Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة DP2DK116645 (إلى BSS) ، وجائزة مؤسسة Dunn التجريبية ومنحة NASA 80NSSC22K0250 (إلى BSS). تم دعم هذا المشروع أيضا من قبل مركز قياس الخلايا وفرز الخلايا في كلية بايلور للطب بتمويل من جائزة دعم المرافق الأساسية CPRIT (CPRIT-RP180672) ، والمعاهد الوطنية للصحة (S10 OD025251 و CA125123 و RR024574) ، ومساعدة جويل إم سيديرستروم ، بالإضافة إلى منحة الأجهزة لمنحة LPS NIH (S10 OD025251). تم توفير بعض السلالات من قبل CGC ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440).

1. تحضير خليط الميكروبيوم
<ol><li>قم بختم أو إخراج البكتيريا من مخزون مجمد الجلسرين على طبق مرق الليزوجيني (LB) ، أو وسط نمو مناسب ، وتنمو طوال الليل عند درجة حرارة مثالية بناء على السلالات البكتيرية ذات الأهمية (عادة 25 درجة مئوية للميكروبات الطبيعية C. elegans ).</li>
	<li>من صفيحة LB ، استخ...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

تم استخدام قياس التدفق الدودي لتوصيف جينات C. elegans ومساراتها ضد استعمار مسببات الأمراض والسمية في العديد من الدراسات21،22. هنا ، يتم تقديم نهج قابل للتعديل عالي الإنتاجية يستخدم C. elegans للتحقيق في كيفية تعديل الميكروبات المعوية لفسيولوجيا مضيفها. بال...

تطور تحت تأثير ميكروبي مستمر1. من الميكروبات المتنوعة في البيئة ، يكتسب مضيفو شركاء محددين2 يوسعون قدرات المضيف ويقودون فسيولوجيته وقابليته للإصابة بالأمراض3. على سبيل المثال ، كشفت التحليلات الميتاجينومية لميكروبيوم الأمعاء عن فئات أيضية غنية للجينات الميكروبية التي قد تمنح قدرا أكبر من حصاد الطاقة وتخزينها في الفئران البدينة4 ، والتي يوجد الكثير منها أيضا في ميكروبيوم الأمعاءالبشرية 5. لا تزال هناك حاجة كبيرة لإقامة علاقات سببية وتحديد المحددات الجزيئية لتأثير الميكروبيوم ، على الرغم من إعاقة التقدم بسبب تعقيدات الميكروبيوم وقابلية الأنظمة المضيفة للفحص على نطاق واسع.
يوفر الكائن الحي النموذجي C. elegans منصة لتعزيز الفهم الجزيئي للروابط بين الميكروبيوم وفسيولوجيا المضيف. تمتلك C. elegans 20 خلية معوية ذات طبقة مخاطية وهياكل زغبية. تم تجهيز هذه الخلايا بجينات مستقبلات كيميائية وفيرة تستشعر المنتجات الميكروبية وتنتج جزيئات مضادة للميكروبات يحتمل أن تنظم مستعمرات الأمعاء 6,7. أدت هذه البيولوجيا المحفوظة ل C. elegans إلى عدد هائل من الاكتشافات في إشارات المضيف التي تنظم ميكروبات الأمعاء ، بما في ذلك إشارات الأنسولين ، TGF-beta ، و MAP Kinase8،9،10.
تستخدم C. elegans الميكروبات كنظام غذائي للنمو أثناء التطور والميكروبيوم كبالغين. مع الشيخوخة ، قد تتراكم بعض الميكروبات بشكل مفرط في تجويف الأمعاء وتتحول العلاقة بين المضيف والميكروب من التكافل إلى التسببفي المرض 11. في موائلها الطبيعية ، تواجه C. elegans مجموعة واسعة من الأنواع البكتيرية12,13. كشف تسلسل 16S rDNA من العينات التمثيلية التي تم جمعها في الموائل الطبيعية (الفواكه الفاسدة ، وجذع النبات ، وناقلات) أن الميكروبيوم الطبيعي ل C. elegans تهيمن عليه أربع شعب بكتيرية: Proteobacteria و Bacteroidetes و Firmicutes و Actinobacteria. ضمن هذه التقسيمات يكمن تباين كبير في تنوع وثراء البكتيريا على أساس الموائل12،13،14،15. تم إنشاء العديد من المجتمعات المحددة ، بما في ذلك مجموعات 63 عضوا (BIGbiome) 16 و 12 عضوا (CeMbio) التي تمثل أفضل أجناس الميكروبيوم التي تم إنشاؤها لمجتمع أبحاث C. elegans 17. يمكن أن يكون لكل من الميكروبيوم وسلالات المكونات تأثير متنوع على فسيولوجيا C. elegans مثل حجم الجسم ومعدلات النمو واستجابات الإجهاد9،16،17. توفر هذه الدراسات موارد وأمثلة لتأسيس C. elegans كنموذج لأبحاث الميكروبيوم.
هنا يتم تقديم سير عمل قائم على فارز الجسيمات الكبير (LPS) (الشكل 1) يستخدم نظام C. elegans لقياس تكوين الميكروبيوم والمقاييس الأساسية لفسيولوجيا المضيف على نطاق السكان في وقت واحد. من الجانب الميكروبي ، فإن سير العمل قابل للتكيف لتجميع ميكروبيوم محدد أو ميكروبات مفردة لاختبار متانة ومرونة المجتمع مع زيادة التفاعلات الميكروبية. من جانب المضيف ، يتيح سير العمل فحوصات عالية الإنتاجية لقياس مستويات استعمار الميكروبات الفلورية في الميكروبيوم والقراءات الفسيولوجية للمضيف من حيث التطور وحجم الجسم والتكاثر. مجتمعة ، يتيح نموذج الميكروبيوم C. elegans شاشات عالية الإنتاجية لتحديد المحددات الأيضية والجينية التي تعدل فسيولوجيا المضيف.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

يمكن أن يكون لتكوين ميكروبيوم الأمعاء تأثير كبير على فسيولوجيا المضيف طوال فترة تطور وحياة. يعد قياس التغيرات التركيبية في الميكروبيوم أمرا بالغ الأهمية في تحديد العلاقات الوظيفية بين هذه التغيرات الفسيولوجية. برز Caenorhabditis elegans كنظام مضيف قوي لفحص الدوافع الجزيئية لتفاعلات الميكروبيوم المضيف. بفضل مخطط جسمه الشفاف والميكروبات الطبيعية الموسومة بالفلورسنت ، يمكن بسهولة قياس المستويات النسبية للميكروبات داخل ميكروبيوم الأمعاء لحيوان C. elegans الفردي باستخدام فارز جسيمات كبير. نصف هنا إجراءات الإعداد التجريبي للميكروبيوم ، وجمع وتحليل مجموعات C. elegans في مرحلة الحياة المرغوبة ، وتشغيل وصيانة الفرز ، والتحليلات الإحصائية لمجموعات البيانات الناتجة. نناقش أيضا اعتبارات تحسين إعدادات الفرز بناء على الميكروبات ذات الاهتمام ، وتطوير استراتيجيات بوابات فعالة لمراحل حياة C. elegans ، وكيفية الاستفادة من قدرات الفرز لإثراء مجموعات بناء على تكوين ميكروبيوم الأمعاء. سيتم تقديم أمثلة على التطبيقات المحتملة كجزء من البروتوكول ، بما في ذلك إمكانية قابلية التوسع للتطبيقات عالية الإنتاجية.

تحديد بوابات السكان البالغين واليرقات هنا ، تمت زراعة C. elegans L1s المتزامنة على صفيحة NGM المصنفة ب E. coli OP50 (Eco) ، وهو نظام غذائي مختبري قياسي. تم جمع مجموعات C. elegans لتحليل LPS بعد 96 ساعة أو 120 ساعة من النمو عند 20 درجة مئوية (الشكل 2 أ). مخطط نقطي للانقراض (EXT ، و...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans هو نموذج قوي لفحص المحددات الجزيئية التي تقود تفاعلات الميكروبيوم المضيف. نقدم خط أنابيب عالي الإنتاجية يحدد مستويات الواحد لاستعمار ميكروبيوم الأمعاء جنبا إلى جنب مع الجوانب الرئيسية لفسيولوجيا C. elegans.

تطبيق قياس تدفق الفيرميمتر لتحديد وتحليل ميكروبيوم الأمعاء Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

يلعب ميكروبيوم الأمعاء أدوارا مهمة في تشكيل فسيولوجيا المضيف. يسمح هذا البروتوكول ، على وجه الخصوص ، بتقييم الإنتاجية العالية لمستويات استعمار ميكروب الأمعاء الفلورية في الخلوية المفردة على نطاق واسع. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لهذه الطريقة في القدرة على مراقبة ميكروبيوم الأمعاء للحيوانات الحية في الوقت الفعلي ، مما يسمح بتحديد وربط أي تغييرات مع فسيولوجيا المضيف.ستوضح دانا بلاكبيرن ، وهي باحثة مشاركة من مختبري. ابدأ بغسل الديدان من العشب البكتيري بواحد إلى ملليلتر من M9-TX. نقل الديدان إلى لوحة معقمة 2 ملليلتر 96 بئر عميقة.بيليه لهم في 300 غرام لمدة دقيقة واحدة وإزالة السائل باستخدام مشعب النضوء. باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 1.2 ملليلتر ، أضف 1.8 ملليلتر من M9-TX إلى كل بئر من صفيحة البئر العميقة الممزوجة بالسحب عدة مرات وأجهزة الطرد المركزي عند 300 جرام لمدة دقيقة واحدة. بعد الغسيل النهائي ، ارفع الحجم في كل بئر إلى 100 ميكرولتر ، باستخدام مشعب الاستنشاق.أضف 100 ميكرولتر من 10 مليمول ليفاميزول و M9-T إلى كل بئر ، واترك الديدان تشل لمدة خمس دقائق. ثم أضف محلول التبييض بنسبة 4٪ إلى كل بئر لمدة دقيقتين لتقليل الكتل البكتيرية. بعد معالجة المبيض ، أضف M9-TX في كل بئر من اللوحة لغسل الديدان.أجهزة الطرد المركزي لوحة ونضح إلى حجم نهائي من 100 ميكرولتر بعد الغسيل الثاني. نقل الديدان إلى لوحة بئر مسطحة القاع 96 ، تحتوي على 150 ميكرولتر من 10 مليمول من ليفاميزول و M9-TX. حافظ على كثافة الدودة عند 50 إلى 100 دودة لكل بئر وقسم الديدان إلى آبار متعددة إذا كان السكان مزدحمين للغاية.قم بتشغيل ضاغط الهواء والكمبيوتر وأداة LPS. افحص وأفرغ خزان النفايات. افحص وأعد ملء الغلاف وخزانات المياه إذا كان الحجم منخفضا.تأكد من أن مجموعة النواة السائلة والبصرية 250 ميكرومتر في مكانها. قم بتوصيل وتشغيل أخذ العينات التلقائي. افتح برنامج أداة أخذ العينات الأوتوماتيكية لفتح جهاز أخذ العينات التلقائي وبرنامج LPS.في نافذة برنامج LPS ، انتقل إلى ملف وانقر فوق تجربة جديدة ، ثم حدد ملف مرة أخرى وانقر فوق فحص عينة جديدة. قم بتمكين الليزر من تشغيل ليزر 488 و 561 نانومتر إذا لم يتم ذلك بالفعل. الآن قم بإنشاء قوالب لمخططات نقاط الاستحواذ ، باستخدام وقت الرحلة والانقراض وقنوات الفلورسنت في نافذة برنامج LPS.انقر بزر الماوس الأيمن داخل نص الرسم البياني لتعديل القياس. بعد ذلك ، قم بتحميل عينات التحكم. في نافذة أخذ العينات التلقائي، حدد prime، وانتقل إلى ملف، وانقر فوق فتح البرنامج النصي لتحديد البرنامج النصي المدمج الصحيح وانقر فوق موافق.انتقل إلى قالب اللوحة في قائمة برنامج أخذ العينات لتحديد الآبار المطلوبة للتحليل. بعد تحميل اللوحة وتثبيتها في مرحلة أخذ العينات التلقائي، اضغط على لوحة التشغيل في نافذة أخذ العينات الأوتوماتيكية واحفظ الملف عندما يطلب منك ذلك، ثم انقر فوق زر تخزين البيانات الحالية في الشريط العلوي في نافذة برنامج LPS واحفظ البيانات مرة أخرى. افتح برنامج LPS.انتقل إلى ملف وحدد تجربة جديدة، ثم ارجع إلى الملف وانقر على نموذج جديد. قم بإنشاء مخطط نقطي مع وقت الرحلة على المحور X والانقراض على المحور Y. قم بإنشاء مخطط نقطي آخر مع وقت الرحلة على المحور X والأحمر على المحور Y.تأكد من التحقق من تمكين الليزر لتنشيط ليزر 488 و 561 نانومتر. ضع أنبوب عينة التحكم على منفذ العينة، ثم انقر فوق اكتساب داخل مربع الحوار الحصول والاستغناء. عند المطالبة ، تأكد من حفظ الملف.بمجرد قياس عدد كاف من الديدان للتمييز بين المجموعات ، حدد إجهاض في الرسم البياني النقطي الذي يوضح وقت الرحلة مقابل الانقراض. ارسم بوابة حول المنطقة التي تمثل السكان البالغين. ثم انتقل إلى العرض ، وانقر فوق التسلسل الهرمي للبوابات وتحقق من أن بوابات الفلورسنت مدرجة بشكل صحيح ضمن بوابة السكان البالغين.في وقت الرحلة مقابل مخطط النقطة الحمراء ، قم بإنشاء بوابات حول مناطق القيمة الحمراء العالية والمنخفضة لتسليط الضوء على المناطق ذات الأهمية التي تظهر استعمار الميكروبيوم في الديدان البالغة. بمجرد تحسين الإعدادات ، انتقل إلى ملف وانقر فوق حفظ التجربة ، ثم انقر فوق ملف وحدد حفظ العينة. لتحميل جهاز التجميع ، حدد لوحة التحميل A للسماح لمرحلة التجميع بالانتقال إلى وضع مهيأ لتحميل إما أنبوب تجميع أو لوحة بئر 96.للاستغناء عن لوحة بئر 96 ، انتقل إلى قسم الإعداد وحدد الألواح ، ثم انقر فوق الألواح المعايرة واختر 96 لوحة بئر. بعد ذلك ، حدد الآبار التي سيتم فرز الديدان إليها وأدخل عدد الكائنات المراد فرزها في كل بئر. تأكد من تحديد المناطق المسورة ذات الأهمية أيضا.إذا كانت هناك مناطق متعددة مسورة يتم فرزها في نفس اللوحة ، فتأكد من تحديد المربع المحدد ببوابة كل بئر. انقر فوق موافق لحفظ التغييرات. بعد فرز الأرقام وتعيين المواقع ، قم بتحميل العينة على منفذ العينة وانقر على أزرار لوحة التعبئة من مربع حوار الاكتساب والتوزيع لبدء التوزيع في لوحة بئر 96.لوحظت قيم امتداد ووقت طيران أعلى عند البالغين مقارنة باليرقات. سيطرت مراحل L1 و L2 على ذرية البالغين من عمر يومين ، بينما وصلت معظم النسل من البالغين بعمر ثلاثة أيام إلى مرحلتي L3 و L4. عندما نمت على الإشريكية القولونية ، زاد وقت الرحلة وقيم التمديد في اليوم الثالث مقارنة باليوم الثاني.عندما نمت على ochrobactrum ، BH ثلاثة والثقافات المختلطة ، أظهرت ادعاءات cenor abdidas اختلافات في وقت الرحلة وقيم التمديد. لوحظت زيادة استعمار ochrobactrum BH3 في الحالة المختلطة مقارنة ب ochrobactrum BH3 وحده. في المقابل ، تشير القيم الفلورية الخضراء إلى انخفاض استعمار OP50 في الحالة المختلطة مقارنة ب OP50 وحده.تميل الديدان بشدة نحو المحور Y ، مما يشير إلى أن استعمار OP50 منخفض في معظم الديدان ، في حين أن مستويات ochrobactrum ، استعمار BH3 موزعة بالتساوي في السكان. كما لوحظت العلاقة بين ochrobactrum ومستويات استعمار BH3 وتطور المضيف مثل كثافة الجسم والاختلافات في أنماط التكاثر. أظهر البالغون البالغون من العمر ثلاثة أيام الذين نمت على مزيج عضوين ، الميكروبيوم مجموعة واسعة من كثافة RFP ، مما يشير إلى اختلافات فردية في استعمار ochrobactrum داخل المجموعة.يتم عرض صور RFP للآبار التي تحتوي على 15 دودة مصنفة وفردية من بوابات RFP العالية والمنخفضة. الشيء الأكثر أهمية هو تذكر استخدام عناصر التحكم المناسبة لجميع الخطوات للتأكد من أن البروتوكول والجهاز يعملان بشكل صحيح. في الوقت الفعلي ، يمكن استخدام ذات الميزات المحددة لعزل السلالات من برك الطفرة المضيفة أو الميكروبية لتحديد الجينات التي تنظم تفاعلات ما بعد الميكروب.يمكن أيضا استخدام المعزولة لتحليل المفردة أو المجمعات الظاهرية المخصبة القائمة على المصب ، مثل RNA-seq أو ما شابه. حقا ، الفرص لا حصر لها حقا.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

قياس انواع معينة ايليجانس الحياة سبان في 96 لوحات Microtiter حسنا

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

زراعة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في ثلاثة أبعاد في المختبر

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

التحديد الكمي لوفرة الدهن وتقييم توزيع الدهن في ايليجانس كاينورهابديتيس "الأحمر النيل" و "النفط تلطيخ س الأحمر"

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

استخدام Elegans Caenorhabditis إلى الشاشة لتفاعلات Chaperone الأنسجة محددة

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

عزل وتوصيف الجراثيم الطبيعية للنموذج الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

الفحص المجهري فائق الدقة للمجمع المشبكي داخل الخط الجرثومي Caenorhabditis elegans

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...