Name: application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome
Uploaded: 2023-03-31T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud DP2DK116645 (til BSS), Dunn Foundation pilotpris og NASA-tilskud 80NSSC22K0250 (til BSS). Dette projekt blev også støttet af cytometri og cellesorteringskerne ved Baylor College of Medicine med finansiering fra CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 og RR024574) og bistand fra Joel M. Sederstrom plus et instrumenteringstilskud til LPS NIH-tilskuddet (S10 OD025251). Nogle stammer blev leveret af CGC, som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Fremstilling af mikrobiomblanding
<ol><li>Stempel eller stribe bakterier ud fra en glycerol frysebestand på en lysogeny bouillon (LB) plade, eller passende vækstmedium, og vokse natten over ved en optimal temperatur baseret på bakteriestammer af interesse (typisk 25 ° C for C. elegans naturlige mikrober).</li>
	<li>Fra LB-pladen skal du bruge en enkelt koloni fra hvert bakterieisolat (f.eks. 12 bakterier i CeMbio-samlingen) til at inokulere 800 μL LB-medium i separate brønde med en 1 ...

<ol>
	<li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animals+in+a+bacterial+world,+a+new+imperative+for+the+life+sciences.">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li><li>Seedorf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+from+diverse+habitats+colonize+and+compete+in+the+mouse+gut.">Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut.</a> Cell. 159 (2), 253-266 (2014).</li><li>B&#228;ckhed, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut+microbiota+as+an+environmental+factor+that+regulates+fat+storage.">The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).</li><li>Turnbaugh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+obesity-associated+gut+microbiome+with+increased+capacity+for+energy+harvest.">An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest.</a> Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).</li><li>Gill, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+of+the+human+distal+gut+microbiome.">Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome.</a> Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans.">Chemosensation in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).</li><li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans.+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1,+an+ortholog+of+human+SARM.">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).</li><li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity.">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF&#946;/BMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals.">TGF&#946;/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li><li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+C.+elegansdaf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens.">Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921 (2003).</li><li>Cabreiro, F., Gems, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+need+microbes+too:+microbiota,+health+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).</li><li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., F&#233;lix, M. -. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats.">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+gateway+to+a+new+host-microbiome+model.">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).</li><li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments.">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research.">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut.">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li><li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource.">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>R Core. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Team+R:+A+language+and+environment+for+statistical+computing.">Team R: A language and environment for statistical computing.</a> R Core. , (2018).</li><li>Wickham, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> tidyverse. , (2019).</li><li>Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput,+high-content,+liquid-based+C.+elegans+pathosystem.">A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).</li><li>Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+separation+of+C.+elegans+variably+colonized+by+a+bacterial+pathogen.">Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).</li><li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+assessment+of+changes+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiome.">High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome.</a> Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).</li><li>Wiles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modernized+tools+for+streamlined+genetic+manipulation+and+comparative+study+of+wild+and+diverse+proteobacterial+lineages.">Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages.</a> mBio. 9 (5), 01877 (2018).</li><li>Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+engineering+of+the+mammalian+gut+microbiome+in+situ.">Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ.</a> Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+bee+gut+microbiome+bacteria+with+a+toolkit+for+modular+assembly+of+broad-host-range+plasmids.">Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).</li><li>Mok, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MIP-MAP:+High-Throughput+mapping+of+Caenorhabditis+elegans+temperature-sensitive+mutants+via+molecular+inversion+probes.">MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes.</a> Genetics. 207 (2), 447-463 (2017).</li></ol>

Flowvermimetri er blevet brugt til at karakterisere C. elegans gener og veje mod patogenkolonisering og toksicitet i flere undersøgelser21,22. Her præsenteres en høj gennemstrømningsmetode, der bruger C. elegans til at undersøge, hvordan tarmmikrobiomer modulerer deres værtsfysiologi. Sammenlignet med eksisterende metoder, der anvender kolonidannende enheder (CFU) eller 16S rRNA-ampliconsekventering 9,16,17,23,24<sup class="xre...

Dyrenes evolution er under konstant mikrobiel indflydelse1. Fra forskellige mikrober i miljøet erhverver dyreværter specifikke partnere2 , der udvider værtsens evner og driver dets fysiologi og modtagelighed for sygdom3. For eksempel afdækkede metagenomiske analyser af tarmmikrobiomet berigede metaboliske klasser af mikrobielle gener, der kan give større energihøst og lagring i overvægtige mus4, hvoraf mange også findes i det menneskelige tarmmikrobiom5. Der er stadig et stort behov for at etablere årsagssammenhænge og lokalisere de molekylære determinanter for mikrobiompåvirkningen, selvom fremskridt er blevet hæmmet af værtssystemernes mikrobiomkompleksitet og trækbarhed til storskala screening.
Modelorganismen C. elegans giver en platform til at fremme molekylær forståelse af forbindelser mellem mikrobiom og værtsfysiologi. C. elegans besidder 20 tarmceller med et slimhindelaget og villistrukturer. Disse celler er udstyret med rigelige kemoreceptorgener, der fornemmer mikrobielle produkter og producerer antimikrobielle molekyler, der potentielt regulerer deres tarmkolonisatorer 6,7. Denne bevarede biologi af C. elegans har ført til et enormt antal opdagelser i værtssignalering, der regulerer tarmmikrober, herunder insulinsignalering, TGF-beta og MAP Kinase 8,9,10.
C. elegans bruger mikrober som både deres kost til vækst under udvikling og mikrobiom som voksne. Med alderdom kan nogle mikrober overakkumulere i tarmens lumen, og værtsmikrobeforholdet skifter fra symbiose til patogenese11. I deres naturlige levesteder møder C. elegans en bred vifte af bakteriearter12,13. Sekventering af 16S rDNA fra repræsentative prøver indsamlet i naturlige levesteder (rådne frugter, plantestamme og dyrevektorer) afslørede, at det naturlige mikrobiom af C. elegans domineres af fire bakterielle phyla: Proteobakterier, Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria. Inden for disse opdelinger ligger stor variation i mangfoldigheden og rigdommen af bakterier baseret på habitatet12,13,14,15. Flere definerede samfund er blevet etableret, herunder samlingerne med 63 medlemmer (BIGbiome)16 og 12 medlemmer (CeMbio), der repræsenterer de øverste mikrobiomslægter, der er skabt til C. elegans-forskningssamfundet 17. Både mikrobiomer og komponentstammer kan have en forskellig indvirkning på fysiologien hos C. elegans, såsom kropsstørrelse, vækstrater og stressresponser 9,16,17. Disse undersøgelser giver ressourcer og eksempler til at etablere C. elegans som en model for mikrobiomforskning.
Her præsenteres en stor partikelsorteringsbaseret arbejdsgang (LPS) (figur 1), der udnytter C. elegans-systemet til samtidig at måle mikrobiomsammensætning og grundlæggende mål for værtsfysiologi på populationsskala. Fra den mikrobielle side kan arbejdsgangen tilpasses til at samle et defineret mikrobiom eller enkelte mikrober for at teste samfundets robusthed og plasticitet med stigende mikrobielle interaktioner. Fra værtssiden muliggør arbejdsgangen analyser med høj gennemstrømning for at måle koloniseringsniveauer af fluorescerende mikrober i mikrobiomet og være vært for fysiologisk aflæsning med hensyn til udvikling, kropsstørrelse og reproduktion. Samlet set muliggør C. elegans-mikrobiommodellen skærme med høj gennemstrømning for at lokalisere de metaboliske og genetiske determinanter, der modulerer værtsfysiologi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical bottom centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (1 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-11-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 deep-well plates (2 mL)</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Costar plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Standard bacteriology agar is also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirating manifold</td>
			<td>V&#38;P scientific</td>
			<td>VP1171A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Imaging Multimode Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Cytation 5</td>
			<td>Bacterial OD measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo scientific&#160;</td>
			<td>Sorvall Legend XTR</td>
			<td>For 96 well plate and conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data.</td>
			<td>R package</td>
			<td>Version 3.3.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Autosampler</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Particle Sorter</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td>COPAS Biosorter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Levamisole</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC187870100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysogeny Broth (LB)</td>
			<td>RPI</td>
			<td>L24066</td>
			<td>Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode Growth Medium</td>
			<td>RPI</td>
			<td>N81800-1000.0</td>
			<td>1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio</td>
			<td>GNU</td>
			<td>Version 1.3.1093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>5M NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 cm diameter petri dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of flow vermimetry for quantification and analysis of the caenorhabditis elegans gut microbiome

Sammensætningen af tarmmikrobiomet kan have en dramatisk indvirkning på værtsfysiologien gennem dyrets udvikling og liv. Måling af sammensætningsændringer i mikrobiomet er afgørende for at identificere de funktionelle forhold mellem disse fysiologiske ændringer. Caenorhabditis elegans er opstået som et kraftfuldt værtssystem til at undersøge de molekylære drivkræfter for værtsmikrobiominteraktioner. Med sin gennemsigtige kropsplan og fluorescerende mærkede naturlige mikrober kan de relative niveauer af mikrober i tarmmikrobiomet hos et individuelt C. elegans-dyr let kvantificeres ved hjælp af en stor partikelsorterer. Her beskriver vi procedurerne for eksperimentel opsætning af et mikrobiom, indsamling og analyse af C. elegans populationer i det ønskede livsstadium, drift og vedligeholdelse af sortereren og statistiske analyser af de resulterende datasæt. Vi diskuterer også overvejelser om optimering af sorteringsindstillinger baseret på mikrober af interesse, udvikling af effektive gatingstrategier for C. elegans livsstadier, og hvordan man udnytter sorteringskapacitet til at berige dyrepopulationer baseret på tarmmikrobiomsammensætning. Eksempler på potentielle applikationer vil blive præsenteret som en del af protokollen, herunder potentialet for skalerbarhed til applikationer med højt gennemløb.

Definition af voksne og larver population porte Her blev synkroniserede C. elegans L1'er dyrket på en NGM-plade podet med E. coli OP50 (Eco), en standard laboratoriediæt. C. elegans-populationer blev indsamlet til LPS-analyse efter 96 timer eller 120 timers vækst ved 20 °C (figur 2A). Et prikplot af udryddelse (EXT, en proxy for kropstæthed) versus flyvetid (TOF, en proxy for kropslængde) skaber to visuelt adskilte skyer af dyr. Hver prik ...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome at JoVE.com

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans er en kraftfuld model til at undersøge de molekylære determinanter, der driver værtsmikrobiominteraktioner. Vi præsenterer en pipeline med høj kapacitet, der profilerer de enkelte dyrs niveauer af tarmmikrobiomkolonisering sammen med nøgleaspekter af C. elegans fysiologi.

Anvendelse af flowvermimetri til kvantificering og analyse af Caenorhabditis elegans tarmmikrobiomet

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...

Tarmmikrobiomet spiller vigtige roller i udformningen af værtsfysiologien. Denne protokol giver især mulighed for vurdering af høj gennemstrømning af fluorescerende tarmmikrobekoloniseringsniveauer i enkelte, cellulære dyr i stor skala. En stor fordel ved denne metode er evnen til at overvåge tarmmikrobiomet hos levende dyr i realtid, hvilket gør det muligt at identificere og korrelation af eventuelle ændringer med værtens fysiologi.Demonstrere proceduren vil være Dana Blackburn, en forskningsassistent fra mit laboratorium. Begynd med at vaske ormene af bakterieplænen med en til to milliliter M9-TX. Overfør ormene til en steriliseret to milliliter 96 godt dyb plade.Pellet dem ved 300 G i et minut og fjern væsken ved hjælp af en aspireringsmanifold. Ved hjælp af en 1,2 ml flerkanalpipette tilsættes 1,8 ml M9-TX til hvert hul i den dybe brøndplade blandet ved pipettering et par gange og centrifugeres ved 300 G i et minut. Efter den sidste vask bringes volumenet i hver brønd til 100 mikroliter ved hjælp af aspireringsmanifolden.Tilsæt 100 mikroliter 10 millimolær levamisol og M9-T til hver brønd, og lad ormene lamme i fem minutter. Tilsæt derefter 4% blegemiddelopløsning til hver brønd i to minutter for at reducere bakterieklumper. Efter blegemiddelbehandlingen tilsættes M9-TX i hvert hul på pladen for at vaske ormene.Centrifuger pladen og aspirer til et slutvolumen på 100 mikroliter efter den anden vask. Overfør ormene til en fladbundet 96 brøndplade, der indeholder 150 mikroliter 10 millimol levamisol og M9-TX. Hold ormtætheden på 50 til 100 orme pr. Brønd og del ormene i flere brønde, hvis befolkningen er for overfyldt.Tænd for luftkompressoren, computeren og LPS-instrumentet. Kontroller og tøm affaldstanken. Kontroller og genopfyld kappe og vandtanke, hvis lydstyrken er lav.Sørg for, at den flydende og optiske kerneenhed på 250 mikrometer er på plads. Tilslut og tænd autosampleren. Åbn instrumentsoftwaren til autosampler for at åbne autosampleren og LPS-softwaren.I LPS-softwarevinduet skal du gå til fil og klikke på nyt eksperiment, derefter vælge fil igen og klikke på ny prøvekontrol. Aktivér lasere til at tænde 488 og 561 nanometer lasere, hvis det ikke allerede er gjort. Opret nu skabeloner til erhvervelsespunktplotter ved hjælp af flyvetid, udryddelse og fluorescerende kanaler i LPS-softwarevinduet.Højreklik i brødteksten i en graf for at ændre skaleringen. Indlæs derefter kontrolprøverne. I autosampler-vinduet skal du vælge prime, gå til fil, klikke på åbent script for at vælge det korrekte indbyggede script og klikke på okay.Gå til pladeskabelon i samplersoftwaremenuen for at vælge de ønskede brønde til analyse. Når du har indlæst og sikret pladen på autosampler-trinnet, skal du trykke på kør plade i autosampler-vinduet og gemme filen, når du bliver bedt om det, og derefter klikke på knappen Gem aktuelle data på det øverste bånd i LPS-softwarevinduet og gemme dataene igen. Åbn LPS-softwaren.Naviger til fil, vælg nyt eksperiment, gå derefter tilbage til filen, og klik på nyt eksempel. Opret et prikplot med flyvetidspunktet på X-aksen og udryddelsen på Y-aksen. Opret et andet prikplot med flyvetidspunktet på X-aksen og rødt på Y-aksen.Sørg for at kontrollere, at lasere aktiveres for at aktivere 488- og 561-nanometerlaserne. Placer kontrolprøveglasset på prøveporten, og klik derefter på Hent i dialogboksen Hent og dispenser. Når du bliver bedt om det, skal du sørge for at gemme filen.Når der er målt nok orme til at differentiere populationer, skal du vælge abort i prikplottet, der viser tidspunktet for flyvning versus udryddelse. Tegn en port rundt om området, der repræsenterer den voksne befolkning. Naviger derefter til visning, klik på gatinghierarki, og kontroller, at fluorescerende porte er korrekt angivet under porten til voksne indbyggere.På tidspunktet for flyvning versus rød prikplot skal du oprette porte omkring områderne med høj og lav rød værdi for at fremhæve de interessante regioner, der viser mikrobiomkolonisering hos voksne orme. Når indstillingerne er optimeret, skal du fortsætte til filen og klikke på Gem eksperiment, derefter klikke på Filer og vælge Gem eksempel. For at fylde opsamlingsapparatet skal du vælge lastplade A for at lade opsamlingstrinnet bevæge sig i en position, der er klar til ilægning af enten et opsamlingsrør eller en 96-brøndplade.For dispensering til en 96 brøndplade skal du gå til opsætningsafsnittet og vælge plader, derefter klikke på kalibrerede plader og vælge 96 brøndplade. Vælg derefter de brønde, som ormene skal sorteres til, og indtast antallet af objekter, der skal sorteres i hver brønd. Sørg også for at angive de lukkede områder af interesse.Hvis der er flere lukkede områder, der sorteres i samme plade, skal du sørge for at markere afkrydsningsfeltet port hver brønd. Klik på OK for at gemme ændringerne. Når du har sorteret numre og tildelt placeringerne, skal du lægge prøven på prøveporten og klikke på påfyldningspladeknapperne fra dialogboksen Hent og dispenser for at starte dispensering i en 96-brøndplade.Højere forlængelses- og flyvetidsværdier observeres hos voksne sammenlignet med larver. Afkom fra to dage gamle voksne blev domineret af L1 og L2 stadier, mens de fleste afkom fra tre dage gamle voksne nåede L3 og L4 stadier. Når den blev dyrket på E. coli, steg flyvetiden og forlængelsesværdierne på dag tre sammenlignet med dag to.Når de blev dyrket på ochrobactrum, BH tre og blandede kulturer, viste cenor abdidas allegands forskelle i flyvetid og forlængelsesværdier. Øget ochrobactrum BH3 kolonisering blev observeret i blandet tilstand end i ochrobactrum BH3 alene. I modsætning hertil indikerede grønne, fluorescerende værdier lavere OP50-kolonisering i blandet tilstand end i OP50 alene.Ormene er stærkt skæve mod Y-aksen, hvilket tyder på, at OP50-koloniseringen er lav i de fleste orme, mens niveauerne af ochrobactrum, BH3-kolonisering er jævnt fordelt i befolkningen. Forholdet mellem ochrobactrum, BH3 koloniseringsniveauer og værtsudvikling såsom kropstæthed og forskellene i reproduktionsmønstre blev også observeret. De tre dage gamle voksne dyrket på to-medlemsblandingen, mikrobiom udviste en bred vifte af RFP-intensitet, hvilket indikerer individuelle variationer i ochrobactrum-kolonisering inden for gruppen.RFP-billeder af brøndene, der indeholder 15 sorterede og individuelle orme fra høje og lave RFP-porte, vises. Det vigtigste er at huske at bruge passende kontroller til alle trin for at sikre, at protokollen og maskinen fungerer korrekt. I realtid kan dyr med specifikke træk bruges til at isolere stammer fra værts- eller mikrobielle mutantpuljer for at identificere gener, der regulerer interaktioner efter mikrobe.Isolerede dyr kan også bruges til enkeltdyr eller berigede fænotypiske poolbaserede downstream-analyser, som RNA-seq eller lignende. Virkelig, mulighederne er virkelig uendelige.

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Udvinding og Analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrkning af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kvantificering af Lipid overflod og evaluering af Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans af Nilen rød og olie røde O farvning

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensning og analyse af Caenorhabditis elegans Ekstracellulære Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Brug caenorhabditis elegans til skærmen for vævsspecifikke chaperone interaktioner

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisering af aggregeret kvantificering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Isolering og karakterisering af den naturlige mikrobiota af modellen Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Super-Resolution Microscopy of the Synaptonemal Complex Within the Caenorhabditis elegans Germline

Superopløsningsmikroskopi af det synaptonemale kompleks inden for Caenorhabditis elegans Germline

During meiosis, homologous chromosomes must recognize and adhere to one another to allow for their correct segregation. One of the key events that secures ...