TBI). Due to the ethical limitations of ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Elektromagnetisch gesteuertes Closed-Head-Modell für leichtes Schädel-Hirn-Trauma bei Mäusen

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...