Name: enrichment of adult mouse dorsal root ganglia neuron cultures by immunopanning
Uploaded: 2023-02-24T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פרויקט מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (FRN-162434) ומענק גילוי מהאגודה לטרשת נפוצה של קנדה (EGID-3761). המחברים רוצים להודות לד"ר סאן ולמכון קרוס סרטן על ההכשרה והשימוש במערכת ImageXpress.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אלברטה (פרוטוקול 0000274).
1. הכנת מגיב
<ol><li>ליום הראשון, הכינו את הריאגנטים הבאים: מים בדרגת תרבית תאים; פולי-D-ליזין-להכין מלאי על ידי הרכבה מחדש של הבקבוק כולו ב 50 מ"ל של מים כיתה תרבית לר...

<ol>
	<li>Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dorsal+root+ganglia.">Human dorsal root ganglia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 271 (2019).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).</li><li>Lin, Y. T., Chen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal+root+ganglia+isolation+and+primary+culture+to+study+neurotransmitter+release.">Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release.</a> Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Nolle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+Glial+Cells+From+Human+Post-mortem+Tissue+for+Transcriptome+and+Proteome+Analysis+Using+Immunopanning.">Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+and+troubleshooting+immunopanning+protocols+for+purifying+neural+cells.">Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).</li><li>Zuchero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+dorsal+root+ganglion+neurons+from+rat+by+immunopanning.">Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).</li><li>Sommer, I., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+(O1+to+O4)+to+oligodendrocyte+cell+surfaces:+an+immunocytological+study+in+the+central+nervous+system.">Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system.</a> Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).</li><li>Sommer, I., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+that+are+O4+antigen-positive+and+O1+antigen-negative+differentiate+into+O1+antigen-positive+oligodendrocytes.">Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes.</a> Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).</li><li>Hanani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia:+from+form+to+function.">Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function.</a> Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).</li><li>Viveiros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-cell+labeling+coupled+to+direct+analysis+of+extracellular+vesicles+in+the+conditioned+medium+to+study+extracellular+vesicles+secretion+with+minimum+sample+processing+and+particle+loss.">In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss.</a> Cells. 11 (3), 351 (2022).</li></ol>

פרוטוקול אימונופנינג זה מגדיל את שיעור התאים העצביים בתרביות ראשוניות של DRG. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, דיסקציות צריך להיעשות במועד, DRGs צריך להיות גזוז של עצבים עודפים. שלב הדיסוציאציה צריך להיות מנוטר בקפידה, ולא יעלה על 1 שעות, כדי למנוע את התאים מתח מיותר. לגבי האימונופנינג באופן ספציפי...

גרעיני השורש הגבי (DRGs) מאכלסים את גופי התאים של נוירוני החישה אשר מעצבבים רקמות היקפיות. חקר תאי העצב האלה מאפשר לנו להבין את היסודות המכניסטיים של כאב ותנאים חושיים. אולם DRGs אינם מורכבים מתאי עצב בלבד, אלא מכילים גם פיברובלסטים, תאי שוואן, מקרופאגים ותאי חיסון אחרים1. למרות נוכחותם של סוגי תאים שונים אלה, תרביות DRG שלמות מכונות לעתים קרובות בספרות נוירונים 2,3. תרביות אלה עדיין שימושיות לחקירה עצבית על ידי הדמיה או ציטומטריית זרימה, אשר תאפשר זיהוי עצבי על ידי צביעה, גודל התא ו / או מורפולוגיה. עם זאת, עבור בדיקות כגון תגובת שרשרת פולימראז (PCR) או כתם מערבי, שבו תרביות הומוגניות עבור RNA או איסוף חלבונים, נוכחות של סוגי תאים שאינם עצביים עלולה להפריע לתוצאות. לפיכך, יש צורך להגדיל את חלקם של תאים עצביים בתרביות DRG.
אימונופנינג היא טכניקה המשמשת לטיהור מגוון סוגי תאים, כולל נוירונים בקליפת המוח, אסטרוציטים, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ותאי מיקרוגליה. במילים פשוטות, הוא כרוך בהדבקת נוגדן כנגד סמן פני התא לצלוחית פטרי, שנועד לקשור תאים מסוימים (איור 1), וניתן להשתמש בו כדי לבחור בעד או נגד סוגי תאים בעלי עניין 4,5,6. DRG עוברי חולדה אימונופנינג לבחירה כנגד תאים שאינם עצביים תואר בעבר על ידי Zuchero7. עם זאת, לא הצלחנו למצוא פרוטוקול אימונופנינג ספציפי ל- DRG של עכברים. בפרוטוקול הזה אנו מתבססים על הדיירים הבסיסיים של פרוטוקול Zuchero, אולם במקום זאת התאמנו את רצף האימונופנינג כדי להעשיר תרביות DRG של עכברים בוגרים (איור 2). זהו כלי רב עוצמה לחקר נוירונים חושיים מבוססים בתרבית. יש לו יתרון מכיוון שהוא מאפשר שימוש בעכברים בוגרים ממודלים גנטיים, מחלות ופציעות, כך שניתן יהיה לחקור את תאי העצב החושיים שלהם באופן ספציפי יותר.
פרוטוקול זה מועיל לקוראים המעוניינים להגדיל את שיעור תאי העצב בתרביות DRG של עכברים בוגרים. עם זאת, ניתן גם להשמיט את שלבי האימונופנינג, ופרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור תרביות DRG שלמות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 um Syringe filters</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>723-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dishes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well black glass-bottom plates</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P24-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um cell strainer</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>15-1070-1(BI)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27+ supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3582801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction &#8805;98%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4161</td>
			<td>for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, &#8805;99%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 antibody</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002007</td>
			<td>for stemxyme solution and panning buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6267</td>
			<td>for DNAse solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper P8 grade</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>09-795K</td>
			<td>for 8% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-005-020</td>
			<td>for O4 dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-rabbit 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-005-003</td>
			<td>for PDGFRB dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat-anti-rat IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-005-044</td>
			<td>for CD45 dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS -/-</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>14175145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laminin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 antibody</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Hybridoma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovomucoid trypsin inhibitor</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>LS003086</td>
			<td>for low ovo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde prills</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>441244</td>
			<td>for 8% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGFRB antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB32570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/ streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P8783</td>
			<td>for SATO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine dihydrochrloride&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td>for SATO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S374-1</td>
			<td>for 0.2 M PB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>04269</td>
			<td>for 0.2 M PB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Selenite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5261</td>
			<td>for SATO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemxyme I</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>LS004107</td>
			<td>for tissue dissociation; combination collagenase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1147</td>
			<td>for SATO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;3-Tubulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of adult mouse dorsal root ganglia neuron cultures by immunopanning

גרעיני שורש דורסלי (DRGs) הם מבנים היקפיים הסמוכים לקרן הגבית של חוט השדרה, המאחסנים את גופי התא של נוירונים חושיים, כמו גם סוגים שונים של תאים אחרים. פרוטוקולי תרבית שפורסמו מתייחסים לעתים קרובות לתרביות DRG מנותקות שלמות כנוירונים, למרות נוכחותם של פיברובלסטים, תאי שוואן, מקרופאגים ולימפוציטים. בעוד תרביות DRG שלמות אלה מספיקות ליישומי הדמיה שבהם ניתן להבחין בתאי עצב בהתבסס על מורפולוגיה או צביעה, הומוגנטים של חלבונים או RNA שנאספו מתרביות אלה אינם בעיקר עצביים במקורם. כאן, אנו מתארים רצף אימונופנינג עבור DRG עכברים בתרבית. מטרת שיטה זו היא להעשיר תרביות DRG עבור תאי עצב על ידי הסרת סוגי תאים אחרים. אימונופנינג מתייחס לשיטה להסרת סוגי תאים על ידי היצמדות נוגדנים לצלחות תרבית תאים. באמצעות הכלים האלה אנו יכולים לבחור באופן שלילי ולהפחית את מספר הפיברובלסטים, תאי מערכת החיסון ותאי השוואן בתרבית. שיטה זו מאפשרת לנו להגדיל את אחוז תאי העצב בתרביות.

התאים הקבועים המוכתמים ב- DAPI וב- β3-tubulin צולמו לאחר מכן באמצעות מערכת סינון קונפוקלית בעלת תוכן גבוה. התמונות נותחו באמצעות תוכנה מסחרית מתאימה כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים ל-DAPI שתויגו יחד עם β3-tubulin (איור 3). בתרביות DRG שלמות נמצאו 42.36% ± 6.4% צביעת β3-טובולין, ובתרביות DRG אימונ...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning at JoVE.com

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

מאמר זה מתאר פרוטוקול אימונופנינג עבור גרעיני שורש גביים של עכברים בוגרים. על ידי היצמדות נוגדנים לצלחות תרבית, אנו יכולים לבחור ולהסיר באופן שלילי תאים שאינם עצביים. אנו מראים כי התרביות מועשרות עבור תאי עצב באמצעות פרוטוקול זה, המאפשר מחקר מעמיק של תגובות עצביות למניפולציה.

העשרת תרביות נוירונים של גרעיני שורש גבי של עכבר בוגר על ידי אימונופנינג

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...

פרוטוקול זה מאפשר לנו לשפר את מספר תאי העצב בתרביות גרעיני שורש גביים של עכברים בוגרים. זה עשוי לעזור לקבוע את התרומה של תאים עצביים לתגובה נתונה. הוספנו שלב אימונופנינג לפרוטוקול תרבית DRG בסיסי.היתרון העיקרי הוא לבחור נגד תאים שאינם עצביים. אם אתה חדש בתרבויות DRG ראשוניות, עדיף לתרגל דיסקציות כדי לקבל כמה שיותר DRGs, ולקצץ כמה שיותר מהעצב. כדי להתחיל, שואפים את פולי-D-ליזין המשמש לציפוי צלחת התרבית, ולשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם מים תרבית רקמות.הטו את המכסה פתוח ואפשרו למשטח להתייבש לחלוטין. מרחו מספיק למינין על הצלחת כדי לצפות את תחתית כל באר, והניחו אותו באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את כלי הגלילה שהוכנו בעבר של CD45, PDGFR-beta ו-O4 עם D-PBS.עבור צלחת CD45, להוסיף 5 מיליליטר של 0.2% BSA ו 20 מיקרוליטר של נוגדן CD45 ראשוני. עבור צלחת PDGFR-beta, יש להוסיף 15.2 מיקרוליטר של PDGFR-beta לצלחת המכילה 0.2% BSA. עבור צלחת O4, הוסף 2 מיליליטר של O4 hybridoma ל 3 מיליליטר של 0.2% BSA, ועוד 100 מיקרוליטר של 4% BSA, כדי להבטיח את ריכוז BSA הסופי נשאר על 0.2% לאחר מכן, לחורר את העכבר עם 30 מיליליטר של 0.9% מלוחים קרים כקרח.שימו לב לשינוי בצבע הכבד כדי להבטיח זילוח. הצמד את הכפות הקדמיות והאחוריות לשלב קלקר, והשתמש בסכין גילוח נקי כדי לחשוף את עמוד השדרה מאחור. בצע כריתת למינקטומיה על ידי ביצוע חתכים בערך באמצע הדרך משני צדי עמוד השדרה הגבי, הסרת החצי הגבי של העמוד כדי לחשוף את חוט השדרה.או לחתוך בעדינות את העצבים ולהסיר את חוט השדרה, או בעדינות לדחוף את החוט הצידה, שמירה על שלמות העצבים. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש בשורשי עצב עמוד השדרה כדי למצוא ולהסיר את כל גרעיני השורש הגבי, או DRGs, משני צדי עמוד השדרה. חתוך את פסולת העצבים מכל DRG כאשר הוא מוסר, שכן יותר פסולת עצבית בתרבית עלולה להוביל להישרדות ירודה.אספו את ה-DRGs ב-15 מיליליטר HBSS בצינור חרוטי על קרח, ואפשרו להם לשקוע לקרקעית. באמצעות פיפטה, לשאוב את רוב HBSS מן DRGs, ולהשאיר כ 100 מיקרוליטר של נוזל בצינור, כדי למנוע לאבד את הרקמה. שטפו שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של HBSS, והוסיפו 5 מיליליטר של תמיסת STEMxyme עובדת שהופשרה בעבר לרקמה.מכסים את המכסה בסרט שקוף, וצפים את הצינור על צדו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס, למשך שעה. לאחר הדגירה עם האנזים, להוסיף 1 מיליליטר של תמיסת מעכב ovomucoid נמוך לצינור. שלשו את התאים בעדינות עם פיפטה P1000 10 עד 15 פעמים, ואפשרו לגושי הרקמה להתיישב.לאחר מכן מעבירים את 2 עד 3 המיליליטר העליונים של התמיסה המכילה תאים מנותקים לתמיסת אובומוקואיד נמוכה טרייה, וחוזרים על הפעולה עד שהרקמה מנותקת לחלוטין, ולא נשארים גושים נראים לעין. צנטריפוגה את הצינור במשך 10 דקות ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופרנאטנט באמצעות פיפטה, כפי שהודגם קודם לכן, יש להשהות מחדש את כדורית התא במיליליטר אחד של חיץ גלילה, ולערבב פיפטה בעדינות.הרטיבו מראש מסננת תאים של 70 מיקרומטר עם חיץ גלילה של 1 מיליליטר מעל צינור חרוטי של 50 מיליליטר, ולאחר מכן סננו את תמיסת התא דרך מסננת התא. לשטוף את הצינור עם 1 מיליליטר של חיץ panning, ולהעביר אותו דרך מסננת. לשכבות תאים, הוסיפו 2 מיליליטר של 15% BSA וציפו בעדינות את דפנות הצינור הסגור.כדי להסיר את פסולת המיאלין, שכב בזהירות את תרחיף התא מיליליטר אחד בכל פעם על ידי pipetting על הצד של הצינור, על גבי כרית BSA. צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, עם האצה איטית והאטה. שכבת המיאלין האמצעית מראה פתיתים של חומר לבן.באמצעות פיפטה P1000, להסיר את הנוזל השקוף על גבי, את שלב המיאלין שביניהם, ואת BSA, מיליליטר אחד בכל פעם, משאיר כ 100 מיקרוליטר כדי לא להפריע את הכדור. לשליפת אנטיגן, הוסיפו 5 מיליליטר של חיץ פנורמי ודגרו על הצינור באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס ו-10% פחמן דו חמצני למשך 30 עד 45 דקות. לאחר מכן, לשטוף את צלחת CD45 מודגר שלוש פעמים עם D-PBS, ויוצקים את השטיפה הסופית.לאחר מכן יוצקים את השעיית התא לתוך צלחת CD45. לדגור על המנה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, לערבל בעדינות במרווחים של 10 דקות כדי לאפשר לתאים לקבל גישה שווה לנוגדן. נערו בעדינות את צלחת CD45 והעמידו אותה בזווית.בזהירות פיפטה 1 מיליליטר של תרחיף התא מעל המנה, כדי לאסוף תאים לא קשורים. לאחר מכן העבירו אותו לצלחת PDGFR-beta, שנשטפה בעבר שלוש פעמים עם D-PBS, ודגירה. מעבירים את התאים הלא קשורים מצלחת PDGFR-beta לצלחת O4, כפי שהודגם קודם לכן, ודורים על הצלחת.לאחר הדגירה, להעביר את השעיה התא צינור חרוטי 15 מיליליטר צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות. משעים מחדש את התאים בנפח הרצוי, ומדללים ליחס של 1:1 עם כחול טריפאן לקיום התא. באמצעות המוציטומטר, לספור את התאים בינוניים עד גדולים.מוציאים את הלמינין ומיד לוחצים את התאים בצפיפות הרצויה, מבלי לאפשר להם להתייבש לפני הדגירה על הצלחת. תרביות ה-DRG הקבועות, השלמות והאימונופוניות הוכתמו בבטא3-טובולין עבור תאי עצב ו-DAPI עבור כל הגרעינים. בתרביות DRG שלמות נקבע צביעה של כ-42.36% בטא3-טובולין, ובתרביות DRG מדומוניות נקבע צביעה של כ-71.44% בטא3-טובולין, מה שחושף עלייה משמעותית בהעשרה העצבית עם אימונופנינג.טיפול ברקמה בזהירות הוא מאוד חשוב. טיפול עדין ב- DRGs, חיתוך עצב עודף, וזהירות לא להתסיס או לאבד רקמות ותרבית הם כולם חיוניים להיות מודעים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

הכרומטין immunoprecipitation מרקמות השורש הגבי הגרעינים בעקבות פציעה axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

הדמיה חיה של אקסונים לאחר רוט הגבי Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

מדידת השדרה Presynaptic עיכוב בעכברים על ידי הקלטה פוטנציאלית הגבי רוט<em&gt; בVivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

גב שורש הגרעינים עצב ותאי גזע שמקורם בשומן Differentiated:<em&gt; במבחנה</em&gt; משותף תרבות דגם לחקר התחדשות של עצבים היקפיים

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

שחול הידראולי של קורד ובידוד השדרה של גרעיני שורש הגבה במכרסמים

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

הזרקת גנגליון שורש הגבה ו שורש הגבה Crush פגיעה כמודל להתחדשות החושית אקסון

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

בידוד גרעיני הבסיס העזוב והתרבות העיקריים ללמוד שחרור נוירוטרנסמיטר

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

התחדשות האקסון בתרבית של החוקר: In Vivo אלקטרופורציה של העכבר למבוגרים העזוב שורש גנגליון

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...